Name: בדיקת תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי טיפתי לזיהוי וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו במחקרי שפיכה ביולוגית של דמעות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: למדו פרוטוקול ddPCR לזיהוי וקוונטיפיקציה של וקטורים נגיפיים AAV בדמעות אנושיות. שיטה זו מספקת מסגרת אמינה למחקרים רגולטוריים בתחום הטיפול הגני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לניק ראסל וברנדון מקייטן מ-Bio-Rad על הדיונים המועילים שלהם במהלך פיתוח שיטה זו.

כימות וקטורים נגיפיים בדמעות באמצעות ddPCR למחקרי ביושפדינג

<ol><li>Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+%27gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Law+and+the+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Is it 'gene therapy.</a> Journal of Law and the Biosciences. 5 (3), 786-793 (2018).</li>
<li>Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+clinical+trials+worldwide+to+2017%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015(2018).</li>
<li>Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vector+systems+for+gene+therapy%3A+a+comprehensive+literature+review+of+progress+and+biosafety+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biosafety%22%5BJournal%5D)">Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges.</a> Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).</li>
<li>Gene, Cell, & RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene & Cell Therapy. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx">https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx</a> (2022).</li>
<li>Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products">https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products</a> (2022).</li>
<li>Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+advances%3A+a+meta-analysis+of+AAV+usage+in+clinical+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings.</a> Frontiers in Medicine. 8, 809118(2022).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases%22%5BJournal%5D)">Viral vectors in gene therapy.</a> Diseases. 6 (2), 42(2018).</li>
<li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+as+a+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31, 317-334 (2017).</li>
<li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+%28AAV2-hRPE65v2%29+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy%3A+a+randomized%2C+controlled%2C+open-label%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li>
<li>Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug</a> (2020).</li>
<li>Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products</a> (2020).</li>
<li>Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during</a> (2020).</li>
<li>Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy</a> (2016).</li>
<li>Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy">https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy</a> (2023).</li>
<li>Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders</a> (2020).</li>
<li>Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products</a> (2015).</li>
<li>Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf">https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf</a> (2018).</li>
<li>Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((white+paper+on+recent+issues+in+bioanalysis%3A+mass+spec+of+proteins%2C+extracellular+vesicles%2C+CRISPR%2C+chiral+assays%2C+oligos%3B+nanomedicines+bioanalysis%3B+ICH+M10+section+7.1%3B+non-liquid+%26+rare+matrices%3B+regulatory+inputs+%28part+1A+-+recommendations+on+endogenous+compounds%2C+small+molecules%2C+complex+methods%2C+regulated+mass+spec+of+large+molecules%2C+small+molecule%2C+PoC+%26+part+1B+-+regulatory+agencies%27+inputs+on+bioanalysis%2C+biomarkers%2C+immunogenicity%2C+gene+%26+cell+therapy+and+vaccine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid & rare matrices; regulatory inputs (part 1A - recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC & part 1B - regulatory agencies' inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene & cell therapy and vaccine).</a> Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).</li>
<li>Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+in+qPCR+and+qPCR+validation+in+regulated+bio+analytical+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories.</a> The AAPS Journal. 24 (2), 36(2022).</li>
<li>Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCR+and+qRT-PCR+analysis%3A+Regulatory+points+to+consider+when+conducting+biodistribution+and+vector+shedding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).</li>
<li>Wissel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+on+qPCR%2FddPCR+assay+validation+by+GCC%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC.</a> Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).</li>
<li>Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf">https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf</a> (2018).</li>
<li>Pinheiro, L., Emslie, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+concepts+and+validation+of+digital+PCR+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic concepts and validation of digital PCR measurements.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).</li>
<li>Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+counting+statistics+in+digital+PCR%3A+I+measured+two+target+copies-what+does+it+mean%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).</li>
<li>Prantner, A., Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+concentration%2C+characterization%2C+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18, 0280242(2023).</li>
<li>Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2023).</li>
<li>Koressaar, T., Remm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancements+and+modifications+of+primer+design+program+Primer+3%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Enhancements and modifications of primer design program Primer 3.</a> Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2023).</li>
<li>Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dPCR%3A+A+technology+review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">dPCR: A technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271(2018).</li>
<li>Basu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+assays+part+I%3A+portioning+statistics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technology%22%5BJournal%5D)">Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid%3A+from+sampling+to+preanalytical+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing.</a> Scientific Reports. 11, 10064(2021).</li>
<li>Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+AAV+vector+genomes+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR.</a> Genes. 12 (4), 601(2021).</li>
<li>Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+and+accurate+method+for+quantifying+vector+genomes+of+recombinant+adeno-associated+viruses+in+crude+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+TherapyMethods%22%5BJournal%5D)">A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate.</a> Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).</li>
<li>Bennett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stability+as+a+determinant+of+AAV+serotype+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).</li>
</ol>

כל המחברים הם עובדים של KCAS Bioanalytical and Biomarker Services, ארגון מחקר קבלני המספק שירותי פיתוח מקיפים התואמים ל-Good Laboratory Practices/Good Clinical Practices החל מתמיכה בגילוי מוקדם ועד לרישום מוצרים, כולל תמיכה בבדיקות מבוססות AAV, כמתואר בפרוטוקול זה. KCAS מימנה פרויקט זה ופרסום פרוטוקול זה. אמנם אין הנחיות עדכניות של ה- FDA לתכנון ותיקוף של הניסויים המוצגים במאמר זה, אך המומחים ומובילי הדעה המפתחים מחקרים כאלה ב- KCAS אימצו גישה זו כגישה הבסיסית. קריטריונים ופרמטרים נוספים נדונים על בסיס פרויקט אחר פרויקט ועשויים להיכלל על בסיס השימוש המיועד.

