Name: שיטה מבוססת ליפידים-למידת מכונה לאפיון וכימות משקעי שומנים באמצעות אפיתל פיגמנט רשתית שמקורו ב-iPSC (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: חקור שיטות ניתוח טיפות שומן באפיתל פיגמנט רשתית שמקורו ב-iPSC לחקר מנגנוני AMD וגילוי מטרות תרופתיות. השיטה משלבת צביעת Nile Red, BODIPY ו-APOE עם LipidUNet לאפיון כמותי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לליבת ההיסטולוגיה של המכון הלאומי לעיניים (NEI) על השימוש במערכת הקונפוקלית Zeiss. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות NEI IRP (מספר מענק ZIA EY000533-04).

מידול וניתוח ניוון הרשתית

<ol><li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899(2017).</li>
<li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li>
<li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li>
<li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li>
<li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch%27s+membrane+and+choroid%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li>
<li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li>
<li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360(2021).</li>
<li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293(2021).</li>
<li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li>
<li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+%28Y402H%29+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li>
<li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years%2C+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020%3A+the+Right+to+Sight%3A+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li>
</ol>

אין גילויים.

פרוטוקול זה מספק שיטה לתיוג, תמונה וכימות יעילים של משקעי שומנים במודלים מונוגניים ופוליגניים של מחלות מבחנה עבור מחלות עיניים ניווניות. התוכנה מבוססת הבינה המלאכותית, LipidUNet, ניתנת ליישום על שלושה סמני שומנים נפוצים, APOE, Nile Red ו-BODIPY, ומספקת שיטה מהירה ואוטומטית לניתוח המאפשרת לכמת להיות סטנדרטית ולא מוטה.
המגבלה העיקרית של LipidUNet היא העובדה שמערך נתוני האימון עבור הבינה המלאכותית הוגבל לתמונות הגדלה פי 40 של תאים בתרבית בלוח של 96 בארות. כתוצאה מסט תמונות האימון, LipidUNet, בצורתו הנוכחית, מוגבל לניתוח תמונות הגדלה פי 40. התוכנה יכולה לשמש לניתוח תמונות 40x של תאים בתרבית על משטחי תרבית אחרים מלבד צלחת 96 באר, אך יש להקפיד לבחון את מסכות הפלט שנוצרו כדי לאמת סף מדויק על ידי התוכנה. יהיה צורך בערכות תמונות נוספות (בהגדלות שונות) כדי להרחיב את טווח הדגימות/תמונות שהוא יכול לנתח.
לפרוטוקול מספר שלבים קריטיים. בשלב סמן השומנים, על המשתמש לאשר כי תרכובת הסימון שנבחרה (BODIPY, APOE, Nile Red) תייגה את הדגימה שלו ביעילות. תאי RPE בוגרים הם לעתים קרובות פיגמנטים כבדים, אשר יכולים לפגוע באות הפלואורסצנטי של נוגדנים immunostaining. כאשר האות הפלואורסצנטי חלש או כאשר יש יותר מדי כתמי רקע, LipidUNet אינו יכול להבחין בטיפות שומנים במדויק. מסיבה דומה, יש להשתמש בהגדרות רכישה שנבחרו כראוי לשלב ההדמיה האוטומטית של הפרוטוקול. אם התמונות המתקבלות הן באיכות ירודה, LipidUNet יתקשה להסוות כראוי תמונות ולכן הכימות יהיה לא מדויק (איור 6A-L). לבסוף, לאחר עיבוד של התמונות הוא צעד חשוב, כמו LipidUNet יש דרישות ספציפיות עבור התוכנה לעבוד.
בהשוואה לתהליכי עבודה לניתוח שומנים המשתמשים בסף ידני, או טכניקות הכוללות סף אוטומטי בתוכנה כמו פיג'י, LipidUNet מציעה פילוח לא מוטה ואמין על פני תמונות עם שקיעת שומנים משתנה, כפי שמשתקף בשיעור שגיאות קטן בזיהוי חלקיקי שומנים (איור 7). התוכנה מאפשרת כניסת משתמש לתמונות הדרכה נוספות, ומאפשרת ניתוח של מערכי תמונות מעבר לאלו המשתמשות ביעד הגדלה של פי 40 או אפילו כאלה המשתמשות בטוש שומנים אחר, כמפורט בפרוטוקול. בעתיד, התוכנה תהיה מאומנת לנתח תמונות 3D כך כימות של נפח הפקדת שומנים אפשרי. מחלות עיניים ניווניות הכרוכות בשקיעת שומנים כתורמת עיקרית לפתולוגיה נפוצות, והמקרים צפויים לעלות ככל שאוכלוסיית הקשישים מתרחבת13. מודלים מדויקים של מחלות וכלי ניתוח יעילים, כפי שתיארנו בפרוטוקול זה, יאפשרו פיתוח התערבויות טיפוליות חדשניות.

