Name: גישת הדמיה תוך-חיונית יעילה לניטור ארוך טווח של דינמיקה של רקמת אפיתל במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: למדו שיטת הדמיה תוך-חיונית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לניטור דינמיקת תאי עור בעכברים חיים. השיטה מאפשרת מעקב ממושך אחר התנהגות תאית בתנאי הומיאוסטזיס ומחלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לוולנטינה גרקו על עכברי K14-mCherry-H2B. אנו אסירי תודה לחנות המכונות של המחלקה לפיזיקה באוניברסיטת אמורי על יצירת דיסקיות כיסוי הזכוכית. עבודה זו מומנה על ידי פרס פיתוח קריירה #IK2 BX005370 מהמחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב BLRD Service ל-LS, פרסי NIH RF1-AG079269 ו-R56-AG072473 ל-MJMR, ופרס I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award ל-MJMR.

מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אמורי והמרכז הרפואי לענייני חיילים משוחררים באטלנטה ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).
1. התקנת עלון ההדמיה החיה על במת המיקרוסקופ ההפוך
<ol><li>בנה את ההוספה באמצעות קובצי .stl (קובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3) המציינים את הממדים והעיצוב התלת-ממדיים (ראה איור 1 ואיור 2A), מדפסת תלת-ממד וחומצה פולילקטית (PLA).</li>
	<li>הניחו בזהירות את האינסרט (איור 2B,C) בחריץ הגדול של שלב המיקרוסקופ (איור 2C ואיור 3A). השתמשו בברגים כדי לאבטח את האינסרט באמצעות ארבעה חורי ברגים הממוקמים בכל פינה של האינסרט (איור 2B-C). הערה: העלון הוא דו-כיווני וניתן לסובב אותו ב-180° בהתאם לכיוון שלב המיקרוסקופ ומנגנון ההרדמה.</li>
	<li>החליקו את לוחית החום לתוך תקע ההוספה כלפי מטה (איור 2D) כך שהיחידה תניח על גבי חריצי ההוספה התחתונים כשיציאת התקע עוברת מתחת לשלב (איור 3B).</li>
	<li>יישרו את הפתח העגול והמחורץ באינסרט עם יעד טבילה של שמן סיליקון 40x (איור 3C) ומרחו שמן סיליקון על מרכז המטרה.<ol><li>אם ההדמיה נמשכת פרקי זמן ארוכים יותר (>1 שעות), יש למרוח כמות נדיבה של שמן שתישאר בממשק הכיסוי/אובייקטיבי לאורך כל ההדמיה. אין לאפשר לשמן להישפך על קצוות העדשה.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמשו במזרק כדי למרוח כמות קטנה של שומן ואקום לאורך הפתח העגול והמחורץ והניחו את דיסק הכיסוי מעליו כדי לאטום את האינסרט (איור 3D). הערה: דיסק הכיסוי נוצר על ידי הסרת הדפנות של צלחת תרבית תאים בתחתית זכוכית בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ (מבוצעת על ידי חנות מכונות).</li>
	<li>מרימים את המטרה פי 40 עד שהשמן נושק לתחתית מכסה הזכוכית.</li>
</ol>2. תצורת איזופלורן והכנת עכבר