ישנם מספר שלבים של פרוטוקול ddPCR שהם קריטיים לביצועים נאותים של הבדיקה. השלב הקריטי הראשון הוא תכנון ואופטימיזציה של פריימרים ובדיקה. באופן כללי, מומלץ להשתמש בכימיה מבוססת בדיקת הידרוליזה על פני כימיה מבוססת צבע (למשל, SYBR Green) בסביבה פרה-קלינית או קלינית בשל הספציפיות הגבוהה שלהם. בנוסף, בחירת יעד ההגברה היא קריטית. בדרך כלל, טרנסגן העניין של הווקטור ממוקד. עם זאת, בשלבים פרה-קליניים מוקדמים יותר או בווקטורים שבהם ייתכן שלא ניתן להבחין בין טרנסגן וקטורי לעומת דנ"א גנומי, ייתכן שיהיה נכון להשתמש במטרות וקטוריות סטנדרטיות. לדוגמה, ניתן לכוון לאזור החוזר הטרמינלי ההפוך, למקדם, לזנב פולי-A, או לצמתים הבין-מקטעים בין רכיבים וקטוריים אלה. בחירת המטרה תשתנה בהתאם לתכנון הווקטורי. פריימר qPCR מסורתי ואסטרטגיות תכנון בדיקה ותוכנה מתאימים בדרך כלל ל- ddPCR. יש לבחור פרמטרים של תכנון שצפויים להניב טמפרטורת חישול עקבית (לדוגמה, 60°C) כדי להפחית את כמות המיטוב הנדרשת. כמו כן, הומלץ לתכנן, להזמין ולהעריך לפחות שלוש קבוצות שונות עבור כל מטרה. לאחר מכן יש לבחור את הקבוצה שמראה את הספציפיות הגדולה ביותר (ללא הגברה בבאר הבקרה השלילית או במטריצה של דנ"א מטרה קשור) ואת הרגישות (כלומר, גבול הזיהוי)20.
אם יש יתרון ביכולת להעביר את הבדיקה בין qPCR ל- ddPCR, מומלץ לייעל תחילה את תנאי הבדיקה באמצעות qPCR, ולזהות תנאים לקבוצה שנבחרה המביאים ליעילות הגברה של 90%-110% עם R2 ≥ 0.98. עם זאת, ddPCR כשיטת נקודת קצה היא בדרך כלל פחות רגישה מאשר qPCR בשל שונות ביעילות הגברה. לכל הפחות, מומלץ להפעיל שיפוע טמפרטורה תרמי בשלב החישול/הרחבה כדי לכסות טמפרטורות מעל ומתחת לטמפרטורות החישול הצפויות ולהעריך את הפרדת משרעת הגשם והפלורסנט בין צבירי הטיפות השליליות והחיוביות כפונקציה של טמפרטורה. אם סביבת העבודה מאפשרת, מומלץ שיהיו תחנות עבודה ייעודיות נפרדות להכנת מיקס אב, הוספת תבנית והגברה. במידת האפשר, יש להפריד אותם פיזית על ידי זרימת עבודה חד-כיוונית עם בקרות הנדסיות מובנות, כגון גישה מבוקרת ולחצי אוויר דיפרנציאליים, כדי להפחית את הסיכון לזיהום צולב ולתוצאות חיוביות שגויות. אם הדבר אינו אפשרי, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע זיהום צולב.
ישנם שני שלבים בפרוטוקול זה שעשויים להיראות יוצאי דופן למי שרגיל יותר לפיתוח בדיקת qPCR. הראשון הוא הכללת אנזים הגבלה בתמהיל המאסטר PCR. במהלך הגברה ddPCR, כל טיפה עוברת מחזור תרמי לנקודת הקצה. בבדיקה ממוטבת כראוי, התוצאה היא שתי אוכלוסיות של טיפות, קבוצה אחת מציגה רמה גבוהה באופן עקבי של אותות פלואורסצנטיים - החיוביים - וקבוצה אחרת מציגה באופן עקבי רמה נמוכה של אות פלואורסצנטי - השליליים. אם מתרחשת הפרעה ל-PCR, היא עלולה לבטל את הסנכרון של התחלת הגברה של PCR, וכתוצאה מכך הטיפה לא תגיע לרמת הגברה, ולכן נקודות קצה פלואורסצנטיות לא עקביות. במקרה זה, הטיפות יפוזרו בין השליליות לחיוביות, וכתוצאה מכך נוצרת תופעה הנקראת גשם ddPCR. זה יכול לגרום לכימות לא מדויק של היעד וליישום לא עקבי וסובייקטיבי של ערכי סף. המלצתנו לקבוע את הסף מעט מעל האות של NTC, מה שאמור למזער את השפעות הגשם בכימות הסופי מכיוון שכל הטיפות עדיין נחשבות חיוביות, גם אם לא מחזוריות לחלוטין לנקודת הקצה. ל-AAV יש מבנה משני מורכב ביותר, אשר בהתאם ליעד ההגברה, עלול להפחית את הנגישות לפריימרים ולבדיקות, וכתוצאה מכך הפרעות PCR ולכן גשם. הכללת אנזים ההגבלה בתערובת האב חותכת את המבנה המשני הזה כדי להגדיל את הגישה של הפריימרים והגשושיות, ומפחיתה את הגשם, מה שעשוי לשפר בכך את דיוק הבדיקה. ההשפעות של הכללת אנזים הגבלה בתגובת ddPCR תוארו בעבר25,32. ניתן להשתמש בכל אנזים הגבלה, כל עוד הוא מאושר שאינו חותך באזור הגברת המטרה. אין צורך בשלבי עיכול מקדים או בהרכבי חיץ חלופיים.
השלב החריג השני הוא הכנת דגימת הדמעות המכילה AAV. בפרוטוקול זה נעשה שימוש ביחס של 1:10 (או יותר) של דמעות ולאחר מכן הדגימה חומה. בדרך כלל, כאשר דמעות נאספות באמצעות צינור נימי, שהוא שיטת איסוף נפוצה, בממוצע כ 10.0 μL ניתן לאסוף33. הדילול מסייע לטפל בנפח הדגימה המוגבל ולספק מספיק חומר לבדיקת בארות כפולות. בעוד שזה מפחית את הגבול התיאורטי של זיהוי, הרגישות החזקה של ddPCR עדיין צריכה לגרום לזיהוי של כל למעט מספר קטן מאוד של חלקיקים וקטוריים. גישה זו גם יוצרת "גיבוי" היטב אם אחד מהם היה נכשל באופן בלתי צפוי. במקרה זה, או במקרים של נפח דגימה לא מספיק כדי להפעיל שתי בארות, שגיאת פואסון יכולה לשמש להערכת דיוק. יתר על כן, במקרים בהם הריכוז הוא מתחת לגבול הגילוי, זה יוצר הזדמנות למזג נתוני באר כדי לקבוע ריכוז. יש צורך לשחרר את וקטורי AAV מן capsids ויראלי עבור זיהוי ddPCR. כמה שיטות לכימות של AAV כללו שלב עיכול פרוטאינאז K כדי להסיר את הקפסיד הנגיפי34,35,36. לכל הסרוטיפים הטבעיים של AAV יש טמפרטורות התכה של כ -90 מעלות צלזיוס או פחות, כאשר רובם נופלים מתחת ל -80 מעלות צלזיוס; לכן, נראה שמדובר בהכללה מיותרת37. נראה כי חימום לבדו מספיק כדי לשחרר דנ"א וקטורי.
יתר על כן, ddPCR הוא בדרך כלל פחות רגיש מעכבי PCR שעשויים להיות נוכחים במדגם שעשוי להשפיע על בדיקת qPCR. אם שלב בידוד DNA ספציפי נכלל, זה ידרוש גם אימות ספציפי, אשר נמנע בפרוטוקול זה. הדגימות מדוללות לפני החימום עקב קינטיקה של דיפוזיה של הגנום הווקטורי בנוזל. במהלך תהליך החימום והקירור שלאחר מכן, גדילי החישה החיוביים והשליליים של גנום הדנ"א החד-גדילי יכולים להתלכד יחד וליצור מתווך דו-גדילי אם הריכוזים גבוהים מספיק. דילול לפני חימום מפחית את הריכוזים והופך את זה לבלתי סביר מבחינה מתמטית שמספיק מתווכים דו-גדיליים נוצרים כדי להשפיע לרעה על דיוק הכימות. יש לציין כי אסור שמקטעי DNA סינתטיים או פלסמידים ליניאריים המשמשים כבקרות איכות יעברו שלב חימום זה. מכיוון שמדובר בדו-גדילי, חימום יגרום להמרה למתווכים חד-גדיליים. לאחר חלוקה עצמאית של QC חד-גדילי אלה לטיפות, הדבר צפוי לגרום לעלייה כפולה בריכוז ה-QC ביחס לריכוז הנומינלי. לחלופין, אם רוצים לחמם QCs כדי לתקנן את השיטה, יש לקחת זאת בחשבון בבנייה מחדש ובהקצאה של ריכוז נומינלי.
לבסוף, בנוגע להכנת דגימות, פרוטוקולים רבים ממליצים גם על הכללת שלב טיפול DNase כדי להסיר כל DNA וקטורי לא קפסול. שלב זה הוא קריטי במקרים בהם לא רצוי לכמת DNA חופשי הקשור להכנת הווקטור (כגון במהלך כימות למטרות מינון). עם זאת, בהקשר של התפלגות ביולוגית ומחקרי ביו-שפיכה, בדרך כלל רוצים לדעת לאן עבר דנ"א וקטורי כלשהו, ללא קשר אם הוא עטוף או לא. לכן, מומלץ בדרך כלל לא לבצע שלב טיפול DNase במהלך מחקרים כאלה. אם נקבע כי יש צורך לכלול שלב DNase, שלב זה צריך להיות לפני דילול וחימום.
במאמר זה מוצגים נתונים המייצגים את הגישה להערכת הטווח הדינמי, הרגישות, הדיוק והדיוק של השיטה בהקשר של אימות מתאים למטרה ותואם לשיטות מעבדה טובות. היעדר ההנחיות הנוכחיות בנושא זה מותיר את מעבדות התיקוף לקבוע לעצמן קריטריונים לבדיקת יעדים, בהתאם לחשיבה הנוכחית בתעשייה. קבוצות שונות הציבו קריטריוני יעד גבוהים ונמוכים יותר מאלה ששימשו במחקר זה: 19,20,21,22,23,24,25. יש לבחור את קריטריוני בדיקת היעד, עד להגדרתם הנוקשה יותר, לפני התיקוף בהתבסס על היישומים הקליניים המיועדים של השיטה. בהתאם להחלטות במורד הזרם שיש לקבל על בסיס הנתונים, ייתכן שיהיה צורך ברמות גבוהות יותר של דיוק ודיוק. לעומת זאת, תוצאה חיובית לעומת שלילית פשוטה עשויה להספיק.
הגישה התייחסה גם להמלצות להערכת ספציפיות ואפקט מטריצה. שלולית של דמעות שנאספו מאנשים שלא טופלו לא הניבה תוצאה חיובית בבדיקה זו, בעוד שניתן היה לזהות את המטרה כאשר הווקטור נדקר לתוך הדמעות בריכוז גבוה ונמוך במסגרת שיעורי ההחלמה המומלצים. באופן אידיאלי, מטריצה המכילה וקטור אנדוגני (למשל, שנאספה בעקבות טיפול בווקטור נגיפי) תיכלל גם היא בהערכות אלה. עם זאת, אין זה סביר כי דגימות כאלה יהיו זמינות לשימוש בתיקוף. כדי להגביר את החוסן של התיקוף, ניתן להעריך בריכות מרובות של דמעות, או דמעות שנאספו ממגוון אנשים, כדי לקבוע אם מתרחש אפקט מטריצה ספציפי למטופל. לבסוף, מומלץ להעריך את היציבות. בתהליכי עבודה שבהם מיצוי דנ"א מתרחש מתוך המטריצה הביולוגית, ייתכן שיהיה צורך להעריך את יציבות הדגימה והדנ"א שחולץ. בתהליך עבודה זה, הדגימה נבדקת ישירות בבדיקה ללא צורך במיצוי DNA. לכן, בהתחשב בהערכת היציבות של שיטה זו, יש להעריך את יציבות דגימות הדמעות. בדרך כלל, מומלץ לבצע הערכות ספסל, מקרר, הקפאה/הפשרה ויציבות לטווח ארוך. אלה לא בוצעו במסגרת מחקר זה, אך ניתן להשתמש בשיטות שפותחו כאן בהערכה זו, לאחר מניפולציות לדגימות הקלט.
בסך הכל, שיטה זו הוכחה כבדיקה חזקה, חוזרת וניתנת לאימות לזיהוי וקטורים מבוססי AAV בדגימות דמעות. הוא עשוי לשמש כפלטפורמה להתאמה לווקטורים ספציפיים לתמיכה בניסויים קליניים ומספק בסיס לאימות של בדיקה העולה בקנה אחד עם שיטות מעבדה טובות.

