Name: אסטרטגיות כימות, הערכת כדאיות והדמיה עבור ביופילמים של Acinetobacter (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: למד אסטרטגיות כימות והדמיה לביופילמים של Acinetobacter באמצעות צבע קריסטל ויולט ומיקרוסקופיה קונפוקלית. השיטה חושפת שונות משמעותית ביצירת ביופילם בין זני החיידק השונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר העיקרית (E0210702-03) של המכון לחקר המזון של קוריאה (KFRI), במימון משרד המדע והתקשוב.

1. הכנת חיסון חיידקי
<ol><li>הסר את בקבוקון מלאי הגליצרול המאוחסן ב -80 ° C.</li>
	<li>מוציאים את זן החיידק (2-10 μL) מהבקבוקון בעזרת קצה פיפטה סטרילי. הערה: זני Acinetobacter , A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) ו- A. ursingii (24-1 ) משמשים בפרוטוקול זה.</li>
	<li>יש לחסן צלחת אגר דם מסחרית (אגר סויה טריפטי בתוספת דם כבשים 5%, ראו טבלת חומרים) עם החיידקים. הערה: ניתן להשתמש גם במדיה אחרת, כגון אגר מזין או אגר MacConkey.</li>
	<li>פזרו את משטח האגר באמצעות לולאה סטרילית עם להבה לסירוגין כדי לדלל אותו.</li>
	<li>מניחים את צלחת האגר הפוכה באינקובטור ודגרים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך לילה למשך 20-24 שעות.</li>
	<li>בחר מושבה אחת של תרבית חיידקים עם מחט סטרילית וחסן 5 מ"ל סטרילי של מרק עירוי לב במוח (BHI, ראה טבלת חומרים) עם התרבית.</li>
	<li>לדגור על המרק המחוסן באינקובטור רועד ב 30 מעלות צלזיוס במשך הלילה במשך 20-24 שעות בסביבות 150 סל"ד.</li>
	<li>העבירו 1 מ"ל של תרבית הלילה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי וצנטריפוגה את תרבית הלילה ב 6,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה.</li>
	<li>באמצעות מערבולת, להשהות מחדש את הגלולה במי מלח סטריליים חוצצים פוספט (PBS) 1 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 6,000 × גרם למשך 10 דקות ב RT ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>יש להשהות מחדש את הגלולה ב-BHI סטרילי מדולל פי עשרה באמצעות מערבולת לצפיפות אופטית של כ-0.1 ב-600 ננומטר. הערה: הצפיפות האופטית של כ-0.1 שקולה לכ-107 CFU/מ"ל.</li>
</ol>2. כימות ביופילם באמצעות סגול קריסטלי
<ol><li>הוסף 200 μL inoculum לכל באר של צלחת פוליסטירן סטרילית 96 בארות (ראה טבלת חומרים) והוסף 200 μL מים deionized לכל אחת הבארות החיצוניות ביותר כדי למנוע את הבארות הפנימיות להתייבש15.</li>
	<li>הוסף 200 μL BHI מדולל פי עשרה לכל באר של אותה צלחת כמו בקרה שלילית.</li>
	<li>לדגור את הצלחת ב 25 ° C במשך 24 שעות.</li>
	<li>מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה. הערה: פיפטה רב-ערוצית היא לעתים קרובות נוחה יותר עבור דגימות מרובות.</li>
	<li>בזהירות להוסיף 300 μL PBS לכל באר ולהסיר את supernatant עם פיפטה. הערה: פיפטה רב-ערוצית היא לעתים קרובות נוחה יותר עבור דגימות מרובות.</li>
	<li>חזור על שלב 2.5 פעמיים נוספות.</li>
	<li>הוסיפו 200 μL תמיסה סגולה קריסטלית (1%) (ראו טבלת חומרים) לכל באר ודגרו ב-RT במשך 30 דקות.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.4-2.6.</li>
	<li>מוסיפים 200 μL של אתנול מוחלט לכל באר ודגרים במשך 15 דקות ב-RT. מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה מספר פעמים.</li>
	<li>מעבירים 100 μL elution מכל באר לצלחת חדשה של 96 בארות.</li>
	<li>מדוד את הספיגה ב- 595 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-צלחות (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>כאשר הספיגה עולה על 2.0, בצע דילול תקין של הדגימה לספיגה מתחת ל-2.0 באתנול מוחלט ומדוד אותה כמו בשלב 2.11. לאחר מכן, חשב את ספיגת המדגם (הערך הסופי) על ידי הכפלת הערך הנצפה בגורם הדילול.</li>
	<li>חישוב הספיגה האמיתית של הדגימות על ידי הפחתת הערך הממוצע של הבקרה השלילית מהערך של כל באר של דגימות הבדיקה על אותה צלחת באר.</li>
</ol>3. ספירת כדאיות ביופילם
<ol><li>מוסיפים 1 מ"ל אינוקולום (שלב 1) לכל באר של צלחת פוליסטירן סטרילית 12 בארות15. לדגור את הצלחת ב 25 ° C במשך 24 שעות. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה.</li>
	<li>בזהירות להוסיף 1.5 מ"ל PBS סטרילי לכל באר ולהסיר את supernatant עם פיפטה. הוסף 1 מ"ל PBS סטרילי לכל באר.</li>
	<li>יש לגרד את משטחי הקיר התחתונים והקירות של הבאר באמצעות מגרדי תאים מותאמים.</li>
	<li>העבירו את תרחיף התאים שנקטף לצינור פלסטיק סטרילי (10-1) המכיל 9 מ"ל מלוחים (0.85% NaCl) ו-10-20 חרוזי זכוכית (ראו טבלת חומרים). הערה: כדי לאסוף שאריות פסולת ביופילם שנותרו על פני השטח התחתונים של הבאר, ניתן להשהות אותה מחדש ולהעביר אותה באמצעות פיפטה באמצעות מי מלח מצינור 10-1 .</li>
	<li>מערבל את הצינור 10-1 במשך 60 שניות במהירות מקסימלית.</li>
	<li>בצע דילול סדרתי פי 10 על ידי העברת 1 מ"ל לצינור הסטרילי הבא (10-2) המכיל 9 מ"ל מלח (0.85% NaCl) עד 10-7.</li>
	<li>מורחים 100 μL מכל דילול על אגר Acinetobacter (ראה טבלת חומרים) ודגרים על צלחות האגר בטמפרטורה של 30°C למשך 24-42 שעות.</li>
	<li>ספור את מספר המושבות האדומות הטיפוסיות על כל לוח באופן ידני בטווח שבין 10 ל- 250.</li>
	<li>חשב את מספר התאים בני קיימא בביופילם של כל באר באמצעות המשוואה הבאה: תאים בני קיימא = מספר מושבות × גורמי דילול × 10</li>
</ol>4. הדמיית ביופילם באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM)
<ol><li>הוסף 200 μL inoculum לכל באר של צלחת סטרילית 96 בארות המיועדת לניתוח מיקרוסקופי.</li>
	<li>לדגור את הצלחת ב 25 ° C במשך 24 שעות.</li>
	<li>מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה.</li>
	<li>מוסיפים בזהירות 300 μL מים מעוקרים בסינון לכל באר ומסירים את הסופרנאטנט עם פיפטה.</li>
	<li>חזור על שלב 4.4.</li>
	<li>הכינו את התערובת של SYTO 9 ופרופידיום יודיד (ראו טבלת חומרים) מדוללים במים מעוקרים בסינון לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ו-60 מיקרומטר, בהתאמה.</li>
	<li>מוסיפים את התערובת לכל באר ב 200 μL ודגרים על הצלחת במשך 20-30 דקות ב RT בחושך.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.3-4.4</li>
	<li>דמיינו את הביופילמים המחוברים לפני השטח התחתונים באמצעות CLSM עם אורך גל עירור של 488 ננומטר ו-561 ננומטר וטווח אורכי גל הפליטה של 499-535 ננומטר ו-568-712 ננומטר, בהתאמה.</li>
</ol>

