Name: ייצור ספרואידי גידול ואנקפסולציה בהידרוגל פוליאתילן גליקול לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: חקור ייצור ספרואידי גידול ואנקפסולציה בהידרוג'ל פוליאתילן גליקול לחקירת אינטראקציות עם מטריצת הגידול. שיטה מהירה, חסכונית ונגישה ללא ציוד מיוחד לפיתוח מודלים פיזיולוגיים מדויקים של גליובלסטומה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי קרנות הזנק שסופקו לד"ר סילביה פ זוסטיאק על ידי אוניברסיטת סנט לואיס, כמו גם על ידי מענק זרע ממרכז הנרי ואמיליה נסראללה למדעי המוח באוניברסיטת סנט לואיס שהוענק לד"ר סילביה פ זוסטיאק.

ייצור ואחריו אנקפסולציה תלת ממדית של ספרואידים סרטניים בהידרוג'לים PEG

<ol><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+formation+on+non-adhesive+surfaces+by+liquid+overlay+technique%3A+Considerations+and+practical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417(2018).</li>
<li>Li, Y., Kumacheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microenvironments+for+cancer+spheroid+growth+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drug screening.</a> Science Advances. 4 (4), eaas8998(2018).</li>
<li>Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+synthetic+biomaterials+for+engineering+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids.</a> Polymers. 12 (11), 2506(2020).</li>
<li>Wang, C., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+3D+brain+tumor+model+to+elucidate+the+effects+of+matrix+stiffness+on+glioblastoma+cell+behavior+using+PEG-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).</li>
<li>Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biomimetic+hyaluronic+acid+hydrogels+to+investigate+glioblastoma+stem+cell+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+scaffolds+for+3D+culture+demonstrate+extracellular+matrix-mediated+mechanisms+of+chemotherapy+resistance+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma.</a> Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).</li>
<li>Pedron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid-functionalized+gelatin+hydrogels+reveal+extracellular+matrix+signals+temper+the+efficacy+of+erlotinib+against+patient-derived+glioblastoma+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens.</a> Biomaterials. 219, 119371(2019).</li>
<li>Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+matrix+presence+and+composition+influence+drug+responses+of+encapsulated+glioblastoma+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).</li>
<li>Chen, J. -W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+microglia+and+patient-derived+glioblastoma+cells+inhibit+invasion+in+a+three-dimensional+gelatin+hydrogel+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346(2020).</li>
<li>Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials-based+approaches+to+tumor+spheroid+and+organoid+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980(2018).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-marine+collagen-agarose+composite+hydrogels+as+matrices+for+biomimetic+3D+cell+spheroid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation.</a> RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).</li>
<li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li>
<li>Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Templated+macroporous+polyethylene+glycol+hydrogels+for+spheroid+and+aggregate+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).</li>
<li>Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+size-controlled+glioma+spheroids+using+agarose+hydrogel+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells.</a> PLoS One. 14 (1), e0211078(2019).</li>
<li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+numbers+of+size-controlled+tumor+spheroids+using+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665(2013).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTimmins%2C+NE+%22Generation+of+Multicellular+Tumor+Spheroids+by+the+Hanging-Drop+Method%22">Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method</a>. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+printed+hanging+drop+dripper+for+tumor+spheroids+analysis+without+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19717(2019).</li>
<li>Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605(2017).</li>
<li>Gencoglu, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+multicellular+tumor+spheroid+formation+methods+and+implications+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).</li>
<li>Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+brain+tissue+based+on+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of brain tissue based on microstructure.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924(2021).</li>
<li>Alifieris, C., Trafalis, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+Pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment.</a> Pharmacology & Therapeutics. 152, 63-82 (2015).</li>
<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolytically+degradable+poly+%28ethylene+glycol%29+hydrogel+scaffolds+with+tunable+degradation+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hydrolytically degradable poly (ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties.</a> Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).</li>
<li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-hydrogel+interactions+in+tissue+engineering%3A+Mechanisms+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).</li>
<li>Kroger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+hydrolytically+degradable+polyethylene+glycol+crosslinkers+for+facile+control+of+hydrogel+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Design of hydrolytically degradable polyethylene glycol crosslinkers for facile control of hydrogel degradation.</a> Macromolecular Bioscience. 20 (10), 2000085(2020).</li>
<li>Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+engineered+PEG+hydrogels%3A+a+novel+model+system+for+proteolytically+mediated+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).</li>
<li>Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+spheroid+growth+and+chemotherapeutic+responses+in+single+and+dual-stiffness+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels.</a> Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shooting+for+the+moon%3A+using+tissue-mimetic+hydrogels+to+gain+new+insight+on+cancer+biology+and+screen+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Communications%22%5BJournal%5D)">Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics.</a> MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).</li>
<li>Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+polyethylene+glycol-based+hydrogel+microspheres+through+electrospraying%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Materials+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).</li>
<li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).</li>
<li>Lee, K. -H., Kim, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+multicellular+tumor+spheroid+generation+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening.</a> Biosensors. 11 (11), 445(2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מודלים ספרואידים רב-תאיים מבוססי הידרוג'ל מפותחים יותר ויותר כדי לקדם תגליות טיפוליות בסרטן 11,13,29. הם מועילים מכיוון שהם מחקים פרמטרים מרכזיים של מיקרו-סביבת הגידול באופן מבוקר, ולמרות מורכבותם, הם פשוטים וזולים יותר לשימוש מאשר מודלים in vivo, ורבים מהם תואמים לטכנולוגיות סינון בתפוקה גבוהה. ניתן לכוונן את הביו-חומרים של ההידרוג'ל כך שיחקו את המטריצה החוץ-תאית של הגידול ויאפשרו אינטראקציות תא-מטריצה, והספרואיד (בניגוד לתאים ...