הגדרות הטיפול הגנטי משתנות, אך בדרך כלל גורמות להחלפה קבועה מכוונת ולעתים קרובות צפויה של רצף דנ"א ספציפי של הגנום התאי כדי לשנות או לשנות את הביטוי של גן או לשנות את התכונות הביולוגיות של תא חי למטרה קלינית 1,2. וקטורים נגיפיים משמשים יותר ויותר ככלי לריפוי גנטי בשל יעילות ההתמרה שלהם, כאשר דו"ח אחד מציע כי מעל 70% מהניסויים הקליניים הנוכחיים בריפוי גנטי משתמשים בווקטורים נגיפיים3. העניין בווקטורים נגיפיים לריפוי גנטי הולך וצובר תאוצה. דו"ח הנתונים הרבעוני לרבעון 4 לשנת 2022 על נוף הטיפול בגנים, תאים ורנ"א של האגודה האמריקאית לתרפיה גנטית ותאית דיווח כי בשנת 2022, צנרת הטיפול בגנים, תאים ורנ"א מפרה-קליני לרישום מוקדם גדלה ב-7%, מה שמביא את המספר הכולל של טיפולים בפיתוח ל-3,726, מתוכם 2,053 (55%) טיפולים גנטיים4. מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) אישר כיום 27 טיפולים תאיים וגנטיים לשימוש קליני בבני אדם, חמישה מהם משתמשים באופן ספציפי בווקטורים נגיפיים5.
וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) זכו להתעניינות ספציפית ככלי לריפוי גנטי. מטא-אנליזה שנערכה לאחרונה חשפה כי בשני העשורים האחרונים נערכו כ-136 ניסויים קליניים שחקרו את השימוש ב-AAVs6. בנוסף, שלושה מתוך חמשת הטיפולים הגנטיים שאושרו על ידי ה- FDA בארה"ב מבוססים על AAV. זאת בשל אופיים הניתן לעריכה ברמה גבוהה, טווח מארחים רחב שניתן לכוונן על בסיס שימוש בווקטורים ספציפיים המתרחשים באופן טבעי או מהונדסים באופן מלאכותי, פתוגניות נמוכה ורעילות בבני אדם, ואימונוגניות נמוכה בדרך כלל 7,8. AAVs שימשו בהצלחה גם לטיפול במחלות עיניים במסגרת קלינית מאושרת. Voretigene neparvovec-rzyl הוא טיפול מבוסס AAV2 שאושר על ידי ה- FDA האמריקאי בשנת 2017 ועל ידי סוכנות התרופות האירופית (EMA) בשנת 2018 לטיפול בניוון רשתית9 הקשור למוטציה ביאלית RPE65.
עם העניין הגובר בפיתוח טיפולים מבוססי AAV מגיע הצורך בהדרכה רגולטורית על בדיקות. זיהוי וכימות מדויקים של כל וקטור נגיפי הוא חלק בלתי נפרד משלבי הגילוי, הייצור והבדיקות הפרה-קליניות/קליניות של פיתוח המוצר. ה- FDA בארה"ב החל לפרסם כמה הנחיות לטיפולים גנטיים, כולל על הכימיה, הייצור והבקרה של ריפוי גנטי אנושי יישומי תרופות חדשות ניסיוניות 10, מעקב ארוך טווח לאחר מתן טיפול גנטי11, בדיקות רטרו-וירוס כשירות שכפול 12, והמלצות לווקטורים מיקרוביאליים המשמשים בטיפולים גנטיים 13. ה- EMA פרסם גם שורה של הנחיות הנוגעות לפיתוח מוצרי ריפוי גנטי שבדרך כלל מתיישרים עם המלצות ה- FDA, אם כי קיימים כמה הבדלים14. חשוב לציין כי בעוד שהנחיות אלה אינן קובעות אחריות הניתנת לאכיפה משפטית, למעט כאשר יש התייחסות לתקנות ספציפיות, הן מספקות בהירות לגבי החשיבה הנוכחית של רשויות רגולטוריות בנושא וציפיותיהן לבדיקות הנדרשות להגשת תרופות ואישור רגולטורי.
ה- FDA ממליץ באופן ספציפי כי יש לערוך מחקרים כדי להעריך את ההתפלגות, ההתמדה והפינוי של וקטור מאתר מתן כדי להתמקד ברקמות עיניים ולא עיניות, נוזלים תוך עיניים ודם15. אלה לובשים צורה של הפצה ביולוגית ומחקרי שפיכה. מחקרי הפצה ביולוגית מעריכים חשיפה על ידי חקירת האופן שבו מוצר מתפשט בכל גופו של המטופל מאתר הנטילה. שפיכה מעריכה באופן ספציפי את שחרור המוצר מהמטופל לסביבה ומעלה את האפשרות להעברת הווקטור לאנשים לא מטופלים16. ה-FDA ממליץ על תכנון מחקרי הפצה ביולוגית ושפיכה ביחס לתדירות איסוף הדגימות, משך איסוף הדגימות, סוגי הדגימות שנאספו ותנאי האחסון.
בנוסף, ה- FDA ממליץ על שימוש בתגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR, או PCR בזמן אמת) לזיהוי כמותי של גנומים וקטוריים בשל קלות הביצועים שלה, פורמט תפוקה גבוהה, זמני אספקה מהירים ורגישות לבדיקה. עם זאת, קיים מחסור יחסי בהמלצות לתכנון והערכת ביצועים של שיטות מולקולריות בהשוואה לאלה הקיימות עבור מולקולות קטנות וגדולות. רבות מההנחיות למחקרים כאלה קשות ליישום על שיטות מולקולריות בשל העיצוב הייחודי והמורכב הן של המוצרים והן של הבדיקות עצמן, מה שמעלה שאלות לגבי נאותות הפלטפורמות הזמינות להערכות המומלצות והשיטות המתאימות לאימות הבדיקה. עד כה, ה- FDA לא דרש אימות רשמי של בדיקות מבוססות PCR, אם כי EMA הטיל דרישה זו17. לאור חלל זה, קבוצות וסדנאות שונות פרסמו סקירות טכניות והמלצות שיצרנים וארגוני מחקר קבלניים ביקשו לעקוב אחריהם18,19,20,21,22,23,24,25. רוב ההמלצות הללו נכתבות במיוחד תוך התחשבות במבחני qPCR, עם הצעות או שינויים לפלטפורמות מתפתחות, כגון PCR דיגיטלי טיפתי (ddPCR), הכלולות רק כרלוונטיות. המלצות עדכניות יותר התמקדו בשיקולים של בדיקות ddPCR, אך התמקדו בעיקר ביישומן לכימות גנום וקטורי בסביבת ייצור ולא במטריצות ביולוגיות מורכבות בהן נתקלים במחקרי ביושפידינג.
בהתאם ליישום קליני ומטרות, ddPCR עשוי להיות מועדף על פני qPCR לתמיכה במחקרי הפצה ביולוגית ונשירה בשל הרגישות המוגברת של ddPCR ויכולתו להתמודד עם הפרעות מטריצה בהשוואה ל- qPCR. יתר על כן, בשל חלוקת הדגימות לכ-20,000 טיפות, ניתן להשיג כימות מדויק של מספר ההעתקה ללא שימוש בעקומה סטנדרטית באמצעות סטטיסטיקת פואסון, דבר המפשט את פיתוח השיטה ותיקוףה. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר גישה סטנדרטית לפיתוח ותיקוף של שיטה מבוססת ddPCR לזיהוי וקטורי AAV בדמעות שנאספו מפני השטח של העין לתמיכה במחקרים קליניים של נשירה ביולוגית.