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבה של תאים הממוקמת בחלק האחורי של העין בסמוך לקולטני אור ברשתית. RPE ממלא תפקיד חיוני בשמירה על ראייה תקינה על ידי מתן תמיכה מטבולית ומבנית לקולטני האור. תאי RPE בריאים מאופיינים במורפולוגיה משושה מובהקת. הם מחוברים על ידי צמתים הדוקים, המאפשרים RPE לפעול כמחסום בין choriocapillaris הממוקם בצד הבסיס שלה photoreceptors הממוקם apically. כדי לשמור על המערכת האקולוגית של הרשתית, RPE מעביר מטבוליטים מרכזיים, למשל גלוקוז, לקולטני אור באופן שממזער את צריכת הגלוקוז ב-RPE1. בשל מגבלה זו, RPE תלוי במטבוליטים אחרים כדי לשמור על הצרכים המטבוליים שלהם, כולל חומצות שומן, אשר RPE ממיר לקטונים באמצעות חמצון β2. בהתחשב בנטייה של RPE להשתמש בחומצות שומן, אשר ככל הנראה ממוחזרות מעיכול מקטע חיצוני של קולטני אור (POS), כמקור אנרגיה, שינויים מזיקים במסלולי עיבוד השומנים ב- RPE מובילים לעתים קרובות, או מעורבים, הן במחלות רשתית ניווניות מונוגניות והן פוליגניות3.
ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), מחלת עיניים ניוונית פוליגנית הגורמת לניוון RPE, נקשרה גם לאוטופגיה חריגה ולמטבוליזם שומנים בחד-שכבה RPE. הכישלון של חד-שכבה RPE לא מתפקדת לעבד קופה ולבצע פונקציות קריטיות אחרות מוביל למשקעים חוץ-תאיים (תת-RPE) הנקראים משקעים ליניאריים בסיסיים (BLinD) הממוקמים בין RPE לממברנה של ברוך - סימן היכר של פתולוגיות AMD. המרכיבים העיקריים של BLinD כוללים ליפופרוטאינים, שהנפוץ שבהם הוא אפוליפופרוטאין E (APOE)4. הצטברות של שכבות דקות של BLinD יכולה להוביל לדרוסן רך, המוכר כסימפטום קליני של AMD 5,6.
מספר קבוצות הראו כי מודלים של תאי גזע שמקורם במבחנה הגורמים לתפקוד לקוי של RPE כוללים הצטברות שומנים תת-RPE 7,8,9. Hallam et al. (2017) יצרו RPE מושרה פלוריפוטנטית נגזר תאי גזע (iRPE) מחולים עם סיכון גבוה ל- AMD עקב פולימורפיזם של הגן CFH. ה- iRPE הראה הצטברות דרוסן, כפי שמסומן על ידי APOE, וה- RPE בסיכון גבוה צבר משקעים גדולים יותר מאשר iRPE שנוצר מחולים בסיכון נמוך10.
כדי ליצור מודל במבחנה המשחזר סימני היכר תאיים של AMD, כגון טיפות שומנים ושקיעת דרוסן, קווי iRPE שנוצרו מדגימות דם של מטופלים נקבעו באמצעות פרוטוקול מונחה התפתחותית11 שפורסם בעבר. ה- iRPE היו נתונים לסרום אנושי משלים (CC-HS), תמיסה המכילה אנפילטוקסינים המחקים גורם אפשרי אחד ל- AMD: איתות משלים חלופי מוגבר8. השקיעה התאית והתת-תאית של משקעי שומנים נמדדה באמצעות סמני שומנים וליפופרוטאינים נפוצים, APOE, אדום הנילוס ו-BODIPY. באמצעות סמנים אלה, הוכח כי איתות משלים פעיל באמצעות CC-HS החמיר הצטברות שומנים בתאי iRPE8.
כדי לפתח מודל מחלה למחלה ניוונית של רשתית מונוגנית, פותחו קווי iRPE מחולים עם מחלת סטארגארדט, מחלה הנגרמת על ידי מוטציות בגן ABCA4 ב- RPE. בעבר הוכח כי כאשר ABCA4 הוא דפק החוצה, A2E lipofuscin, משקעים תוך תאיים הידוע להכיל רמות גבוהות של פוספוליפידים ותוצרי חמצון שומנים תלויי אור, מצטבר בתוך RPE12. קווי נוקאאוט ABCA4 פותחו לצד קווי המטופלים, ושניהם היו נתונים להזנת קופה. ה- Stargardt iRPE הדגים פתולוגיה הנגרמת על ידי קופה phagocytosis, והציג הצטברות שומנים מוגברת שכומתה על ידי צביעת BODIPY. RPE שמקורו ב- ABCA4 KO iPSCs היו נתונים לטיפול CC-HS; כימות אות BODIPY הראה פגם בטיפול בשומנים גם במודל מחלת סטארגרדט9.