<ol><li>מקם את רכיבי הוופורייזר האלקטרוני בזרימה נמוכה (תא הרדמה, צינורות, וופורייזר, מיכל פחם) כדי לאפשר לקונוס האף ולצינורות המחוברים להגיע לאינסרט (איור 3A). אזהרה: איזופלורן הוא חומר הרדמה באינהלציה ויש לטפל בו בזהירות כדי למנוע שפיכות ולמזער את החשיפה לבני אדם.</li>
	<li>יש למדוד את משקל בקבוק האיזופלורן לפני השימוש ולתושם. חברו את הפקק מהוופורייזר האלקטרוני לבקבוק האיזופלורן.</li>
	<li>חבר את כבל החשמל למכשיר האידוי האלקטרוני. סגרו את אטבי חרוט האף הכחולים ופתחו את אטבי תא האינדוקציה הלבנים כדי לאפשר זרימת אוויר דרך התא לתוך מכל הפחם. הסר את מכסה האוויר האדום מצדה השמאלי של ההתקן כדי לאפשר זרימת אוויר.</li>
	<li>אפשר למערכת להתחמם במשך 5 דקות ב-200 מ"ל/דקה (זרימה נמוכה) ו-2% איזופלורן. הערה: למרות שהגדרת חרוט האף נבחרה, קו חרוט האף הכחול צריך להישאר סגור, וקו תא האינדוקציה הלבן צריך להישאר פתוח.</li>
	<li>ברגע שהמערכת מאוזנת כראוי, נקה את הקווים כדי להסיר את שאריות האיזופלורן מהחדר.</li>
	<li>מקם את העכבר בתא האינדוקציה ובחר זרימה גבוהה. השלם את כל הכנת העכבר (כלומר, הסרת שיער, אספקת תרופות מקומית, מריחת משחת עיניים וכו ') לפני הנחת גוף בעל החיים על גבי העלון. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין באמצעות שיטת רפלקס צביטת הבוהן.<ol><li>כאשר הרגל מורחבת, השתמש בציפורן כדי לצבוט בחוזקה את הבוהן מבלי לגרום נזק פיזי. אם העכבר מפגין תגובה חיובית לגירוי (כלומר, נסיגה ברגל, עווית ברגל וכו '), המשך לתת הרדמה בתוך החדר עד שלא נצפתה תגובה. לאחר הרדמה מתאימה, קצב נשימת העכבר צריך להאט ל~ 55-65 נשימות לדקה18.</li>
	</ol></li>
	<li>כאשר העכבר מורדם לחלוטין, בחר שוב זרימה גבוהה כדי לעצור את העברת האיזופלורן. נקו את התא לפני פתיחתו וכווננו את האטבים (כחול: פתוח; לבן: סגור) כדי להעביר איזופלורן דרך חרוט האף. בחר זרימה נמוכה כאשר חרוט האף מחובר לעכבר כדי להמשיך בהעברת איזופלורן.</li>
	<li>צינורות איזופלורן חוט עם חרוט האף המחובר דרך תושבת הצינור הפינתי באינסרט (איור 3A ואיור 5).</li>
</ol>3. מיקום העכבר על העלון לצורך הדמיה תוך חיונית
<ol><li>חברו את פלטת החום לבקר (המכילה בדיקה אנאלית מחוברת), הפעילו אותה ואפשרו לצלחת להגיע לטמפרטורה של 36°C (איור 4A).</li>
	<li>הוציאו את העכבר המרדים מתא האינדוקציה ושכבו על פלטת החום (איור 4B ואיור 5A). בצע את ההעברה מהחדר להחדרה במהירות כדי למזער את הזמן שהעכבר פעיל ללא הרדמה ממסים נדיפים.</li>
	<li>הצמידו את חרוט האף לעכבר (איור 4B,C ואיור 5). במידת הצורך, השתמש בסרט כדי לאבטח עוד יותר את הזווית והמיקום של חרוט האף.</li>
	<li>הכנס את הבדיקה האנאלית וכוונן את טמפרטורת הבקר עד שטמפרטורת גוף העכבר יציבה ב~36 מעלות צלזיוס (איור 4A,B). לאחר שהעכבר ממוקם כראוי, השתמשו בניילון נצמד כדי ללכוד חום, במידת הצורך, כדי לתמוך עוד יותר בטמפרטורת הגוף המתאימה (איור 4C).</li>