<table><tbody><tr><td>AAV-eGFP וקטור</td><td>מעבדות צ'ארלס ריבר</td><td>RS-AAV2-FL</td><td>לוט AAV2-0720-FL, משמש כווקטור הוכחה לעיקרון</td></tr><tr><td>AutoDG Droplet מערכת PCR דיגיטלית</td><td>Bio-Rad</td><td>QX200</td><td>ניתן להשתמש במערכת ddPCR חלופית בהתאם ליצרן s פרוטוקול.</td></tr><tr><td>שמן AutoDG לבדיקות</td><td>Bio-Rad</td><td>1864110</td><td>או השתמש בחומר התואם למערכת ddPCR.</td></tr><tr><td>בקרת מאגר ddPCR לבדיקות</td><td>Bio-Rad</td><td>1863052</td><td>או השתמש בחומר התואם למערכת ddPCR ולכימיה של PCR.</td></tr><tr><td>ddPCR קורא טיפות שמן</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td>או השתמש בחומר התואם למערכת ddPCR.</td></tr><tr><td>ddPCR Piercable אטמי נייר כסף</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td>או השתמש בחומר התואם למערכת ddPCR.</td></tr><tr><td>צלחות ddPCR 96 באר, חצי חצאית</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td>או השתמש בחומר התואם למערכת ddPCR.</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix לבדיקות (ללא dUTP)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863023, 1863024 או 1863025</td><td>השתמש בתערובת מאסטר התואמת לפריימרים/בדיקות ומערכת ddPCR.</td></tr><tr><td>DG32 AutoDG Cartidges</td><td>Bio-Rad</td><td>1864108</td><td>או השתמש בחומר התואם למערכת ddPCR.</td></tr><tr>ניתן להשתמש במערכת ddPCR חלופית <td>של Droplet Reader</td><td>Bio-Rad</td><td>QX200</td><td>בהתאם ליצרן s פרוטוקול.</td></tr><tr><td>GeneAmp PCR מאגר</td><td>מיושם ביו-מערכות</td><td>N8080129</td><td>N / A</td></tr><tr><td>אמביון</td><td>מים ללא נוקלאז</td><td>AM9906</td><td>N / A</td></tr><tr><td>PCR אוטם צלחת</td><td>Bio-Rad</td><td>PX1</td><td>או השתמש בחומר התואם למערכת ddPCR.</td></tr><tr><td>טיפים ל-AutoDG</td><td>Bio-Rad</td><td>1864120</td><td>או השתמש בחומר התואם למערכת ddPCR.</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 פעילי שטח לא יוניים</td><td>Gibco</td><td>24040</td><td>N/A</td></tr><tr><td>פריימר ובדיקות הידרוליזה עיצובים</td><td>שונים</td><td></td><td>המבוססים על רצף מטרה תוך שימוש בגישות כלליות לתכנון פריימר/בדיקה. בחר פלואורפורים ומרווה התואמים למערכת ddPCR.</td></tr><tr><td>אנזים הגבלה</td><td></td><td></td><td>משתנה שונים עם רצף הגברת מטרה. השתמש באנזים הגבלה שאינו חותך ברצף המוגבר</td></tr><tr><td>זרע סלמון גזוז DNA ThermoFisher</td><td></td><td>AM9680</td><td>N/A</td></tr><tr><td>שבר גן DNA סינתטי או פלסמיד ליניארי</td><td>שונים עיצוב שבר DNA סינתטי המכיל את אזור הגברת היעד לשימוש כבקרת איכות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Teknova</td><td>T0224</td><td>ודא שהוא מוכן או רוכש ללא נוקלאז. 10 מ"מ Tris-HCl, 1.0 מ"מ EDTA, pH=8.0</td></tr><tr><td>מגע Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000</td><td>או השתמש בחומר התואם למערכת ddPCR.</td></tr></tbody></table>

