Name: שונה בבדיקת תקע גל מטריצת Vivo למחקרי אנגיוגנזה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: למד שיטה מודифיקציה של מטריצת ג'ל פלאג להערכת אנגיוגנזה וחדירות כלי דם אינ ויוו. השיטה מאפשרת הדמיית כלי דם חדשים באמצעות דקסטרן-FITC ללא צורך בצביעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג (LY22H020005), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81873466).

כל הנהלים המערבים נבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו (XMSQ2021-0057, 19 ביולי 2021). כל הריאגנטים והחומרים המתכלים מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת מדיום תרבות
<ol><li>מדיום תרבית M199 10x: יש להמיס אבקת M199 לריכוז של פי 10 עם 90 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה ולהוסיף 10 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), ולאחר מכן לעבור דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.</li>
	<li>מדיום תרבית אנדותל מלא: הוסף 50 מ"ל של FBS, 5 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין, ו-5 מ"ל של תוספת גדילה של תאי אנדותל ל-460 מ"ל של תווך תאי אנדותל (ECM). יש לאחסן את המדיום ב-4°C למשך עד חודש אחד.</li>
</ol>2. הכנת תאי כלי דם
<ol><li>תרבית 1 x 105 תאי כלי דם (תאי אב אנדותל ראשונייםבתרבית 14, תאי אנדותל, או קווי תאי אנדותל) עם 8 מ"ל של תרבית אנדותל מלאה בינונית בצלחת תרבית רקמה של 100 מ"מ ב 37 ° C ו 5% CO2 עד 70% מפגש.</li>
	<li>הסר את מדיום התרבית ושטוף את הכלי 2x עם 1x פוספט buffered מלוחים (PBS) כדי להסיר תאים לא מחוברים ולכלוך. יש להסיר PBS ולהוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין המכיל 2.21 mM EDTA, ולדגור ב-37°C למשך דקה אחת.</li>
	<li>נטרלו את הטריפסין עם 7 מ"ל של מדיום תרבית אנדותל מלאה, ושטפו בעדינות תאים מצלחת התרבית. יש לאשר ניתוק תאים תחת מיקרוסקופ אור (הגדלה פי 40).</li>
	<li>יש לאסוף את תרחיף התאים בצינור של 15 מ"ל ובצנטריפוגה במהירות של 400 x גרם למשך 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend תאים עם 5 מ"ל של מדיום תרבית אנדותל מלאה.</li>
	<li>לספור תאים באמצעות hemocytometer ולהעביר תרחיף המכיל 2 x 106 תאים לצינור סטרילי 1.5 מ"ל. כל תקע מכיל 1.5 x 106 תאים, 25% תאים נוספים משמשים במקרה של פסולת. כל קבוצה כוללת לפחות 3 תקעים. הערה: לאחר ניסויים נמצא כי 1.5 x 106 תאים ב 300 μL של ג'ל מטריצה הוביל להתפתחות נכונה של אנגיוגנזה ולכן נבחר לניסויים.</li>
	<li>תרחיף תאי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות לתאי כדור, ולאחר מכן להסיר supernatant.</li>
</ol>3. הכנת ג'ל מטריקס
<ol><li>טרום קירור סטרילי 1.5 מ"ל צינורות המכילים גלולת תא באמבט מים 4 מעלות צלזיוס. מצננים מראש מזרקי אינסולין 30G 1 מ"ל במקרר 4°C.</li>
	<li>להפשיר לחלוטין ג'ל מטריצה באמבט מים 4 מעלות צלזיוס. אין לערבב או לערבל. קירור מראש 10x M199 ובדיקת מגיב/תרופת עניין באמבט מים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש לערבב ג'ל מטריצה מקורר מראש עם 10x M199 המכיל 10% FBS ואת הריאגנט שייבדק ביחס נפח של 8.8:1:0.2 כדי לקבל ג'ל מטריצה ותערובת M199 המכילה 1% FBS והמגיב.</li>
	<li>יש להשהות תאים עם 400 μL של תערובת ג'ל המטריצה, לערבב בעדינות כדי למנוע יצירת בועות. שמור את הצינור על קרח עד שהעכברים מוכנים להזרקה. שמור את תערובת ג'ל מטריצה על קרח כל הזמן כדי למנוע קרישה. הערה: כאן, 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה המכילה 1.5 x 106 תאים שימש ליצירת תקע ג'ל. הכינו תוספת של 25% ג'ל לפי 25% תאים נוספים בשלב 2.</li>
</ol>4. הכנת עכבר
<ol><li>מרדימים עכבר Nu/Nu זכר בן 6-8 שבועות (18-25 גרם) בתא מכשיר ההרדמה של בעלי חיים עם איזופלורן (3% איזופלורן ב-100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה). לאחר הרדמה מוצלחת, שאושרה על ידי היעדר רפלקס תיקון ורפלקס צביטת בוהן, הוציאו את העכבר מהחדר, הוציאו את העכבר מהחדר והניחו מסכת הרדמה על העכבר ושנו את ריכוז האיזופלורן ל -1.5% ב -100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר לדקה. הערה: ספק תמיכה תרמית לבעל החיים באמצעות כרית חימום לאורך כל ההליך.</li>