	<li>מקם את העכבר כך שהראש יתיישר עם דיסק הכיסוי והכנס את האוזן למרכז מכסה הזכוכית באמצעות אטב אוזניים מתכתי (איור 5A,B) או סרט (איור 5C). הערה: ניתן לכוונן את הלחץ של אטב האוזן המתכתי על האוזן על-ידי שחרור הבורג שמחבר את האטב לעלון. ניתן להוסיף קפיץ מתכת לגמישות הידוק קליפס מוגברת.<ol><li>כדי לשנות את מיקום אטב האוזן, פתחו את הברגת הבורג באמצעות מפתח אלן בקוטר 2.5 מ"מ והעבירו אותו לאתר המשני (איור 2B,C). בעת הרכבה מחדש של אטב האוזן, הניחו את האטב כנגד העלון, ולאחר מכן את מכונת הכביסה מעליו. השתמש בבורג כדי להדק היטב את התפס בכוח קל כדי לסובב את התפס.</li>
	</ol></li>
	<li>התאימו את מיקום ה-z האובייקטיבי עד שהתאים יהיו בתוך מקום המוקד (איור 6A,D). הגדר את הפרמטרים z-stack ו- time-lapse בהתאם למטרות הניסוי והתחל ברכישת תמונה. הערה: אם הושגה ההגדרה הנכונה, ניתן לצלם את אוזן העכבר במשך 3 שעות רצופות לפחות (איור 6A',D).<ol><li>לאחר קביעת גבולות מחסנית z, כוונן את עוצמת הלייזר ואת הרווח כדי להבטיח שאף מישור z אינו רווי יתר על המידה כדי למזער את ההלבנה. קבע את פרמטרי קיטועי הזמן באמצעות העובי הכולל של ערימת z, מספרי צעדים (מומלץ דגימת Nyquist) ומרווחי זמן.</li>
		<li>לקבוע את פרמטרי ההדמיה (מרווחי זמן, זמן הדמיה כולל וכו ') באמצעות גורמים מרובים, כולל כדאיות בעלי חיים תחת הרדמה, הלבנה / פוטוטוקסיות המושרה בלייזר, והמטרה של הדמיה חיה (כלומר, דינמיקה של חלוקת תאים, אינטראקציות תא-תא וכו ').</li>
	</ol></li>
</ol>4. הפסקת הדמיה
<ol><li>הפעל את כרית החום במחזור המים והגדר למחזור רציף ו- 35 ° C למשך 30 דקות לפחות לפני סיום רכישת התמונה.</li>
	<li>בסיום ההדמיה, בחר זרימה נמוכה במכשיר האידוי האלקטרוני כדי לעצור את העברת האיזופלורן ולהעביר את העכבר לכרית חום עד לאמבולטורי.</li>
	<li>לאחר התעוררות, החזירו את העכבר למיכל ההעברה תוך המשך שמירה על כרית חום עד לאמולטורי מלא. נטר באופן עקבי את העכבר בזמן שהוא על כרית החום עד שהוא מגיב.</li>
	<li>במכשיר האידוי האלקטרוני, לחץ על בחר תפריט > בקרת הרדמה > ריק. הסר את בקבוק האיזופלורן מהמערכת והחזיר את פקק היצרן לבקבוק.</li>
	<li>מדדו את משקל בקבוק האיזופלורן ומיכל הפחם והכניסו משקולות לבול עץ. לאחר שמיכל הפחם שוקל 50 גרם מעל המדידה הבסיסית, השליכו את המיכל והחליפו אותו ביחידה חדשה. החזר את האיזופלורן לתיבת הנעילה.</li>
	<li>הסר את דיסק הכיסוי ונגב באמצעות נייר עדשה ותמיסת עדשה. יש לאחסן כראוי כדי למנוע שריטות לשימוש חוזר.</li>
	<li>הסר את צינורית ההרדמה מתושבת ההחדרה ופתח את ההברגה משלב המיקרוסקופ.</li>
</ol>

הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופ הפוך למעקב אחר דינמיקה של תאי עור

<ol><li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li>
<li>Nal Chen,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196(2022).</li>
<li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li>
<li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+imaging+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li>
<li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li>
<li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li>
<li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li>
<li>Pal Arndt,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra%2Fextraglomerular+feedback+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787(2022).</li>
<li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li>
<li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li>
<li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008(2011).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021(2016).</li>
<li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li>
<li>Ral Li,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Tal Tumbar,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563(2011).</li>
<li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634(2023).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המאפשר הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של אפיתל עור עכבר שלם על גבי מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים. המצאה זו עשויה PLA, שהוא החומר הנפוץ ביותר וזול ביותר להדפסה תלת מימדית; כל עלויות הדפסת התלת-ממד הפנימיות עבור עלון זה מסתכמות ב-<$5. את שני חלקי ההוספה הנפרדים (איור 1, קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2) ניתן להרכיב בקלות באמצעות ברגים קבועים (ראו טבלת חומרים). יש לציין כי קבצי .stl שסופקו יכולים לשמש גם להזמנת הוספה ז...

מיקרוסקופיה תוך-חיונית היא כלי רב עוצמה המאפשר ניטור של התנהגויות תאים בסביבות in-vivo שאינן מוטרדות. שיטה ייחודית זו סיפקה תובנות מפתח על פעולתן הפנימית של מערכות איברים מורכבות של יונקים, כולל ריאות1, מוח2, כבד3, בלוטת חלב4, מעי5 ועור6. יתר על כן, גישה זו חשפה שינויים התנהגותיים בתאים במהלך התפתחות הגידול7, ריפוי פצעים8,9, דלקת10, ופתולוגיות מגוונות אחרות באתרן. במחקר זה אנו מתמקדים בשיפור הנגישות של מיקרוסקופ תוך-חיוני לדימוי דינמיקה חיה של אפיתל וסטרומה בעור עכבר שלם. הבנת התנהגויות תאים בעור יונקים היא בעלת חשיבות קלינית גבוהה בשל יכולת ההתחדשות והגידול המדהימה של רקמה זו.