בדיקת תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי טיפתי לזיהוי וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו במחקרי שפיכה ביולוגית של דמעות

A Validatable Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Adeno-Associated Viral Vectors in Bioshedding Studies of Tears

השימוש בווקטורים נגיפיים לטיפול במחלות גנטיות גדל משמעותית בשנים האחרונות, עם למעלה מ-2,000 מחקרים שנרשמו עד כה. וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAV) מצאו הצלחה מיוחדת בטיפול במחלות הקשורות לעיניים, כפי שהודגם באישור של voretigene neparvovec-rzyl. כדי להביא טיפולים חדשים לשוק, סוכנויות רגולטוריות בדרך כלל מבקשות מחקרי ביושפידינג מוסמכים או מתוקפים כדי להעריך את שחרור הווקטור לסביבה. עם זאת, לא פורסמו הנחיות רשמיות לפיתוח בדיקות מבוססות מולקולרית לתמיכה במחקרי נשירה כאלה על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי, מה שמשאיר את המפתחים לקבוע שיטות עבודה מומלצות עבור עצמם. מטרת פרוטוקול זה היא להציג פרוטוקול תקף לזיהוי וקטורי AAV בדמעות אנושיות על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית (ddPCR) לתמיכה במחקרי ביושפיכה קליניים. כתב יד זה דן בגישות הנוכחיות בתעשייה לאימות בדיקות מולקולריות ומדגים כי השיטה חורגת מקריטריוני הקבלה של מבחני היעד המוצעים כיום בסקירות טכניות. לבסוף, צעדים קריטיים בביצועים של כל מבחן ddPCR, ללא קשר ליישום, נדונים.