הערכת היווצרות ביופילם של Acinetobacter ואפיון ביופילמים

<ol><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections%3A+a+century+of+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li>
<li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675(2021).</li>
<li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter%3A+an+old+friend%2C+but+a+new+enemy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li>
<li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens%3A+Norovirus%2C+Clostridium+difficile%2C+and+Acinetobacter+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%3A+multitasking+in+a+shared+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+microbial+%26%2334%3Bprotective+clothing%26%2334%3B+in+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the microbial &#34;protective clothing&#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423(2019).</li>
<li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+drug+resistance%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li>
<li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li>
<li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714(2022).</li>
<li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%3A+genotype-phenotype+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849(2019).</li>
<li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630(2020).</li>
<li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125(2023).</li>
<li>Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li>
<li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville%2C+Tennessee%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21(2021).</li>
<li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-attached+cells%2C+biofilms+and+biocide+susceptibility%3A+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li>
<li>Ravishankar, S., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Stress+Adaptation+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. Yousef, A. E., Juneja, V. K. , (2003).</li>
<li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li>
<li>McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%3A+human+infections%2C+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li>
<li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilms%3A+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

באמצעות הפרוטוקול המתואר, היווצרות הביופילם של מבודדי Acinetobacter בדרגות שונות נמדדה, הודגמה, והוערכו התאים הקיימים בביופילמים (איור 1, איור 2 ואיור 3).
בפרוטוקול זה נעשה שימוש בשתי טמפרטורות שונות, 30 מעלות צלזיוס לגידול ו-25 מעלות צלזיוס ליצירת ביופילם של אצינטובקטר. 30 ° C שימש כי מחקרים רבים השתמשו יותר מ 30 ° C עבור הצמיחה האופטימלית של Acinetobacter, אשר יהיה מתאים כדי ל...