	<li>יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים למניעת יובש. הדביקו את הגפיים של העכברים על לוח הניתוח במצב נוטה.</li>
</ol>5. הזרקת תערובת ג'ל מטריקס
<ol><li>טען 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה לתוך מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 30G. הימנעו מהיווצרות בועות. טען במהירות את ג'ל המטריצה (תוך 2 דקות) כדי למנוע התמצקות במהלך זמן זה. הניחו מיד את מזרק האינסולין עמוס בג'ל מטריקס על קרח.</li>
	<li>נקו את העור על גבם של עכברים באמצעות רפידות 75% אלכוהול. תת עורית להזריק 300 μL של תערובת ג'ל מטריצה בצד אחד של החלק האחורי של עכברים.</li>
	<li>הסר בעדינות את המחט מאתר ההזרקה כדי למנוע דליפה של תערובת ג'ל המטריצה. בדקו אם יש גיבנת קטנה באתר ההזרקה (איור 1).</li>
	<li>הניחו את העכבר על כרית החימום למשך 2 דקות כדי לאפשר לתערובת ג'ל המטריקס לנקרש וליצור תקע.</li>
	<li>חזור על שלבים 5.2. ל-5.4. כדי ליצור תקע בצד השני של גב העכבר. סמן את קצות הדבשת באמצעות עט טוש.</li>
	<li>התבונן בעכבר עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה. שים את העכבר בכלוב נפרד עד שהוא התאושש לחלוטין. אחסן את העכברים במעבדת בעלי חיים ניסיונית מסוג SPF ב 22 ± 2 ° C עם מחזור אור / חושך של 12 שעות במשך 7 ימים.</li>
</ol>6. הזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב
<ol><li>לאחר 7 ימים של הזרקת ג'ל מטריצה, יש להשהות מחדש 0.5 מ"ג של דקסטרן-FITC עם 500 מיקרוליטר מים מזוקקים כפול (ddH2O) ולאחר מכן מערבלים באלימות כדי לקבל את תמיסת דקסטרן-FITC בריכוז הסופי של 1 מיקרוגרם/μL. הערה: השתמש ב- dextran-FITC עם משקל מולקולרי של ~150 kDa לבדיקת אנגיוגנזה, והשתמש ב- dextran-FITC עם משקל מולקולרי של ~4 kDa לבדיקת חדירות כלי דם.</li>
	<li>טען 50 μL של תמיסת dextran-FITC לתוך מזרקי 29G.</li>
	<li>תקן את העכבר במכשיר הזרקת וריד הזנב. נקו את הזנב עם כדור צמר גפן 75% אלכוהול והזריקו בעדינות 50 מיקרוליטר של דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב.</li>
	<li>דחסו את אתר ההזרקה עם צמר גפן למשך דקה אחת כדי לעצור דימום, ואז החזירו את העכברים לכלוב למשך 30 דקות.</li>
	<li>חזור על שלבים 6.3. ו-6.4. עד שכל העכברים יקבלו זריקת דקסטרן-FITC.</li>
</ol>7. אוסף תקעי ג'ל מטריקס
<ol><li>הזרקה תוך-צפקית של 1% נתרן פנטוברביטלי ב-PBS (200 מ"ג/ק"ג משקל גוף) והרדמת העכברים בהליך מאושר על ידי IACUC.</li>
	<li>חותכים את העור לאורך הגבול המסומן של התקע באמצעות מספריים כירורגיים ולהסיר את העור מעל תקע ג'ל המטריצה.</li>
	<li>אספו את התקע ושטפו בכד קטן עם PBS 1x כדי לשטוף דם עודף (איור 2A). צבע התקע יכול לתאר באופן גס את מידת שפע הדם ואת תכולת כלי הדם (איור 3A).</li>
</ol>8. הטמעת תקע ג'ל מטריצה והכנת חתך
<ol><li>כסו את הכפתור של קלטת ההטבעה של הרקמה בכ-0.5 מ"ל של ג'ל הטבעה של רקמות, ולאחר מכן הניחו מיד את תקע ג'ל המטריצה על ג'ל ההטבעה של הרקמה בכיוון הרצוי כפי שמוצג באיור 2B. לאחר מכן, להטביע את התקע עם ג'ל הטבעה רקמות נוסף.</li>
	<li>הכניסו את הקלטות למקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך 12 שעות כדי להתמצק.</li>
	<li>להכנת חתך עבה, מוציאים את בלוק התקע המוצק וחותכים מקטעים בעובי 12 מיקרומטר באמצעות המיקרוטום המקפיא בהתאם להוראה, ומרכיבים על שקופיות מיקרוסקופ.</li>
	<li>פורסים 5-10 חלקים מכל בלוק תקע.</li>
</ol>9. כימות אנגיוגנזה (איור 3)
<ol><li>קבל תמונות פלואורסצנטיות מ -5 שדות עצמאיים של החלק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באורך גל של 488 ננומטר תחת הגדלה של פי 10.</li>
	<li>פתח את קובץ התמונה באמצעות תוכנת Image J (https://imagej.en.softonic.com/) ולחץ על הלחצן Angiogenesis Analyze . לאחר מכן, לחץ על לחצן נתח ניגודיות פאזות HUVEC ועבור לטבלת תוצאות סטטיסטיות כדי לאסוף מידע. מדוד את כל 5 תמונות הפלואורסצנטיות שנרכשו עבור כל קטע.</li>