למטרות הדגמה, פותחה בדיקה שנועדה לזהות וקטור AAV2 בעל חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP), עם מקטע DNA סינתטי דו-גדילי המכיל eGFP כבקרת איכות. נכון לעכשיו, יש ויכוח מתמשך האם הווקטור עצמו או מקטע DNA סינתטי או פלסמיד ליניארי הוא המתאים ביותר לשימוש כמו QC. באופן כללי, ניתן להשתמש במקטע DNA סינתטי או פלסמיד ליניארי אם מודגמת שקילות לווקטור בפיתוח השיטה (הנתונים אינם מוצגים). פריימרים וגשושיות תוכננו ועברו אופטימיזציה לזיהוי טרנסגן eGFP. עיין בטבלה משלימה S1 עבור הרצפים המשמשים בעבודה זו. ריכוז מלאי שברי QC נקבע אמפירית באמצעות ddPCR. כל הבדיקות בוצעו תוך שימוש בריכוזים ובתנאי PCR שניתנו כדוגמאות בסעיף הפרוטוקול.
עבור בדיקות qPCR, מומלץ להעריך את הלינאריות, הרגישות, הטווח הדינמי, הדיוק והדיוק של העקומה הסטנדרטית. מכיוון ש- ddPCR אינו מסתמך על עקומה סטנדרטית לכימות היעד, יש לשנות המלצות אלה. במקום זאת, QCs המורכבים ממקטעי DNA סינתטיים דו-גדיליים המדוללים לריכוזים שונים כדי להתפרש על הטווח הצפוי לכימות של תגובת ddPCR בהתבסס על המידול הסטטיסטי של פואסון שימשו 29,30,31,32 כדי להגדיר את הטווח הדינמי והרגישות ולהעריך דיוק ודיוק. הבחירה בריכוזי QC התבססה בעיקר על היחס הצפוי בין טיפות חיוביות לסך כל הטיפות בתוך באר בריכוז נתון. מבחינה מתמטית, ddPCR הוא תיאורטית המדויק ביותר כאשר כ -80% מהמחיצות מגבירות באופן חיובי. ככל שהיחס החיובי לסך הטיפות עולה מעל 0.8, הדיוק יורד עקב הרוויה של המחיצות, כאשר כימות אינו אפשרי ברגע ש-100% מהטיפות חיוביות. בקצה הנמוך, תיאורטית, ניתן לזהות ולכמת טיפה חיובית אחת בלבד, אם כי הדיוק גרוע יותר והבדיקה כפופה לתוצאות חיוביות שגויות ברמה נמוכה. בדרך כלל, לפחות שלוש טיפות חייבות להיות חיוביות כדי שתוצאה תחושב בביטחון של 95%, שהוא הסף לחישוב ריכוז שבו השתמשנו כאן.
הוכנה סדרה של חמישה ריכוזי QC שונים, כאשר מספר העתק היעד / נפחי תגובת PCR μL חושבו צפויים להניב יחס חיובי לסך הטיפות המשתרע על פני הטווח הניתן לכימות של ddPCR, כפי שמוצג בטבלה 5. אלה שימשו להערכת הדיוק והדיוק של הבדיקה. בהערכה כאן, הגבולות העליונים והתחתונים של הכימות לא נדחקו למקסימום התיאורטי האפשרי ב- ddPCR. כימות מדויק עשוי להיות אפשרי ברמות גבוהות ונמוכות יותר ממה שהודגם כאן. יש לפתח את הטווח בהתאם ליישומים במורד הזרם של שיטה זו.
בסך הכל הוכנו שלוש סדרות דילול עצמאיות של QC אלה במאגר דילול דגימה עבור כל אצווה כדי להעריך את הדיוק והדיוק תוך כדי בדיקה. נכללו בארות כפולות של כל דילול QC. כדי לדמות פרוטוקול אימות בפועל, בוצעו בסך הכל שש אצוות דיוק ודיוק על ידי אנליסטים מרובים במשך מספר ימים. התוצאות משש אצוות אלה נותחו כדי להגדיר את הדיוק והדיוק של השיטה תוך המבחן וכדי להגדיר את הטווח הדינמי של הבדיקה.
הביצועים בתוך הבדיקה הוערכו עבור כל אצווה בכל רמת QC. ציפינו שבכל בארות ה-QC וה-NTC יהיו לפחות 10,000 טיפות. נתון זה הושג ב-216 מתוך 216 בארות שנבדקו בכל שש האצוות, עם ספירת טיפות ממוצעת של 19,748 טיפות לבאר (טבלה 6). לאחר מכן, %CV בין בארות של כל קבוצה של בארות כפולות של כל QC היה צפוי להיות ≤25.0%, למעט QC הגבול העליון והתחתון, שם ≤30.0% היה צפוי. זה הושג בקבוצות של 90 מתוך 90 בארות שנבדקו בכל שש האצוות עבור QC, עם %CV ממוצע בין בארות של 3.9% בכל רמות ה- QC (טבלה 7). כל ה-QC הניבו יחס טיפתי ממוצע חיובי לסך כל הטווחים הצפויים שתוארו לעיל (טבלה 6).
בתוך כל אצווה חושבו הממוצע התוך-מבחני וסטיית התקן עבור כל אחת מנקודות סדרת הדילול שהוכנו באופן עצמאי, ואלה שימשו לחישוב ממוצע תוך-בדיקה עבור כל ריכוז בכל בדיקה. זה שימש כדי להעריך את הדיוק והדיוק של הבדיקה (טבלה 8). דיוק מתייחס לשונות בנתונים מעותקים משוכפלים של אותו מדגם הומוגני בתנאי בדיקה רגילים ומוערך על ידי חישוב %CV של האליציטוטים המרובים הכלולים. ציפינו ששלושת האליציטוטים שנבדקו בכל אצווה יניבו %CV תוך בדיקה ≤25.0%, למעט QC הגבול העליון והתחתון שבו ≤30.0% היה צפוי. זה הושג עבור כל חמש רמות QC בכל אחת מ -60 קבוצות (30 מתוך 30 ביצועים בסך הכל). באופן כללי, ניתן להשיג דיוק תוך מבחני גבוה יותר מקריטריוני היעד, עם ממוצע של %CV תוך בדיקה של 7.7% בכל רמות ה- QC. דיוק מתייחס לקרבת ההסכמה בין הערך שנקבע בניסוי לבין הערך הנקוב. זה מוערך על ידי חישוב אחוז השגיאה היחסית (%RE, או %Bias) בין הריכוזים המחושבים של כל QC לבין הריכוזים הנומינליים הצפויים באופן תיאורטי. היה צפוי כי הממוצע תוך המבחן של שלושת aliquots יהיה ±25.0% RE של הריכוז הנומינלי, למעט QC הגבול העליון והתחתון שבו ±30.0% היה צפוי. זה הושג עבור כל חמש רמות QC בכל אחת מ -60 קבוצות (30 מתוך 30 ביצועים בסך הכל). באופן כללי, ניתן להשיג דיוק תוך-מבחני גדול יותר מהיעד שלנו, עם ממוצע מוחלט של %RE בתוך הבדיקה של 4.2% בכל רמות ה-QC. בכל הביצועים של NTC (30 בסך הכל), לא ניתן היה לזהות טיפות חיוביות.
דיוק ודיוק בין בדיקות חושבו גם באמצעות הממוצע תוך כדי בדיקה של כל רמת QC בתוך כל אצווה. הדיוק בין הבדיקות היה צפוי להיות ≤25.0% CV, למעט QC הגבול העליון והתחתון שבו ≤30.0% היה צפוי. כמו כן, עבור דיוק בין מבחנים, ±25.0% RE היה צפוי, למעט QC הגבול העליון והתחתון שבו ±30.0% היה צפוי. נצפו דיוק ודיוק גבוהים משמעותית ממטרות אלה (לוח 9), עם דיוק בין הבדיקות הנע בין 4.0% ל-8.5% ודיוק מוחלט בין 1.0% ל-3.2%. באופן קולקטיבי, תוצאות אלה מראות כי שיטה זו יכולה להשיג דיוק ודיוק תוך ובין-מבחנים מספיקים היטב ביעדי התעשייה הנוכחיים. טווח דינמי של בדיקה זו של 2,500-2.5 עותקים לכל מיקרוליטר של תגובת PCR יכול להיות מוגדר על סמך תוצאות אלה, עם רגישות בדיקה כוללת של 2.5 עותקים לכל μL של תגובת PCR. כאמור, ייתכן שניתן יהיה לאמת טווחים דינמיים רחבים יותר.