Acinetobacter ידוע לגרום זיהומים nosocomial, זיהום אנושי שלה, במיוחד במתקני בריאות, מדווח יותר ויותר1. היא נפוצה בבתי חולים, מתקני בריאות וסביבות הקשורות למזון 2,3,4. הוא יכול לשרוד תקופה ארוכה בסביבות הכוללות משטחי בית חולים כגון מעקות מיטה, שולחנות ליד המיטה, משטח של מכונות הנשמה וכיורים4. התמדה כזו על משטחים סביבתיים עשויה להיות אחד הגורמים המשמעותיים התורמים לזיהומים נוסוקומיאליים של Acinetobacter4.
ביופילם הוא צורה של חיים מיקרוביאליים והוא מטריצה מיקרוביאלית המורכבת מתאים מיקרוביאליים חיים וחומרים פולימריים חוץ-תאיים (EPS) מהתאים5. התאים המיקרוביאליים מוטמעים במטריצה ולעתים קרובות עמידים מאוד לעקות סביבתיות כגון חום, מלחים, יובש, אנטיביוטיקה, חומרי חיטוי וכוחות גזירה 6,7.
Acinetobacter יכול ליצור ביופילמים על משטחים, דבר המצביע על כך שהוא עשוי לתרום להישרדות ממושכת על משטחים סביבתיים, כולל משטחי בתי חולים, ועמידות משופרת לטיפול אנטיביוטי 8,9. בנוסף, היווצרות ביופילם של Acinetobacter יכול להיות קשור מאוד עם תוצאות קליניות אנושיות8. לכן, היווצרות הביופילם של זני Acinetobacter יכולה להיות אחד המדדים בניבוי הישרדות סביבתית וזיהומים אנושיים 8,10.
ניתן לכמת ולהמחיש את הביופילמים המחוברים לפני השטח כדי להעריך את היווצרות הביופילם. כדי לכמת ביופילמים המחוברים לפני השטח, הביופילמים מוכתמים בדרך כלל על ידי צבעים מכתימי ביופילם כגון סגול גבישי, והצבעים מדוללים בתמיסה ונמדדים עבור צפיפות אופטית11. הדמיה של ביופילמים היא גישה טובה נוספת להערכת היווצרות ביופילם11. שיטת הדמיה של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) המשתמשת בספציפיות באמצעות צבעים פלואורסצנטיים יכולה להיות שימושית יותר לאפיון מורפולוגיית ביופילם בהשוואה לטכניקות אחרות כגון SEM12,13.
ניתן לספור את התאים הקיימים בביופילמים כדי להעריך את מספר התאים הקיימים בביופילמים11. התאים בני הקיימא המשובצים בביופילמים מנותקים, מדוללים, מפוזרים על לוחות אגר, מודגרים וממוספרים. מכיוון שמספר התאים הגבוה יותר צפוי לעמוד במינון הזיהומי, הוא יכול לספק מידע מפורט יותר על ביופילמים, כגון פוטנציאלי זיהום הקשורים למספר התאים13,14.
מאמר זה מציג פרוטוקולים שלב אחר שלב כדי (1) לכמת ביופילמים המחוברים לפני השטח, (2) לספור תאים ברי קיימא בביופילמים, ו-(3) לדמיין את הביופילמים באמצעות CLSM של Acinetobacter. הפרוטוקולים המוצגים מתארים את השיטות להעריך את כושר הביופילם של מבודדי Acinetobacter ולאפיין את הביופילמים שלהם.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית תאים 96 בארות</td><td>SPL</td><td>30096</td><td>פוליסטירן 96 בארות צלחת</td></tr><tr><td>BHI (עירוי לב מוח) מרק</td><td>Merck KGaA</td><td>1.10493.0500</td><td></td></tr><tr><td>צלחת בסיס אגר דם</td><td>KisanBio</td><td>MB-B1005-P50</td><td>אמצעי גידול עבור Acinetobacter</td></tr><tr><td>CHROMagar Acinetobacter</td><td>CHROMagar</td><td>AC092</td><td>צלחת סלקטיבית עבור Acinetobacter</td></tr><tr><td>קריסטל סגול פתרון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V5265</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer ערכת כדאיות ביופילם חי / מת</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td>SYTO9 וקורא מיקרופלייט יודיום פרופידיום</td></tr><tr><td></td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO</td><td>מדידת ביופילם</td>NanoQuant</tr><tr><td>RBC חרוזי ציפוי זכוכית</td><td></td><td>RBC RG001</td><td>חרוזי זכוכית</td></tr> <tr><td>&mu;-צלחת 96 באר שחור</td><td>ibidi</td><td>89621</td><td>מיקרופלייט המיועד ל-CLSM</td></tr></tbody></table>