לאור שכיחותן של מחלות אלו והצורך בטיפולים יעילים, לצד מודלי המחלה הרלוונטיים שתוארו לעיל, יש צורך לבסס שיטות איתנות לכימות יעילותם של טיפולים פוטנציאליים. כדי לכמת משקעי שומנים באופן אובייקטיבי, אוטומטי וסטנדרטי, נוצרה תוכנה מבוססת למידת מכונה, LipidUNet, כך שבשילוב עם כלי ניתוח מסכות, ניתן לזהות במהירות וביעילות שקיעת שומנים באמצעות הסמנים הנפוצים Nile Red, BODIPY ו-APOE. לאחר מכן ניתן לנתח ולהציג באופן גרפי את הנתונים הסטטיסטיים המסכמים המתקבלים באמצעות צינור ניתוח זה, מה שמאפשר השוואה קלה של תנאי הטיפול. הסכימה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> איור 1: סכמה של הפרוטוקול: תאי RPE גדלים על צלחת של 96 בארות ומאותגרים עם סרום אנושי פעיל או מקטעים חיצוניים מטוהרים של בקר כדי למדל סוגים שונים של ניוון רשתית במבחנה. תאי RPE קבועים ומוכתמים עבור משקעי ליפופרוטאין עם אדום הנילוס, BODIPY ו- APOE. מיקרוסקופ קונפוקלי משמש לרכישת ערימות Z של חלקיקי שומנים בעלי תווית פלואורסצנטית, אשר מעובדים לאחר מכן להקרנות דו-ממדיות בעוצמה מרבית. אלגוריתם למידת מכונה אומן לזהות ולפלח נכון חלקיקי ליפופרוטאין. טבלאות סיכום המכילות ספירת חלקיקים ומדדי צורה שונים נוצרות וניתן להשתמש בהן לצורך התוויית נתונים וניתוח סטטיסטי עוקבים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; m מערכת סינון Steriflip</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco's Phosphate Buffered Salt</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-thyronine</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Bovine, Fraction V</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 ארנב נגד עזים IgG (H+L)</td> <td>Invitrogen</td><td>A21431</td><td>APOE נוגדן משני</td></tr><tr><td>APOE נוגדן ראשוני</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB947</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>הגן מפני אור</td></tr><tr><td>משלים סרום אנושי מוכשר</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1-LITER</td><td></td></tr><tr><td>CTS N2 תוסף</td><td>חיים טכנולוגיות</td><td>A13707-01</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר</td><td>עוברי Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>מדיה להרכבה על שקופיות</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית החלקות #1 1/2 22 מ"מ x 22 מ"מ</td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td><td>72204-01</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ זכוכית 25 מ"מ x 75 מ"מ- 1.2 מ"מ</td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td> עבה <td>71870-01</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>MEM אלפא</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות Life</td><td>Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>נילוס אדום</td><td>סיגמא</td><td>72485-100MG</td><td>הגן מפני אור</td></tr><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד 16%,</td><td>מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים</td> בדרגת EM <td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח 10x</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>מקטעים חיצוניים של מוט (OS)</td><td>InVision Bioresources</td><td>98740</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SYBR גרין מאסטר מיקס</td><td>ביו-ראד</td><td>1725274</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Ultrapure Affymetrix</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14701SA</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 דיהידרוכלוריד</td><td>מו"פ D מערכות</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה מבוססת ליפידים-למידת מכונה לאפיון וכימות משקעי שומנים באמצעות אפיתל פיגמנט רשתית שמקורו ב-ipsc