ספרואידים סרטניים התגלו ככלים שימושיים במבחנה בחקר אטיולוגיה של סרטן, פתולוגיה והיענות לתרופות1. באופן מסורתי, ספרואידים גודלו בתרבית בתנאים כגון לוחות הדבקה נמוכים או ביוריאקטורים, שבהם היצמדות התא מועדפת על פני היצמדות פני התא2. עם זאת, כיום ידוע כי כדי לשחזר את המיקרו-סביבה של הגידול בצורה נאמנה יותר, מודלים ספרואידים במבחנה צריכים ללכוד הן אינטראקציות תא-תא והן אינטראקציות מטריצת תאים. זה גרם לקבוצות רבות לתכנן פיגומים, כגון הידרוג'לים, שבהם ניתן לעטוף ספרואידים 3,4. מודלים ספרואידים מבוססי הידרוג'ל כאלה מאפשרים הבהרה של אינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים על התנהגויות תאים שונות, כגון כדאיות, התפשטות, גזע או היענות לטיפול3.
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לאנקפסולציה של ספרואידים מסוג גליובלסטומה בהידרוג'לים מפוליאתילן גליקול (PEG). ישנם דיווחים ספרותיים רבים על אנקפסולציה ספרואידית של תאי גליובלסטומה בהידרוג'לים. לדוגמה, ספרואידים נוצרו על ידי עטיפת תאי U87 בהידרוג'ל PEG המעוטרים בליגנד דבק RGDS ומוצלבים עם פפטיד בעל יכולת שבירה אנזימטית כדי לקבוע את ההשפעה של קשיחות הידרוג'ל על התנהגות התא5. תאי U87 נוצרו גם בהידרוג'לים אחרים מבוססי PEG או חומצה היאלורונית כדי להרחיב את אוכלוסיית תאי הגזע הסרטניים6 או לחקור מנגנונים בתיווך מטריצה של עמידות לכימותרפיה 7,8,9. גליובלסטומה ספרואידים היו עטופים גם בהידרוג'לים של ג'לטין כדי לחקור את ההצלבה בין תאי מיקרוגליה ותאים סרטניים ואת השפעתה על פלישת תאים10. בסך הכל, מחקרים כאלה הוכיחו את התועלת של מודלים מבוססי הידרוג'ל במבחנה בהבנת פתולוגיה של גליובלסטומה ובתכנון טיפולים.
יתר על כן, ישנן שיטות שונות לייצור ספרואידים סרטניים ואנקפסולציה הידרוג'ל11. לדוגמה, תאים מפוזרים יכולים להיות זרעים הידרוג'ל מותר ליצור spheroids לאורך זמן 5,12. חסרון אחד של שיטה כזו הוא polydispersity של spheroids שנוצרו, אשר יכול להוביל לתגובות תאים דיפרנציאליים. כדי לייצר ספרואידים אחידים, תאים יכולים להיות עטופים במיקרו-ג'לים ומתורבתים לפרקי זמן ממושכים עד שהם פולשים ומשפצים מחדש את הג'ל13, או שניתן להפקיד תאים בג'לים בתבנית עם 'חורים' כדוריים ולאפשר להם לצבור14. החיסרון של שיטות אלה הוא המורכבות היחסית שלהן, הצורך במחולל טיפות או אמצעים אחרים ליצירת מיקרוג'לים או "חורים" בג'ל, והזמן שלוקח לספרואידים לגדול ולהבשיל. לחלופין, ספרואידים יכולים להיווצר מראש במיקרו-בארות 9,15,16 או בלוחיות תלויות17,18 ואז לעטוף אותם בהידרוג'ל, בדומה לטכניקה שתוארה כאן. שיטות אלה פשוטות יותר וניתן לעשות זאת בצורה תפוקה גבוהה יותר. באופן מעניין, הוכח כי שיטת היווצרות הספרואידים יכולה להשפיע על התנהגויות תאים ספרואידים, כגון ביטוי גנים, התפשטות תאים, או היענות לתרופות19,20.
כאן, אנו מתמקדים בגליובלסטומה מכיוון שמדובר בגידול מוצק שסביבתו הטבעית היא מטריצת המוח הרכה והננו-נקבובית21, שניתן לחקות באמצעות הידרוג'ל רך וננו-נקבובי. גליובלסטומה הוא גם סרטן המוח הקטלני ביותר שאין לו תרופה זמינה22. עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש לאנקפסולציה של ספרואידים המייצגים כל גידול מוצק. בחרנו להשתמש בהידרוג'לים מסוג PEG הנוצרים באמצעות תגובת חיבור מסוג מיכאל23. PEG הוא הידרוג'ל סינתטי, בלתי מתכלה ותואם ביולוגית, אינרטי המשמש כפיגומים וכתמיכה פיזית בתאים, אך אינו תומך בחיבור תאים23. ניתן להוסיף הדבקת תאים בנפרד באמצעות קשירה של חלבונים שלמים או ליגנדות דבק24, ופירוק ניתן להוסיף באמצעות שינויים כימיים של שרשרת פולימר PEG או קרוסלינקרים מתכלים הידרוליטית או אנזימטית25,26. זה מאפשר לכוונן תכונות ביוכימיות ללא תלות בתכונות הידרוג'ל מכניות או פיזיקליות, מה שיכול להיות יתרון בחקר אינטראקציות תא-מטריצה. כימיית הג'לציה מסוג מיכאל היא סלקטיבית ומתרחשת בתנאים פיזיולוגיים; לפיכך, הוא מאפשר אנקפסולציה ספרואידית פשוט על ידי ערבוב הספרואידים עם תמיסת קודמן הידרוג'ל.
בסך הכל, למתודולוגיה המוצגת כאן יש כמה מאפיינים בולטים. ראשית, ייצור ספרואידים סרטניים בהרכבה מרובת בארות הוא יעיל, מהיר, ועלות החומרים הנדרשים נמוכה. שנית, הספרואידים מיוצרים באצוות גדולות במגוון גדלים עם פיזור נמוך. לבסוף, נדרשים רק חומרים זמינים מסחרית. התועלת של המתודולוגיה מודגמת על ידי חקירת ההשפעה של תכונות המצע על כדאיות התא, המעגליות וגזע התא.