הדמיה תוך-חיונית בעכברים בוצעה בעיקר באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון זקוף בשל יכולתם לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה בעומקי רקמות >100 מיקרומטר11,12. עם זאת, מכשירים אלה חסרים את הרבגוניות של סוס העבודה ואת הנגישות הכללית יותר של מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים, שהם ידידותיים יותר למשתמש וחסכוניים יותר, מספקים את היכולת לצלם תאים בתרבית, אינם דורשים חושך מוחלט במהלך רכישת תמונה, והם בדרך כלל בטוחים יותר, בין יתרונות בולטים אחרים13,14. במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המשפר באופן משמעותי את נגישות ההדמיה התוך-חיונית על ידי התאמת גישה זו למיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים.
כאן, אנו מציגים עיצוב של עלון במה מותאם אישית המודפס בתלת-ממד המשלב מספר תכונות עיקריות כדי להקל על הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של עור אוזני עכבר במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך (איור 1, איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5). תכונות מיוחדות אלה כוללות חור אובייקטיבי אופסט המאפשר את כל הגוף של עכבר בוגר לשכב שטוח לחלוטין במהלך ההדמיה. זה ממזער את הפרעות הרטט של תנועות גוף העכבר בהדמיה ומבטל את הצורך לתת קטמין וקסילזין כדי לדכא את הנשימה, תרגול שלעתים קרובות משולב עם הדמיה תוך חיונית6. בנוסף, סוגריים פינתיים בעלון ממקמים נכון חרוט אף איזופלורני כדי ליישר קו עם פני העכבר, אטב אוזניים מתכתי משתק את אוזן העכבר לדיסק כיסוי שנבנה בהתאמה אישית, ופלטת חום ביופידבק אופציונלית בלולאה סגורה הניתנת להסרה מונחת בתוך העלון כדי לתמוך בטמפרטורת גוף העכבר במהלך מפגשי הדמיה ארוכים. דיסק הכיסוי המותאם אישית, המספק משטח שטוח החיוני לראש העכבר ולאוזן לשכב שטוחים, נוצר בחנות מכונות על ידי הסרת הדפנות של צלחת תרבית תאים גנרית המכילה כיסוי. השימוש בעדשת טבילה בשמן סיליקון 40x (צמצם מספרי 1.25 [N.A.], מרחק עבודה של 0.3 מ"מ) בשילוב עם דיסק הכיסוי ותוספת הבמה המותאמת אישית מספק תמונות ברזולוציה גבוהה >50 מיקרומטר עמוק לתוך הדרמיס של האוזן.
כדי לבחון את הפונקציונליות של שלב המיקרוסקופ ההפוך החדש הזה, לכדנו ערימות z המשתרעות על פני כל שכבות אפיתל האפידרמיס במהלך זמן של 3 שעות באוזן של עכבר בוגר חי מהונדס K14-H2B-mCherry15 (גרעיני אפיתל בקו העכבר הזה מכילים תווית פלואורסצנטית אדומה) (איור 6A-A'). לכדנו גם ערימות z המשתרעות על פני מספר שכבות פיברובלסטים בתוך דרמיס העור במהלך 3 שעות באוזן של Pdgfra-rtTA16 מהונדס חי; pTRE-H2B-GFP17 עכבר בוגר (גרעיני פיברובלסטים בקו העכבר הזה מכילים תווית פלואורסצנטית ירוקה לאחר השראת דוקסיציקלין) (איור 6B-D'). הנתונים ברזולוציה גבוהה שלנו מראים יציבות עקבית על ידי חוסר סחף במישורי x, y ו- z, ובכך מוכיחים את יעילותו של כלי הדמיה תוך חיוני חדש זה לשימוש במיקרוסקופים הפוכים. חשוב לציין, ניתן להתאים את הממדים של תוספת שלב זו המודפסת בתלת-ממד, כמתואר בקובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3, כך שיתאימו לכל מיקרוסקופ הפוך, וניתן להעביר את מיקום פתח המטרה למיקומים חלופיים בתוך העלון כדי להתאים טוב יותר להדמיית רקמה מסוימת ו/או מודל בעל חיים מעניין. המצאה זו יכולה אפוא להעצים מעבדות בודדות, או חוקרים עם גישה קונפוקלית למתקני הליבה, להתאים כלי זה לצרכי הדימות התוך-חיוניים הייחודיים שלהם, ובכך לייעל את ההערכה של ביולוגיה מגוונת של התא in vivo.