לאחר מכן, היה צורך להעריך את דיוק הבדיקה ואת הדיוק בתוך מטריצת היעד - במקרה זה, דמעות. בדרך כלל, בדיקות מאומתות לפני תחילת מחקרים קליניים, כלומר דמעות שנאספו מחולים שטופלו בווקטורים לא צפויות להיות זמינות למטרות תיקוף. זה יכול להיווצר באופן מלאכותי על ידי זינוק וקטור המטרה AAV לתוך דמעות שנאספו מתורמים מתנדבים כדי ליצור QCs קוצים מטריצה. דמעות אנושיות מצטברות נאספו על ידי צד שלישי (BioIVT). לצורך הוכחת עיקרון, נעשה שימוש בווקטור AAV2 המבטא eGFP שנרכש ממקור מסחרי. ריכוז מלאי וקטור AAV2 נקבע אמפירית באמצעות ddPCR, ללא שימוש בשלב בידוד DNA, כמתואר בפרוטוקול זה. בכל ריצה, ה-AAV2 הוזנק באופן עצמאי לשלושת אליציטוטי הדמעות ברמה גבוהה (צפי לתגובת PCR של 1.41 x 103 עותקים/μL) ונמוכה (תגובת PCR של 28.2 עותקים / μL PCR). aliquots unspiked נכללו כבקרה כדי להדגים את הספציפיות של השיטה.
הביצועים בתוך הבדיקה הוערכו עבור כל אצווה בכל רמת ספייק. היה צפוי שבכל דגימות הדמעות יהיו לפחות 10,000 טיפות. זה הושג ב-108 מתוך 108 בארות שנבדקו בכל שש האצוות, עם מספר טיפות כולל ממוצע של 20,208 טיפות לבאר (טבלה 10). לאחר מכן, %CV בין בארות של כל קבוצה של בארות כפולות של כל QC היה צפוי להיות ≤25.0% עבור רמות הזינוק הגבוהות והנמוכות. נתון זה הושג ב-36 מתוך 36 קבוצות של בארות שנבדקו בכל שש האצוות עבור ה-QC, עם ממוצע של %CV בין בארות של 3.2% (טבלה 11).
בתוך כל אצווה חושבו הממוצע התוך-מבחני וסטיית התקן עבור כל אחד מדוקרנים הדמעות שהוכנו באופן עצמאי, ואלה שימשו לחישוב ממוצע תוך-בדיקה עבור כל ריכוז בכל בדיקה. זה שימש כדי להעריך את הדיוק והדיוק של הבדיקה במטריצה (טבלה 12). ציפינו ש%CV תוך כדי בדיקה יהיה ≤25.0% ורמות זינוק גבוהות ונמוכות. זה הושג בשש מתוך שש קבוצות עבור כל רמה. באופן כללי, ניתן להשיג דיוק תוך-מבחני גדול יותר במטריצה מאשר היעד, עם ממוצע תוך מבחן %CV של 3.7% ברמה הגבוהה ו-12.2% ברמה הנמוכה (סה"כ 8.0%). כמו כן, היה צפוי כי %RE בתוך המבחן יהיה ±25.0% בשתי רמות הזינוק. זה הושג בשש מתוך שש קבוצות עבור כל רמה. כמו כן, נמצא באופן כללי כי ניתן להשיג דיוק תוך-מבחני גבוה יותר במטריצה מאשר היעד, עם %RE מוחלט ממוצע תוך מבחני של 8.1% ברמה הנמוכה ו-11.3% ברמה הגבוהה (סה"כ 9.7%). עבור הבקרה ללא קוצים, לא ניתן היה לזהות אות eGFP באף אחד מהאליציטוטים (טבלה 12), מה שמדגים את הספציפיות של השיטה במטריצת הדמעות האנושית.
דיוק ודיוק בין בדיקות במטריצת דמעות חושבו גם הם באמצעות הממוצע התוך-מבחני של כל רמת ספייק בתוך כל אצווה. היה צפוי שהדיוק בין הבדיקות יהיה ≤25.0% קורות חיים, ועבור דיוק בין מבחנים, ציפינו ל±25.0% RE. נצפתה רמת דיוק ודיוק גבוהה משמעותית ממטרות אלה (לוח 13), עם דיוק בין-מבחני של 5.5% ברמה הגבוהה ו-7.1% ברמה הנמוכה, ודיוק מוחלט של 11.3% ברמה הגבוהה ו-8.1% ברמה הנמוכה. יחד, תוצאות אלה מדגימות את הדיוק, הדיוק והספציפיות של השיטה במטריצת דמעות.
טבלה 5: בקרות איכות המשמשות להגדרת הטווח הדינמי של הבדיקה. קיצורים: ULQC = בקרת איכות גבול עליון; HQC = בקרת איכות גבוהה; MQC = בקרת איכות בינונית; LQC = בקרת איכות נמוכה; LLQC = בקרת איכות גבול תחתון; NTC = ללא פקד תבנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%205.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 6: ספירת טיפות כוללת ויחס חיובי לסך הטיפות של בקרת איכות DNA סינתטי דו-גדילי ו-NTC. קיצורים: ULQC = בקרת איכות גבול עליון; HQC = בקרת איכות גבוהה; MQC = בקרת איכות בינונית; LQC = בקרת איכות נמוכה; LLQC = בקרת איכות גבול תחתון; NTC = ללא פקד תבנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%206.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 7: סטטיסטיקות QC בין בארות (יעדי העתקה/תגובת PCR μL). קיצורים: ULQC = בקרת איכות גבול עליון; HQC = בקרת איכות גבוהה; MQC = בקרת איכות בינונית; LQC = בקרת איכות נמוכה; LLQC = בקרת איכות גבול תחתון; NTC = ללא פקד תבנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%207.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 8: דיוק ודיוק תוך כדי בדיקה של QC (יעדי העתקה/תגובת PCR μL). קיצורים: ULQC = בקרת איכות גבול עליון; HQC = בקרת איכות גבוהה; MQC = בקרת איכות בינונית; LQC = בקרת איכות נמוכה; LLQC = בקרת איכות גבול תחתון; NTC = ללא פקד תבנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%208.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 9: דיוק ודיוק בין בדיקות של QC (מטרות העתקה/תגובת PCR μL). קיצורים: ULQC = בקרת איכות גבול עליון; HQC = בקרת איכות גבוהה; MQC = בקרת איכות בינונית; LQC = בקרת איכות נמוכה; LLQC = בקרת איכות גבול תחתון; NTC = ללא פקד תבנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Table%209.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 10: ספירת טיפות כוללת של דגימות דמעות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2010.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 11: סטטיסטיקה בין בארות של דגימת דמעה (מטרות העתקה/תגובת PCR μL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2011.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 12: דיוק תוך בדיקה ודיוק של דגימות דמעות (מטרות העתקה/תגובת PCR μL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2012.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 13: דיוק ודיוק בין בדיקות של דגימות דמעות (מטרות העתקה/תגובת PCR μL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Table%2013.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה S1: רצפים של פריימר, בדיקות ובקרת איכות DNA סינתטי דו-גדילי שנעשה בהם שימוש במחקר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Supp.%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ותיקוף של שיטות מעבדה טובות בזיהוי תואם של וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו בדמעות אנושיות על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית לתמיכה בפיתוח קליני של וקטורים של ריפוי גנטי.