<table><tbody><tr><td>70% אתנול</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>LC22210-4</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל חרוטים</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24 בארות צלחת הצמדה נמוכה במיוחד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת פטרי</td><td>אמזון</td><td>706011</td><td></td></tr><tr><td>4 זרועות פולי (אתילן גליקול)-אקרילט (4 זרועות PEG-Ac; 10 kDa)</td> <td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-10K-5g</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל חרוטים</td><td>פישר סינטיפיק</td><td></td><td></td>3181345107</tr><tr><td>6 בארות AggreWell 400&nbsp;</td><td>StemCell Technologies, ונקובר, קנדה</td><td>34421</td><td>מיקרו-וולות פירמידליות מרובעות&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת שטיפה נגד הידבקות</td><td>StemCell Technologies, ונקובר, קנדה</td><td>חתול #: 07010</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אספרטית-ארגינין-ציסטאין-גליצין-ואלין-פרולין-מתיונין-סרין-מתיונין-ארגינין-ארגינין-גליצין-ציסטאין-ארגינין- חומצה אספרטית (DRCG-VPMSMR-GCRD) פפטיד</td><td>גני ביו, שנחאי, סין</td><td>n/a</td><td>סינתזה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>קולט אדים כימי</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג מטריג'ל מטריצת ממברנת מרתף, LDEV Free&nbsp;</td><td>חומר ניקוי קורנינג</td><td></td><td>356234 מטריצת ממברנה בסיסית</td></tr><tr><td>- Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>חומר פעילי שטח לא יוני</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות חד פעמיות (1 מ"ל, 2 מ"ל, 5 מ"ל, 10 מ"ל, 25 מ"ל, 50 מ"ל)</td><td>פישר סינטיפיק</td><td>1 מ"ל: 13-678-11B, 2 מ"ל: 05214038, 5 מ"ל (FALCON): 357529, 10 מ"ל: 13-678-11E, 25 מ"ל: 13-678-11, 50 מ"ל: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד 37% תמיסה</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>צלחות זכוכית</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות העברת זכוכית</td><td>פישר סינטיפיק</td><td>5 3/4 אינץ': 1367820A, 9 אינץ': 136786B</td><td></td></tr><tr><td>גליצין-ארגינין-ציסטאין-חומצה אספרטית-ארגינין-גליצין-חומצה אספרטית-סרין (GRCD-RGDS) פפטיד</td><td>גני ביו, שנחאי, סין</td><td>n/a</td><td>סינתזה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה הידרופובית - דוחה סילאן&nbsp;</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>D1125</td><td></td></tr><tr><td>Leica Confocal SP8</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרו צנטריפוגות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>2 מ"ל:</td> תוכנת מיקרוסקופ 02681258 <td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Nestin Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-23927</td><td></td></tr><tr><td>פרפילם</td><td>PARAFILM&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>MP ביומדיקל</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה (1&ndash; 200 ומיקרו; L, 101&ndash; 1000 ומיקרו; L)</td> <td>פישר Scinetific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות העברה חד פעמיות סטנדרטיות מפלסטיק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>סירות שקילה מפלסטיק (100 מ"ל)</td> <td>אמזון&nbsp;</td><td>mdo-azoc-1030</td><td></td></tr><tr><td>poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>SH-PEG-SH-3400-5g</td><td></td></tr><tr><td>Polydimehylsiloxane (PDMS) [ערכת אלסטומר Slygard 182]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td> כפפות בדיקה ללא אבקת <td>פולידימתילסילוקסן</td></tr><tr><td></td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide, סולן מימי 1 מ"ג/מ"ל.&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>AAJ66584AB</tr><tr><td>RPMI-1640 בינוני (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>מרווחי סיליקון - יריעת סיליקון, עובי 0.5 מ"מ/13 ס"מ x 18 ס"מ</td><td>גרייס ביו-לאבס</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td>SOX2 Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-365823</td><td></td></tr><tr><td>מכסה מנוע תרבית רקמות</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>טריאתנולמין, &ge; 99.0% (GC)&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG תאי גליובלסטומה אנושיים</td><td>אוסף תרביות מסוג אמריקאי&nbsp;</td><td>HTB-14</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור ספרואידי גידול ואנקפסולציה בהידרוג'ל פוליאתילן גליקול לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