<table><tbody><tr><td>מדפסת תלת מימד</td><td>Qudi Tech</td><td>i-Fast</td><td>הדפסות תלת מימד באמצעות חומר PLA</td></tr><tr><td>40x 1.25NA עדשת אובייקטיבית סיליקון</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxR סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספוגית כותנה</td><td>VWR</td><td>76337-046</td><td>יישום קרם / משחה</td></tr><tr><td>דוקסיציקלין היקלאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9891</td><td>גורם לתיוג GFP של גרעיני פיברובלסטים ב-Pdgfra-rtTA; עכברי pTRE-H2B-GFP</td></tr><tr><td>מברג שטוח (2.5 מ"מ)</td><td></td><td></td> <td>הכנס אפיקס למיקרוסקופ</td></tr><tr><td>ברגים שטוחים x 4 (#6-32)</td> <td>ניקון</td><td></td><td>בורג הכנס למיקרוסקופ</td></tr><tr><td>זכוכית תחתונה תרבית צלחת</td><td>chemglass מדעי החיים</td><td>CLS-1811-002</td><td>שונה על ידי הסרת קירות הכלי לשימוש כדיסק כיסוי תואם להכנסה חיה; דיסק ברוחב 35 מ"מ מכיל כיסוי זכוכית ברוחב 20 מ"מ; קירות הכלים היו הוסר על ידי</td></tr><tr><td>חנות מכונות בקר לוחית חום</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2LV</td><td>בקר טמפרטורת בעלי חיים - מתח נמוך; חיבור בדיקה אנאלי לניטור טמפרטורת גוף העכבר</td></tr><tr><td>מפתח משושה (1.5 מ"מ)</td><td></td><td></td> <td>לכוונון בורג M3</td></tr><tr><td>מפתח משושה (2.5 מ"מ)</td><td></td><td></td> <td>התאם את המתח על קליפ אוזן מתכת</td></tr><tr><td>הכנס</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>הדמיה תוך-חיוניתIsoflurane</td><td>Med-Vet International</td><td>HPA030782-100uL</td> סרט תיוג <td>הרדמה לעכבר</td></tr><tr><td>(או סקוטש)</td> <td>VWR</td><td>10127-458</td><td>אלטרנטיבה לקליפ אוזניים ממתכת לקיבוע אוזן לכיסוי</td></tr><tr><td>אטב</td><td></td><td></td> מתכת <td>המשמש כאטב אוזניים</td></tr><tr><td>עכבר: C57BL / 6-Pdgfraem1 (rtTA) Xsun / J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>RRID: IMSR_JAX: 034459</td><td>מקדם ספציפי לפיברובלסט המניע ביטוי rtTA המעורר דוקסיציקלין</td></tr><tr><td>עכבר: K14-H2BPAmCherry</td><td>באדיבות ד"ר ולנטינה גרקו מאוניברסיטת</td><td></td> ייל <td>מסמן גרעיני תאי אפיתל אפידרמיס עם mCherry; מכונה בטקסט "K14-H2B-mCherry"</td></tr><tr><td>עכבר: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>RRID: IMSR_JAX:005104</td><td>&nbsp; תוויות גרעיני פיברובלסטים עם GFP בשילוב עם Pdgfra-rtTA ומושרה עם דוקסיציקלין</td></tr><tr><td>עטיפת איטום רב תכליתית</td><td>שמחה להגביר</td><td></td><td>את חום העכבר</td></tr><tr><td>Optixcare</td><td>VWR</td><td>MSPP-078932779</td><td>ברגי סט חומר סיכה לעיניים</td></tr><tr><td>x 3 (M3; 6 מ"מ)</td> <td>Thorlabs</td><td>SS3M6</td><td>חיבור למודול לוח חום</td></tr><tr><td>שמן</td><td></td><td></td> טבילה סיליקון <td>מוחל על 40x סיליקון אובייקטיבי</td></tr><tr><td>צלחת חימום בעלי חיים קטנים</td><td>Physitemp</td><td>HP-4M</td><td>מספק חום לבעלי חיים</td></tr><tr><td>Somnoflow וופורייזר אלקטרוני בזרימה נמוכה</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>SF-01</td><td>הרדמת עכבר</td></tr><tr><td>גריז ואקום</td><td>Flinn Scientific</td><td>AP1095</td><td>אוטם כיסוי דיסק להכנסת</td></tr><tr>הסרת שיער<td>Veet</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>כרית חום במחזור מים</td><td>Stryker Medical</td><td>TP700</td><td>להחייאת עכבר לאחר הדמיה</td></tr></tbody></table>