The use of viral vectors to treat genetic diseases has increased substantially in recent years, with over 2,000 studies registered to date. ...

הפרוטוקול שלנו מכמת וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו במטריצות מורכבות. זיהוי וכימות מדויקים חיוניים להערכת הביצועים שלהם בניסויים קליניים. פרוטוקול זה מבקש באופן ספציפי למלא את הפערים הרגולטוריים הנוכחיים בתכנון מחקרים מולקולריים תואמי שיטות מעבדה טובות.כחלק מפיתוח וקטורים ויראליים, רשויות רגולטוריות דורשות הערכה של נשירה ביולוגית וקטורית. ddPCR היא טכנולוגיה מבטיחה להערכה זו מכיוון שהיא מאפשרת כימות מדויק ללא שימוש בעקומה סטנדרטית ורגישות משופרת בהשוואה ל- qPCR. כימות מדויק במטריצות המורכבות בהן נתקלים במסגרות קליניות, כגון דמעות, יכול להיות מאתגר לאימות עקב הפרעות ואינהיביציה של PCR.כמויות דגימה קליניות מוגבלות יכולות גם להגביל את היכולת לזהות אירועים נדירים אם הבדיקה אינה רגישה מספיק. הגישה שלנו מפתחת מסגרת מבוססת ddPCR הניתנת לחזרה ולהתאמה כדי לאמת בדיקות לשימוש במחקרים מוסדרים. שיטה זו מונעת שלב ספציפי של מיצוי DNA, מאפשרת אימות יעיל יותר ומספקת קריטריונים ברורים שמולם ניתן להעריך את ביצועי הבדיקה כדי להבטיח עמידות וחזרתיות.לפרוטוקול זה יש פוטנציאל להיות מיושם בכל מחקר של שפיכת וקטורים ויראליים, לא רק בזיהוי AAV בדמעות, כפי שמוצג כאן. היא יוצרת מסגרת חזקה וחוזרת על עצמה שעליה ניתן לפתח מספר תוכניות מותאמות למטרה ומוסדרות.

a-validatable-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-assay-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מציג כיצד לכמת את יעילות התמרה של AAV ברשתית העכבר באמצעות PCR טיפה דיגיטלית (dd-PCR) יחד עם ייצור AAV בקנה מידה קטן, הזרקה תוך-ויטמינית, הדמיית רשתית ובידוד DNA גנומי ברשתית.

שיטת PCR טיפה דיגיטלית לכימות יעילות טרנסדוקציה AAV ב- מורין רשתית

כימות מדויק של עותקים גנומיים וקטוריים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) הוא קריטי, אך פרוטוקול סטנדרטי טרם נקבע. פרוטוקול זה מתאר שיטה מתוקפת להכנת דגימות AAV מטוהרות וביצוע תגובת שרשרת פולימראז טיפתית דיגיטלית (dd_PCR) כדי לכמת באופן אמין את טיטר הגנום הנגיפי.

כימות גנומים נגיפיים הקשורים באדנו בדגימות וקטוריות מטוהרות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז טיפתי דיגיטלי

אנו מדגימים כיצד ללמוד את ההשפעה של מוטציה נקודה אחת על התפקוד של ערוץ יון.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

PCR התפתחה טכניקה נפוצה הרבה מעבדות ביולוגיה מולקולרית. בתנאי הנה מדריך מהיר קונבנציונאלי פרוטוקולים מספר ה-PCR. כי כל תגובה היא ניסוי ייחודי, תנאים אופטימליים הנדרשים כדי לייצר מוצר להשתנות. הבנת המשתנים התגובה יהיה מאוד לשפר את יעילות לפתרון בעיות, ובכך להגדיל את הסיכוי להשיג את התוצאה הרצויה.

תגובת שרשרת פולימרז: פרוטוקול בסיסי פלוס אסטרטגיות לפתרון בעיות ואופטימיזציה

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

המטרה של הווידאו הזה היא להדגים כיצד לבצע מיצוי DNA אוטומטי מהקווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא וניתוח אגל דיגיטלי PCR (ddPCR) כדי לזהות מוטציות נדירות בסביבה קלינית. זיהוי מוטציות בדגימות FFPE מדגים את התועלת הקלינית של ddPCR בדגימות FFPE.

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

כתב יד זה פרטים של assay חשופה נקודה פשוטה עבור כימות של adeno-הקשורים וירוס (AAV) titers ויישומו ללמוד את התפקיד של הפעלת מכלול חלבונים (AAPs), שיעור הרומן של חלבונים נגיפיים שאינן מבניות נמצאו AAV כל אשר נגרמו מהזנים אליהם, בקידום ההרכבה של capsids נגזר cognate, heterologous AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם.

וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים

הפרוטוקול נועד להציג את השימוש בספקטרומטר מסה מרובע משולש לניטור תגובה מרובה (MRM) של חלבונים מדגימות קליניות. סיפקנו זרימת עבודה שיטתית החל מהכנת מדגם לניתוח נתונים עבור דגימות קליניות עם כל אמצעי הזהירות הדרושים שיש לנקוט.

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

עבודה זו מסכמת שלבים לפיתוח בדיקות שונות לזיהוי SARS-CoV-2 באמצעות מערכת ddPCR בשני צבעים. השלבים מפורטים ונכללו הערות כיצד לשפר את הבדיקות ואת ביצועי הניסוי. ניתן להשתמש בבדיקות אלה עבור יישומי SARS-CoV-2 RT-ddPCR מרובים.

פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2

פרויקט מדעי אזרחי תוכנן לגייס את תושבי סן דייגו לאסוף דגימות סביבתיות עבור SARS-CoV-2. פלטפורמה רב-לשונית מבוססת אינטרנט נוצרה לשליחת נתונים באמצעות ממשק מכשיר נייד ידידותי למשתמש. מערכת ניהול מידע במעבדה אפשרה איסוף של אלפי דגימות מגוונות גיאוגרפית עם מעקב אחר תוצאות בזמן אמת.

סניקה של הסביבה העירונית - צינור לדגימה וזיהוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים

למדו פרוטוקול ddPCR לזיהוי וקוונטיפיקציה של וקטורים נגיפיים AAV בדמעות אנושיות. שיטה זו מספקת מסגרת אמינה למחקרים רגולטוריים בתחום הטיפול הגני.

בדיקת תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי טיפתי לזיהוי וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו במחקרי שפיכה ביולוגית של דמעות

גלה סרטונים נוספים