אסטרטגיות כימות, הערכת כדאיות והדמיה עבור ביופילמים של acinetobacter

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter גורם זיהומים nosocomial היווצרות biofilm שלה יכול לתרום להישרדות על משטחים יבשים כגון סביבות בית חולים. לפיכך, כימות ביופילם והדמיה הן שיטות חשובות להערכת הפוטנציאל של זני Acinetobacter לגרום לזיהומים nosocomial. ניתן לכמת את הביופילמים הנוצרים על פני השטח של המיקרו-צלחת במונחים של נפח ומספרי תאים. נפחי ביופילם ניתנים לכימות על ידי צביעה באמצעות סגול קריסטל, שטיפה, עיכוב באמצעות אתנול, ולאחר מכן מדידת הצבע המסיס באמצעות קורא microplate. כדי לכמת את מספר התאים המשובצים בביופילמים, מגרדים את הביופילמים באמצעות מגרדי תאים, קוצרים במי מלח, נסערים במרץ בנוכחות חרוזי זכוכית, ומפוזרים על אגר Acinetobacter. לאחר מכן, הצלחות מודגרות ב 30 ° C במשך 24-42 שעות. לאחר הדגירה, המושבות האדומות נמנות כדי להעריך את מספר התאים בביופילמים. שיטת ספירה בת קיימא זו יכולה להיות שימושית גם לספירת תאי Acinetobacter בביופילמים של מינים מעורבים. ניתן להמחיש ביופילמים של Acinetobacter באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. מיקרו-צלחת זמינה מסחרית המיועדת לניתוח מיקרוסקופי משמשת ליצירת ביופילמים. לאחר מכן, הביופילמים המחוברים לפני השטח התחתונים מוכתמים בצבעי יודיד SYTO9 ופרופידיום, נשטפים, ואז מוצגים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

בעקבות הפרוטוקול, הביופילמים של Acinetobacter isolates, שבודדו במקור ממשטחי מטבח, נוצרו על צלחת פוליסטירן בעלת 96 בארות, מוכתמת בסגול קריסטל, והצבעים היו מסיסים באתנול ונמדדו למסת ביופילם (איור 1). מספר הביופילמים השתנה מאוד בהתאם לזנים שנעו בין OD 0.04 ל-1.69 (איור 1). בהתבסס על הקריטריונים שנקבעו על ידי סטפנוביץ' ואחרים 16, כל המבודדים למעט A. bouvetii יצרו ביופילמים. A. radioresistens יצר ביופילם חלש. A. ...

פרוטוקול זה מתאר את הכנת החיסון, כימות הביופילם על לוחות מיקרוטיטר באמצעות צבע סגול גבישי, הספירה בת קיימא בביופילמים והדמיה של ביופילמים של אסינטובקטר.

אסטרטגיות כימות, הערכת כדאיות והדמיה עבור ביופילמים של Acinetobacter

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

ביופילמים מורכבים מתאים מיקרוביאליים חיים וקשה להסיר אותם מהמשטחים. זני Acinetobacter הנפוצים בסביבה שלנו, גרימת זיהומים nosocomial, ידועים גם ליצור biofilms על משטחים. לכן, אנו שואפים לפתח שיטות הן לכמת והן לדמיין ביופילמים של Acinetobacter.הפרוטוקול שלנו מספק שיטה פשוטה וקלה לכימות והדמיה של הביופילמים של Acinetobacter. מספר התאים הבר-קיימא בתוך הביופילמים מכומת באמצעות שיטת הספירה בת הקיימא. ממצאי המחקר שלנו מגלים כי לזנים הווקטוריים של Acinetobacter הקיימים באופן טבעי יש פוטנציאל שונה למדי ליצירת ביופילם.כמו כן, יהיו הבדלים מורפולוגיים ברורים בין הביופילמים השונים. זה סלל את הדרך למחקר שהתמקד בגורמים לשונות כה גדולה בין זני Acinetobacter.