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי של תאים משושים הממוקמים בחלק האחורי של העין. הוא מספק הזנה ותמיכה לקולטני אור ונימים כורואידיים, מבצע פגוציטוזה של מקטעים חיצוניים של קולטני אור (POS), ומפריש ציטוקינים באופן מקוטב לשמירה על הומאוסטזיס של הרשתית החיצונית. RPE לא מתפקד, הנגרם על ידי מוטציות, הזדקנות וגורמים סביבתיים, גורם לניוון של שכבות רשתית אחרות וגורם לאובדן ראייה. מאפיין פנוטיפי מובהק של RPE מנוון הוא מרבצי שומנים עשירים בשומנים תוך ות-תאיים. משקעים אלה הם פנוטיפ נפוץ במחלות ניווניות שונות ברשתית. כדי לשחזר את פנוטיפ משקעי השומנים של ניוון רשתית מונוגני במבחנה, נוצר RPE המושרה פלוריפוטנטית שמקורה בתאי גזע (iRPE) מפיברובלסטים של חולים. קווי תאים שנוצרו מחולים עם Stargardt ומחלת ניוון רשתית מאוחרת (L-ORD) הוזנו עם קופה במשך 7 ימים כדי לשכפל את הפונקציה הפיזיולוגית RPE, מה שגרם לפתולוגיה הנגרמת על ידי קופה phagocytosis במחלות אלה. כדי ליצור מודל לניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), מחלה פוליגנית הקשורה להפעלה משלימה חלופית, iRPE אותגר עם אנפילטוקסינים משלימים חלופיים. משקעי השומנים התוך-תאיים והתת-תאיים אופיינו באמצעות אדום הנילוס, בורון-דיפירומתין (BODIPY) ואפוליפופרוטאין E (APOE). כדי לכמת את צפיפות משקעי השומנים, פותחה תוכנה מבוססת למידת מכונה, LipidUNet. התוכנה אומנה על תמונות הקרנה בעוצמה מרבית של iRPE על משטחי תרבית. בעתיד, הוא יאומן לנתח תמונות תלת מימדיות (3D) ולכמת את נפח טיפות השומנים. תוכנת LipidUNet תהיה משאב רב ערך לגילוי תרופות המפחיתות את הצטברות השומנים במודלים של מחלות.