אנקפסולציה תלת ממדית (3D) של ספרואידים חיונית כדי לשכפל כראוי את המיקרו-סביבה של הגידול לצמיחת תאים אופטימלית. כאן, תכננו מודל גליובלסטומה תלת-ממדי במבחנה עבור אנקפסולציה ספרואידית כדי לחקות את המיקרו-סביבה החוץ תאית של הגידול. ראשית, יצרנו תבניות מיקרווול פירמידליות מרובעות באמצעות polydimethylsiloxane. תבניות מיקרו-באר אלה שימשו לאחר מכן לייצור ספרואידים סרטניים בגדלים מבוקרים היטב בין 50-500 מיקרומטר. לאחר יצירת הספרואידים, הם נקטפו ונעטפו בהידרוג'לים מבוססי פוליאתילן גליקול (PEG). הידרוג'ל PEG הוא פלטפורמה רב-תכליתית לאנקפסולציה ספרואידית, מכיוון שניתן לכוונן תכונות הידרוג'ל כגון קשיחות, מתכלות והיצמדות תאים באופן עצמאי. כאן, השתמשנו בהידרוג'ל רך מייצג (~ 8 kPa) כדי לתמצת ספרואידים של גליובלסטומה. לבסוף, פותחה שיטה להכתמה ותמונה של ספרואידים לקבלת תמונות באיכות גבוהה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בשל הליבה הספרואידית הצפופה והפריפריה הדלילה יחסית, הדמיה יכולה להיות קשה, אך שימוש בתמיסת ניקוי וחתך אופטי קונפוקלי מסייע להקל על קשיי הדמיה אלה. לסיכום, אנו מראים שיטה לייצר ספרואידים אחידים, לעטוף אותם בהידרוג'לים PEG ולבצע מיקרוסקופ קונפוקלי על הספרואידים העטופים כדי לחקור את גדילת הספרואידים ואינטראקציות שונות בין תאים למטריצה.