גישת הדמיה תוך-חיונית יעילה לניטור ארוך טווח של דינמיקה של רקמת אפיתל במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

הבנת התנהגויות נורמליות וחריגות של תאי in vivo נחוצה לפיתוח התערבויות קליניות לסיכול התחלת המחלה והתקדמותה. לכן חיוני לייעל גישות הדמיה המאפשרות תצפית על דינמיקה של תאים באתרם, כאשר מבנה הרקמה והרכבה נותרים ללא הפרעה. האפידרמיס הוא המחסום החיצוני ביותר של הגוף, כמו גם המקור לסרטן האנושי הנפוץ ביותר, כלומר קרצינומה עורית של העור. הנגישות של רקמת העור מהווה הזדמנות ייחודית לנטר התנהגויות אפיתל ותאי עור בבעלי חיים שלמים באמצעות מיקרוסקופ תוך-חיוני לא פולשני. עם זאת, גישת הדמיה מתוחכמת זו הושגה בעיקר באמצעות מיקרוסקופים רבי-פוטונים זקופים, המהווים חסם כניסה משמעותי עבור רוב החוקרים. מחקר זה מציג עלון במה מותאם אישית למיקרוסקופ מודפס בתלת-ממד המתאים לשימוש עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, ומייעל את ההדמיה התוך-חיונית ארוכת הטווח של עור האוזן בעכברים טרנסגניים חיים. אנו מאמינים כי המצאה רב-תכליתית זו, אשר עשויה להיות מותאמת אישית כך שתתאים למותג המיקרוסקופ ההפוך ולדגם המועדף ותותאם לתמונות של מערכות איברים נוספות, תוכיח את עצמה כבעלת ערך רב לקהילת המחקר המדעי הגדולה יותר על ידי שיפור משמעותי של הנגישות של מיקרוסקופיה תוך חיונית. התקדמות טכנולוגית זו היא קריטית לחיזוק הבנתנו את הדינמיקה של תאים חיים בהקשרים נורמליים ומחלות.

הרכבה נכונה של עלון הדמיה חיה במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך והתמצאות מתאימה של עכבר מהונדס על גבי העלון מאומתת על ידי רכישת ערימות z של רקמת אוזן חיה עם תווית פלואורסצנטית לאורך מסלול זמן ≥1 שעות עם עדות מינימלית לסחף בצירי x, y ו-z. יש לצלם תמונות במרווחי זמן קבועים (זמן המרווח יהיה תלוי בשאלה הביולוגית, עוצמת האות הפלואורסצנטי וכו ') כך שניתן יהיה לעקוב אחר דינמיקת התא וסחף התמונה לאורך זמן. במהלך הזמן, ניטור של מישורי Z בודדים כדי לוודא שהם נשארים בפוקוס מגלה אם תנועת בעלי חיים מפריעה ליציבות ההדמיה. דוגמה למישורי z בודדים...

הפרוטוקול מציג כלי חדש לפישוט הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

פיתחנו כלי לביצוע הדמיה תוך-חיונית בעכברים חיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך. זה מאפשר לנו לעקוב אחר הדינמיקה של תאי העור במהלך הומאוסטזיס ולהשוות התנהגויות תאים במהלך הופעת המחלה והתקדמותה. מיקרוסקופ מולטיפוטונים הוא הגישה העיקרית המיושמת להשגת מעקב תאים תוך חיוני.עם זאת, החסרונות של מיקרוסקופים אלה כוללים רב-תכליתיות מוגבלת של הדמיה יומיומית, עלות גבוהה ומורכבות טכנית. הכלי החדש שלנו מאפשר שימוש במיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים רב-תכליתיים לדימות תוך-חיוני in vivo. על ידי שינוי קובץ העיצוב, ניתן להתאים אישית את מידות הוספת הבמה כך שיתאימו לכל סוג של מיקרוסקופ הפוך.ניתן לשנות את גודל החור האובייקטיבי ולמקם אותו מחדש כך שיתאים לכל דגם ורקמה לפי בחירתו של בעל חיים.

streamlined-intravital-imaging-approach-for-long-term-monitoring

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

סרטון זה מדגים הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתליאליים γδ (IELs) בעכברים טרנסגניים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. ההליך הכירורגי כולל יצירת קו ניקוב וביצוע חתך אורכי כדי לחשוף את רירית המעי ואת villi. העכברים הטרנסגניים מבטאים חלבוני כתב באופן בלעדי ב-γδ IELs, מה שמאפשר מעקב אחריהם. הדמיה תוך-חיונית לוכדת את התנועה הדינמית של γδ IEL ירוק המסומן בפלואורסצנטיות לאורך קרום המרתף של תא האפיתל של המעי.