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה לזיהוי משקעי שומנים המוכתמים על ידי Nile Red, BODIPY ו- APOE. התוכנה שפותחה יכולה לזהות ולכמת באופן אוטומטי משקעי שומנים והביצועים הטובים ביותר כאשר הפרוטוקול המתואר ממוטב. כלולות דוגמאות של RPE ממוין בהצלחה (איור 3A) ו-RPE ממוין גרוע (איור 3B), מאחר שאיכות מודל התא משפיעה מאוד על איכות פילוח התמונה הנכון.
שניים מתוך שלושת הסמנים המתוארים בפרוטוקול, אדום הנילוס ו-BODIPY, מזוהים כנקודות מעגליות קטנות ובהירות באופן מובהק בתמונות פלואורסצנטיות (איור 5 ואיור 6). תמונה "חיובית" מהפרוטוקול תהיה זיהוי הולם של המרבצים השונים האלה (איור 5A-D ואיור 5E-H). תוצאה "שלילית" תציג פילוח שגוי של התמונה על-ידי חישוב שגוי של פלואורסצנטיות הרקע כפיקדון, בין אם בשל צביעה חלשה (איור 6A-C ואיור 6D-F) או בשל עוצמת רקע גבוהה (איור 6G-I).
למרבצי APOE יש מגוון גדלים וצורות, והם נראים יותר אליפטיים או לא סדירים מאשר המרבצים המעגליים של אדום הנילוס והבודיפי. פיקדונות אלה הם גם פחות מנוקבים, ועוצמת האות יכולה להיות שונה בין פיקדונות עקב שינויים בחדירות המדגם. זיהוי נכון יזהה כל מרבץ, כולל מרבצים פחות רוויים (איור 5I-L), בעוד שסגמנטציה שגויה לא תאסוף את המרבצים הללו (איור 6J-L). לכן, חשוב לייעל את שיטות הצביעה וההדמיה כדי למנוע שונות דרסטית. אחת הדרכים לעשות זאת היא על ידי מתן תשומת לב קפדנית לשלבי חדירת הדגימה תוך כדי חיסון. כדי למטב את האות הפלואורסצנטי, ניתן לבצע ליזה של תאים לפני קיבוע וצביעת מערכת החיסון עבור APOE, מה שמביא לרוויה אחידה ופילוח טוב יותר של מרבצי ה-APOE.
מסופקות גם תמונות מקוטעות של תאים שהתבגרו על פלטפורמת תרבית שאינה צלחת באר 96. תוכנת LipidUNet הורצה על תמונות של תאים שגודלו בתרבית על גבי טרנסוול, ובעוד משקעי השומנים הם סף, כך גם הנקבוביות בקרום הטרנסוול (איור 6M-O). בגלל הדמיון בצורה ובגודל, תוכנת LipidUNet בצורתה הנוכחית תסווה הן את משקעי השומנים והן את נקבוביות השקיפות ללא הבחנה.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> איור 5: תוצאות מייצגות. (A,E,I) RPE מצופה 96 היטב מוכתמים בצביעה גרעינית Hoechst (כחול) ואדום נילוס (מגנטה), BODIPY (ירוק) או APOE (כתום) והם הקרנות העוצמה המרבית של ערימת Z. (ב,ו,י) תמונות הקלט בגווני אפור עבור תוכנת LipidUNet לאחר עיבוד תמונה. (ג,ג,יא) מסכות שנוצרו על ידי LipidUNet, שבו כל הפיקדונות מזוהים כראוי. (ד,ח,ל) קווי המתאר של כל חלקיק מוסווה ממוספרים. תוויות אלה מאפשרות לחבר כל חלקיק בתמונה לערך ב- spreadheet עם הנתונים הגולמיים. (A-D) מראה כתמים בצבע אדום הנילוס, והתוכנה מסוגלת לזהות את המרבצים על רקע במדויק למרות אות חלש יותר. (E-H) מראה ניגוד חזק בין אות BODIPY לבין הרקע, שהוא אידיאלי. LipidUNet מזהה נכון כל הפקדה בתמונה. (I-L) מראה אות APOE חזק ומייצג את השונות של רוויית האות שנראית לעתים קרובות עם כתם זה. עם זאת, פילוח תמונות מסוגל לזהות את הגבולות של כל מרבץ APOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> איור 6: תוצאות תת-אופטימליות. (A,D,G,J,M) RPE מצופה היטב 96 מוכתמים בצביעה גרעינית Hoechst (כחול) ואדום נילוס (מגנטה), BODIPY (ירוק) או APOE (כתום) והם הקרנות העוצמה המרבית של ערימת Z. (ב,ה,ח,ק,נ) תמונות הקלט בגווני אפור עבור תוכנת LipidUNet לאחר עיבוד תמונה. (ג,ו,י,ל,א) המסכות השגויות שנוצרו על ידי LipidUNet. עיגולים אדומים מציינים היכן התוכנה זיהתה באופן שגוי פיקדון שומנים. (א-ג) עיבוד