quantification-viability-assessment-visualization-strategies-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: טיי, ס. ב. ואחרים. הפרעה אנטי-וירולנטית של ביופילמים פתוגניים באמצעות לקטונאזות מהונדסות לכיבוי קוורום.  J. Vis. Exp. (2016)הסרטון מדגים שיטה לכימות ביומסה ביופילמית בחיידק פתוגני, תוך השוואת מערכות ביקורת לא מטופלות לדגימות שטופלו באנזים שמדביר קווארום. האנזים משבש את איתות החיידקים במהלך הדגירה המוקדמת, ומפחית את ההיצמדות של התא. לאחר שטיפה והמשך דגירות, בארות הבקרה יוצרות ביופילמים צפופים, בעוד שבארות מטופלות מראות היווצרות מופחתת. צבע קטיוני משמש לצביעת הביופילם, ונמדד ספיגה להערכת...

כימות דיכוי ביופילם המושר על ידי אנזימים בחיידקים פתוגניים

מוצג פרוטוקול לכימות והשוואה בו-זמנית של שלושה רכיבים תאיים וחוץ-תאיים בתוך ביופילמים. המתודולוגיה כוללת שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, תוכנת ניתוח והדמיה מבנית של ביופילם ותוכנת ניתוח סטטיסטי.

כימות בו-זמני של רכיבים תאיים וחוץ-תאיים של ביופילמים

מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את השימוש במערכת microfluidic לפיתוח biofilms רב-מינים המכילים מינים מזוהים בדרך כלל ברובד השיניים supragingival אנושי. שיטות לתיאור ארכיטקטורת biofilm, כדאיות biofilm, וגישה לbiofilm קציר לניתוחים תלוית תרבות או תרבות העצמאית מודגשות.

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

מחקר זה מציג את הפיתוח של מתודולוגיות הניתנות לשחזור לחקר מעכבי ביופילם והשפעותיהם על Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של התפתחות הביופילם לאחר חשיפה לגורמי מארח באמצעות מודל תא שקופיות. מודל זה מאפשר הדמיה ישירה של התפתחות ביופילם וכן ניתוח פרמטרים של ביופילם באמצעות תוכנות מחשב.

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

שינויים אנטי-מיקרוביאליים בארכיטקטורת הביופילם Pseudomonas aeruginosa שונים בין מבודדים קליניים שגודלו בתרבית מחולים עם סיסטיק פיברוזיס וזיהום ריאתי כרוני. לאחר מיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן להשתמש בתוכנת COMSTAT כדי לכמת וריאציות בארכיטקטורת ביופילם (למשל, שטח פנים, עובי, ביומסה) עבור מבודדים בודדים כדי להעריך את היעילות של חומרים אנטי זיהומיים.

כימות ההשפעות של אנטי-מיקרוביאלים על ארכיטקטורת ביופילם במבחנה באמצעות תוכנת COMSTAT

ניתן להשתמש במדיום כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) בשילוב עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות כדי לצפות באגרגטים חיידקיים ברזולוציה גבוהה. מאמר זה מפרט שיטות להערכת אוכלוסיות מצטברות במהלך טיפול מיקרוביאלי כפלטפורמה למחקרים עתידיים.

כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה

פרוטוקול זה מתאר גישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות להערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים בתעשיית החלב. גישה זו עשויה לשמש גם לבדיקת יעילותן של פורמולציות ביולוגיות או כימיות חדשות לשליטה בביופילמים.

הערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים חלביים בגישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מודולרי מסוג BSL-2 המשלב בדיקות ביומסה קריסטל-סגולה, קינטיקת פאזה-ניגודיות טיים-לאפס, מיפוי קונפוקלי תלת-ממדי/מטריצות, מבנה SEM אולטרה-סטרוקטיבי, ומודול זיהום אוגר ב-vivo לטיפוח, כמות, אפיון וחקר תפקיד פונקציונלי של ביופילם לפטוספירה , ומאפשר הערכה סטנדרטית של מוטנטים והתערבויות אנטי-ביופילם במעבדות.

תהליך עבודה מודולרי לניתוח כמותי, מבני ופונקציונלי של ביופילמים של לפטוספירה

למד אסטרטגיות כימות והדמיה לביופילמים של Acinetobacter באמצעות צבע קריסטל ויולט ומיקרוסקופיה קונפוקלית. השיטה חושפת שונות משמעותית ביצירת ביופילם בין זני החיידק השונים.

אסטרטגיות כימות, הערכת כדאיות והדמיה עבור ביופילמים של Acinetobacter

גלה סרטונים נוספים