פלטפורמות סינון תרופות מבוססות ספרואידים לחקר השפעות כימותרפיות מבוקשות יותר ויותר בשל הדגש על אפנון המיקרו-סביבה של הגידול על אנקפסולציה ספרואידית בביו-חומרים המשכפלים רקמות טבעיות. כאן פיתחנו שיטה להכנת ספרואיד גידול רב-תאי ולאחר מכן אנקפסולציה והדמיה בהידרוג'ל תלת ממדי. הספרואידים מוכנים בתבניות מיקרו-באר (איור 3A,B), אשר גורמות לכדורידים בעלי צורות כדוריות ופיזור רב-פעמי מבוקר היטב. לדוגמה, עבור ספרואידים עם 3,300 תאים למיקרו-באר, גודל הספרואיד הממוצע היה ~250 מיקרומטר, ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר ייצור מהיר, חזק וזול של ספרואידים סרטניים ואחריו אנקפסולציה הידרוג'ל. זה ישים באופן נרחב כפי שהוא אינו דורש ציוד מיוחד. זה יהיה שימושי במיוחד לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה ובניית פיזיולוגיה של רקמות חוץ גופיות או מודלים פתולוגיים.

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth.  Here, we ...

המעבדה שלנו מתמקדת בתכנון מודלים של הידרוג'ל חוץ גופי עבור אנקפסולציה של סטרואידים מסוג גליובלסטומה כדי לחקות את המיקרו-סביבה החוץ תאית של הגידול. המצע היעיל, התכונות המכאניות והביוכימיות על יכולת הקיום של תאי סטרואידים, מעגליות, גבעול והתפשטות נחקרים באמצעות מודלים כאלה. האתגרים הניסיוניים הנוכחיים בפיתוח מודולי הגידול סובבים סביב הרצון למורכבות כדי לחקות את כל ההיבטים של מיקרו-סביבת הגידול לצורך רלוונטיות פיזיולוגית, וגם רצון לפשטות כדי להפוך את המודל לנגיש, חזק, זול וקל לשימוש, ותואם לגישות סינון מולטיפלקס.אנו מציגים פרוטוקול המאפשר ייצור מהיר, חזק ובעלות נמוכה של סטרואידים סרטניים ואנקפסולציה בהידרוג'לים שנועדו לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול. המודל אינו דורש ציוד מיוחד. זה יהיה שימושי במיוחד לחקר אינטראקציות מטריצת סטרואידים בבניית פיזיולוגיה של רקמות חוץ גופיות או מודלים פתולוגיים.הבנת יחסי הגומלין בין תאי סרטן גליובלסטומה לבין המיקרו-סביבה שלהם יכולה לעודד פיתוח טיפולים חדשים לטיפול טוב יותר בסרטן זה. יתר על כן, פיתוח מודל חוץ גופי לסרטן גליובלסטומה יכול לשפר את הפיתוח של מודל זה עבור מחלות סרטן אחרות.

tumor-spheroid-fabrication-encapsulation-polyethylene-glycol

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מקור: Guyon, J., et al. מודל ספרואיד תלת מימדי לגליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2020)הסרטון מדגים את היצירה של מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול. ספרואידים נוצרים מתאי גידול מוח אנושיים ומוטמעים במטריצת קולגן. תאי הגידול בפריפריה הספרואידית מאמצים פנוטיפ פולשני, מפרישים פרוטאזות כדי לפרק את הקולגן ומתקדמים לפלוש למטריצה שמסביב.