Nile Red שגוי מכיוון שהתוכנה זיהתה את צביעת הרקע כפיקדון. זה יכול לקרות לעתים קרובות יותר כאשר יש רקע גבוה אבל מעט משקעי שומנים בתמונה. שתי דוגמאות לצביעת BODIPY מוצגות: תמונה באיכות ירודה עקב (D-F) צביעת BODIPY חלשה ו- (G - I) אות BODIPY חזק עם רקע גבוה. בשני המקרים, התוכנה אינה מסוגלת להבחין בין משקעי שומנים קטנים ועגולים לבין הטבעת המעגלית המקיפה את הגרעין. בעוד צביעה והדמיה צריך להיות אופטימיזציה כדי למנוע שגיאות אלה, הגרסה העדכנית ביותר של LipidUNet משופרת במידה רבה עבור תמונות אלה. (י-ל) פילוח APOE שגוי. מכיוון שהפיקדונות משתנים יותר בגודל וברוויה של האות, התוכנה מתקשה לזהות כמה פיקדונות. (מ-ו) RPE זרע על טרנסוול ומוכתם באדום הנילוס. פרוסה מערימת Z מוצגת כאן עם משקעי שומנים אדומים של הנילוס ונקבוביות טרנסוול. התוכנה אינה מסוגלת להבחין בין השניים, כפי שניתן לראות על ידי העיגול האדום המכיל נקבוביות טרנסוול והחץ הירוק המצביע על מרבצי הנילוס האדומים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> איור 7: השוואת כלי מסיכה. (A,B,C) RPE מצופה 96 היטב עם כמויות משתנות של שקיעת שומנים מזוהים עם אדום הנילוס (אדום). התמונות מוסוות באמצעות שלוש שיטות מסיכה נפוצות שונות, Find Maxima, Max Entropy ו-Renyi Entropy, ומושווים למסיכה שנוצרה על ידי LipidUNet. התמונה המקורית מלווה בספירה ידנית של משקעי השומנים, ואילו המסכות מציגות את הספירה החזויה בכל שיטת סגמנטציה. שיעור השגיאה הממוצע חושב עבור כל שיטת פילוח באמצעות הנוסחה הבאה: mean[(|ספירה חזויה - ספירה ידנית|/ספירה ידנית) x 100]. המסכה שנוצרה על-ידי LipidUNet מזהה באופן מדויק יותר משקעי שומנים בתמונות עם שיקוע משתנה בהשוואה לשיטות מיסוך אחרות (שיעורי שגיאה ממוצעים: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropy, 203% Renyi Entropy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>רכיב</td>
			<td>מספר חתול</td>
			<td>מניית קונק.</td>
			<td>קונק סופי.</td>
			<td>מ"ל</td>
		</tr><tr><td>MEM אלפא</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>נה</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>תוספת N2</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>נה</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FBS מנוטרל בחום</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>נה</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>NMEM NEAA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10 מ"מ</td>
			<td>0.01 מ"מ</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>נתרן פירובט</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100mM</td>
			<td>1 מ"מ</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u/מ"ל</td>
			<td>100U/מ"ל</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>טאורין</td>
			<td>T4571</td>
			<td>50 מ"ג/מ"ל</td>
			<td>250 מ"ג/מ"ל</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td>
			<td>H6909</td>
			<td>18.1 מ"ג/ליטר</td>
			<td>20 מ"ג/ליטר</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>T3</td>
			<td>T5516</td>
			<td>20 מ"ג/ליטר</td>
			<td>0.013ug/L</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">נפח כולל, מ"ל</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: הרכב מגיב RPE-MM. רשימה של ריאגנטים וריכוזים אופטימליים עבור RPE-MM.