	<li>לנתח את האורך הכולל של neo-vessels מקבוצות שונות כדי להעריך סטטיסטית את ההבדל באנגיוגנזה בין קבוצות אלה. הערה: אורך מקטעי האב הכולל מציין את האורך הכולל של כלי הניאו. המגיב שמגדיל את אורך הניאו-כלי נקרא פרו-אנגיוגני, ואילו המגיב שמקטין את אורך הניאו-כלי הוא אנטי-אנגיוגני.</li>
</ol>10. כימות חדירות כלי הדם (איור 4)
<ol><li>קבל תמונות פלואורסצנטיות מ -5 שדות עצמאיים של החלק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך באורך גל של 488 ננומטר תחת הגדלה של פי 20.</li>
	<li>פתח את קובץ התמונה באמצעות תוכנת Image J. לחץ על כפתור הבחירה ביד חופשית והקף את אזור הדליפה, ולאחר מכן לחץ על תפריט ניתוח ובחר באפשרות מדידה כדי לקבל את פרטי האזור של אזור הדליפה. השתמש ביחס בין אזור הדליפה לאזור התמונה כדי לציין חדירות כלי דם.</li>
	<li>נתח את היחס בין אזור הדליפה לאזור התמונה מקבוצות שונות כדי להעריך סטטיסטית את ההבדל בחדירות כלי הדם בין קבוצות אלה.</li>
</ol>

פישוט מחקרי אנגיוגנזה עם בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה

<ol><li>Bikfalvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+and+conceptual+developments+in+vascular+biology+and+angiogenesis+research%3A+a+personal+view%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view.</a> Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).</li>
<li>Carmeliet, P., Jain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+mechanisms+of+vessel+normalization+for+cancer+and+other+angiogenic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases.</a> Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).</li>
<li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).</li>
<li>Griffioen, A., Molema, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%3A+potentials+for+pharmacologic+intervention+in+the+treatment+of+cancer%2C+cardiovascular+diseases%2C+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation.</a> Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).</li>
<li>Viallard, C., Larrivée, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis+and+vascular+normalization%3A+alternative+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets.</a> Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).</li>
<li>Craig, M., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS+transcription+factors+in+embryonic+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">ETS transcription factors in embryonic vascular development.</a> Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).</li>
<li>Losordo, D., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+and+vasculogenesis+for+ischemic+disease.+Part+I%3A+angiogenic+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines.</a> Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-angiogenesis-new+concept+for+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors.</a> Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer%2C+vascular%2C+rheumatoid+and+other+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion+-+Angiogenesis%3A+an+organizing+principle+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li>
<li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1%CE%B2+augments+the+angiogenesis+of+endothelial+progenitor+cells+in+an+NF-%CE%BAB%2FCXCR7-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).</li>