יצירת מודל ספרואיד תלת מימדי של פלישת תאי גידול

microrheology מעקב חלקיק יכול להיות בשימוש למי שאינו הרסני לכמת ומרחבית מפת שינויים בתכונות מכאניות מטריצה ​​תאית במודלי גידול 3D.

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

פלישה לרקמות נורמליות שמסביב היא מאפיין מגדיר של גידולים ממאירים. אנו מספקים כאן מבחן מיקרו-צלחת פשוט ואוטומטי למחצה של פלישה לביומטריצה תלת מימדית טבעית שהודגמה במספר מודלים של סרטן אנושי מתקדם.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של תאים באמצעות צבירת תאים. זה מותאם בקלות לסוגי תאים מרובים ומתאים לשימוש במגוון יישומים כולל נדידת תאים, פלישה או מבחני אנויקיס, ולהדמיה וכימות אינטראקציות בין תאים-מטריצות.

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

מיקרוסביבה הגידול הוא חלק חיוני של גידול בסרטן ופלישה. כדי לחקות התקדמות קרצינומה, צריך מטריצה אנושית רלוונטית ביולוגית. פרוטוקול זה מציג שיפור לגבי שיטת החדירה החיצונית התלת-ממדית של שלושה מימדים על-ידי החלת מטריצה אנושית המבוססת על מייומה. הפרוטוקול גם מציג ניתוח הפלישה לתא מבוסס-מחשב.

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

כאן, אנו מתארים שיטת פלישה קלה לשימוש עבור גלינובלסטומה. שיטת הפעולה הזאת מתאימה לתאים גלנובלסטומה כמו גזע. מאקרו של פיג'י לכימות קל של פלישה, הגירה והתפשטות מתואר גם כן.

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

מודלים מקיפים במבחנה המשיבים נאמנה את המחלה האנושית הרלוונטית חסרים. המחקר הנוכחי מציג יצירה ותרבות תלת מימדית של גידול תלת מימדי(תלת-ממדי), כלי הפריה אמין לחקר האינטראקציה בין הגידול לסטרומלי בקרצינומה הפטוקולרית האנושית.

מודל ספרואידי תלת מימדי לחקר האינטראקציה בין גידולים סרטניים בקרצינומה הפטוקולרית

המחקר הנוכחי מתאר מתודולוגיות לתרבות, הקפאה, הפשרה, עיבוד, צביעה, תיוג ובחינה של ספרואידים ואורגנואידים שלמים תחת מיקרוסקופים שונים, בעוד שהם נשארים שלמים בהידרוג'ל בתוך מכשיר רב תכליתי.

תרבות, הקפאה, עיבוד והדמיה של אורגנואידים וספרואידים שלמים בעודם בהידרוג'ל

מאמר זה מדגים שיטה סטנדרטית לבניית ספרואידים תלת מימדיים של גידולים. כמו כן מתוארת אסטרטגיה לתצפית ספרואידית וניתוח למידה עמוקה מבוססת תמונה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.

יצירת ספרואידים תלת ממדיים להערכת תרופות

יש צורך קריטי במודלים תלת מימדיים של סרטן הלוכדים הצלבה הטרו-תאית כדי לחקור גרורות סרטניות. המחקר שלנו מציג את הדור של הטרו-אפיתל סטרומלטי-תאי בסביבה נטולת פיגומים ופיגומים שניתן להשתמש בהם לחקר פלישה והתפלגות מרחבית תאית.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

חקור ייצור ספרואידי גידול ואנקפסולציה בהידרוג'ל פוליאתילן גליקול לחקירת אינטראקציות עם מטריצת הגידול. שיטה מהירה, חסכונית ונגישה ללא ציוד מיוחד לפיתוח מודלים פיזיולוגיים מדויקים של גליובלסטומה.

ייצור ספרואידי גידול ואנקפסולציה בהידרוג'ל פוליאתילן גליקול לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה

גלה סרטונים נוספים