מחלות עיניים ניווניות המשפיעות על שכבת אפיתל פיגמנט הרשתית של העין יש מקורות מונוגניים ופוליגניים. מספר מודלים של מחלות ויישום תוכנה, LipidUNet, פותחו כדי לחקור מנגנונים של מחלות, כמו גם התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

שיטה מבוססת ליפידים-למידת מכונה לאפיון וכימות משקעי שומנים באמצעות אפיתל פיגמנט רשתית שמקורו ב-iPSC

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

במחקר זה, אנו שואפים להבין את הפתוגנזה של ניוון מאקרו הקשור לגיל ולמצוא את הטיפול הפוטנציאלי עבורה. צינור חצי-אוטומטי זה לניתוח טיפות שומנים מספק מערכת חזקה לחקר חילוף החומרים ומחלות הזדקנות. המעבדה שלנו מתמקדת במציאת מטרות תרופתיות לטיפול ב-AMD באמצעות מסכים גנטיים או מולקולות קטנות שמטרתם להפחית את הצטברות משקעי השומנים.

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

MicroRNA (מירנה) הפרופילים של גזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS), אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) נגזרים מגזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS) (iPS-RPE), ורשתית של העובר, הושווה.

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) תומך ברשתית התחושתית, באמצעות מיחזור תוצרי לוואי של מחזור הראייה, המצטברים כליפופוסין. מוצרים אלה הם אוטו-פלואורסצנטיים וניתן לצלם אותם באופן איכותי in vivo. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה כמותית של ליפופוסין RPE באמצעות אופטלמוסקופיה בלייזר סריקה קונפוקלית.

כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית

אנו מתארים שיטה להפרדה יעילה של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מהרשתית בעיניים אנושיות ויצירת שטוחים שלמים של RPE/כורואידים לצורך ניתוחים היסטולוגיים ומורפומטריים של ה-RPE.

ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי

מודלים של עכברים יכולים להיות כלים שימושיים לחקר הביולוגיה של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE). נקבע כי עכברים יכולים לפתח מערך של פתולוגיות RPE. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פנוטיפ כדי להבהיר ולכמת פתולוגיות RPE בעכברים באמצעות אור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי.

פרוטוקול להערכה וכימות של פתולוגיות אפיתל פיגמנטי ברשתית במודלים עכבריים של ניוון מקולרי הקשור לגיל

פרוטוקול זה מתאר מודל הצטברות ליפופוסצין בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושי (RPE) מובחנות ומקוטבות מאוד ובדיקת פגוציטוזה משופרת של סגמנט חיצוני (OS) כדי לזהות את יכולת הצריכה/השפלה הכוללת של מערכת ההפעלה של RPE. שיטות אלה מתגברות על המגבלות של מודלים קודמים של ליפופוסצין ומבחני פאגוציטוזה קלאסיים של הקטע החיצוני של מרדף הדופק.

מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד

המחקר הנוכחי מתאר מתודולוגיות מבוססות דה-צלולריזציה להדמיה וכימות של שקיעת רקמת שומן תוך-שרירית (IMAT) באמצעות נפח שריר שלם, כמו גם כימות מדדים של אדיפוציטים בודדים המרכיבים IMAT.

כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד

אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) הוא אפיתל רב תפקודי של העין. כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות תאים ראשי נגזר RPE מאתר...

התא העיקרי של אפיתל הפיגמנט ברשתית העכבר תרבויות

הנילוס אדום צביעה של קבוע Caenorhabditis elegans הוא שיטה למדידה כמותית של משקעי השומנים נייטרלי, בעוד שמן אדום O צביעת מקלה על הערכה איכותית של השומנים התפלגות בין רקמות.

כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

היווצרות של רשת sarcomere נכונה חשובה להתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC. אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר המאפשרת הערכה כמותית של התבגרות מבנית של תאי גזע נגזר cardiomyocytes, כדי לשפר את תנאי התרבות קידום התפתחות הלב.

ניתוח רשת α-Actinin בקרדיומיוציטים אנושיים הנגזרים מ-iPSC באמצעות מיקרוסקופיה לתיאום מולקולה אחת

חקור שיטות ניתוח טיפות שומן באפיתל פיגמנט רשתית שמקורו ב-iPSC לחקר מנגנוני AMD וגילוי מטרות תרופתיות. השיטה משלבת צביעת Nile Red, BODIPY ו-APOE עם LipidUNet לאפיון כמותי.

שיטה מבוססת ליפידים-למידת מכונה לאפיון וכימות משקעי שומנים באמצעות אפיתל פיגמנט רשתית שמקורו ב-iPSC

גלה סרטונים נוספים