הדמיה תוך חיונית של לימפוציטים תוך-אפיתליאליים של גמא דלתא

גישה חדשה המשלבת השתלת תוך עיני ומיקרוסקופיה confocal מאפשרת הדמית אורכית, לא פולשנית בזמן אמת עם רזולוצית תא בודד בתוך רקמות...

השתלה ללשכה הקדמית של העין לאורך, לא פולשני<em&gt; בחי</em&gt; הדמיה ברזולוצית תא בודד בזמן אמת

המטריצה ​​תאית עוברת שיפוץ משמעותי בריפוי פצעים, דלקות והיווצרות גידול. אנו מציגים גישה מיקרוסקופית immunofluorescence intravital רומן כדי להמחיש את הדינמיקה של סיבי, כמו גם רכיבי מטריצת רשת כמו עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות epifluorescence או שני פוטונים במיקרוסקופ.

לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופיה מולטיפוטונית לביצוע הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה של תא בודד של הריאה השלמה בזמן אמת באמצעות חלון הדמיה מיוצב ואקום.

לטווח ארוך ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית Intravital בריאה עם חלון הדמיה מיוצב אבק

פרוטוקול זה מתאר את הדמיה intravital של העכברים הטרנסגניים לבטא סמני פלואורסצנט תאים ספציפיים. הדמיה intravital מספק שיטה לא פולשנית ברזולוציה גבוהה תצפיות בבעלי חיים באמצעות windows מושתלת שדרכו החזיית תהליכים מיקרוסקופיים אפשרית. שיטה זו שימושית במיוחד ללמוד תהליכים האורך.

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

אנו מתארים שיטה כדי להמחיש gfp γδ iels התווית באמצעות הדמיה intravital של המעי הדק מורטין על ידי מיקרוסקופית הפוכה דיסק מיקרוסקופ קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת מעקב של תאים חיים בתוך רירית עד 4 h והוא יכול לשמש כדי לחקור מגוון של אינטראקציות מעיים החיסונית-אפיתל.

אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין

תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acriflavine ו rhodamineB-dextran) של עכברים מרדימים הוא תמונה עד רזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופית confocal.

גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל

כאן מוצגת גישה להדמיה תוך-ורידית ארוכת טווח באמצעות חלונות סיליקון שקופים אופטית, הניתנים להדבקה ישירות לרקמה/איבר המעניין ולעור. חלונות אלה זולים ורב-תכליתיים יותר מאחרים הנהוגים כיום בשטח, וההחדרה הכירורגית גורמת לדלקת מוגבלת ולמצוקה לבעלי החיים.

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

גיוס לויקוציטים וטסיות דם מהווה מרכיב חיוני הדרוש לצמיחה יעילה של עורקי בטחונות במהלך העורקים. מיקרוסקופ מולטיפוטון הוא כלי יעיל למעקב אחר דינמיקה של תאים עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה in vivo ופחות רעילות לאור לחקר גיוס לויקוציטים ואקסטרווסציה במהלך העורקים.

הדמיה תוך-חיונית מולטיפוטון לניטור גיוס לויקוציטים במהלך דלקת עורקים במודל מורין גפיים אחוריות

למדו שיטת הדמיה תוך-חיונית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לניטור דינמיקת תאי עור בעכברים חיים. השיטה מאפשרת מעקב ממושך אחר התנהגות תאית בתנאי הומיאוסטזיס ומחלה.

גישת הדמיה תוך-חיונית יעילה לניטור ארוך טווח של דינמיקה של רקמת אפיתל במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך

גלה סרטונים נוספים