<li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+transcriptional+upregulation+of+IDH2+to+tune+mitochondrial+dynamics+and+rescue+angiogenic+function+of+diabetic+EPCs%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs.</a> Redox Biology. 56, 102449(2022).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liraglutide+Improves+the+Angiogenic+Capability+of+EPC+and+Promotes+Ischemic+Angiogenesis+in+Mice+under+Diabetic+Conditions+through+an+Nrf2-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism.</a> Cells. 11 (23), 3821(2022).</li>
<li>Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li>
<li>Malinda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+matrigel+migration+and+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+NJ%29%22%5BJournal%5D)">In vivo matrigel migration and angiogenesis assay.</a> Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF21+promotes+ischaemic+angiogenesis+and+endothelial+progenitor+cells+function+under+diabetic+conditions+in+an+AMPK%2FNAD%2B-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).</li>
<li>Gavard, J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+controls+endothelial-cell+permeability+by+promoting+the+beta-arrestin-dependent+endocytosis+of+VE-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin.</a> Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).</li>
<li>Birdsey, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+transcription+factor+ERG+promotes+vascular+stability+and+growth+through+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling.</a> Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+CXCR4+antagonist+enhances+angiogenesis+via+modifying+the+ischaemic+tissue+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

אנו מציגים שיטה אמינה ונוחה להערכה כמותית של אנגיוגנזה in vivo ללא כתמים. בפרוטוקול זה, תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריקס בנוכחות ריאגנטים פרו-אנגיוגניים או אנטי-אנגיוגניים, ולאחר מכן הוזרקו תת-עורית לחלק האחורי של עכברי Nu/Nu כדי ליצור תקע ג'ל (איור 1). לאחר 7 ימים של היווצרות תקע ג'ל, dextran-FITC הוזרק תוך ורידי והופץ במשך 30 דקות. תקע הג'ל נאסף ושובץ בג'ל הטבעה של רקמות, וחתכים של 12 מיקרומטר נחתכו לצילום (איור 2). Dextran-FITC יכול להצביע על כלי פונ...

אנגיוגנזה, תהליך היווצרות כלי הדם הניאו-כליים מכלי דם קיימים, ממלאת תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון התפתחות עוברית, ריפוי פצעים, טרשת עורקים, התפתחות גידולים וכו '.1,2,3,4,5. תהליך דינמי זה כולל מספר שלבים, כולל השפלה של המטריצה, התפשטות תאי כלי דם, הגירה וארגון עצמי ליצירת מבנים צינוריים וייצוב של כלי הדם6. קידום אנגיוגנזה הוכח כקריטי בטיפול באוטם שריר הלב, שבץ וסוגים אחרים של מחלות איסכמיות7 תוך עיכוב אנגיוגנזה נחשב אסטרטגיה מבטיחה בטיפול בסרטן8 ומחלות שגרונית9. אנגיוגנזה נחשבת לעיקרון מארגן לגילוי תרופות10. לפיכך, בניית שיטה אמינה ונוחה להערכת היקף האנגיוגנזה היא קריטית למחקר מכני או גילוי תרופות במחלות תלויות אנגיוגנזה.
מספר מודלים in vitro ו- in vivo פותחו כדי להעריך אנגיוגנזה11. בין אלה, מודלים דו-ממדיים (2-D), כמו בדיקת היווצרות צינור ג'ל מטריצה12, אינם יכולים ליצור מבנים צינוריים פונקציונליים. המודלים של בעלי החיים, כגון איסכמיה של הגפה האחורית מודל13,14, יכולים לשחזר את תהליך האנגיוגנזה אך הם מורכבים ודורשים מערכת הדמיה של זרימת דם בלייזר. מודלים תלת ממדיים של מורפוגנזה וסקולרית, כמו בדיקת תקע ג'ל מטריצה, מספקים פלטפורמה פשוטה שיכולה לחקות את תהליך האנגיוגנזה in vivo15, אך זיהוי אנגיוגנזה דורש אימונוהיסטוכימיה או צביעת אימונופלואורסנציה 16,17,18, שהם משתנים ומדמיינים בצורה גרועה.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה שבו תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריצה והוזרקו תת עורית לחלק האחורי של עכברים כדי ליצור תקע. בתקע, תאי כלי הדם צריכים לפרק את המטריצה, להתרבות, לנדוד ולהתארגן בעצמם כדי ליצור סוף סוף כלי דם פונקציונליים עם זרימת הדם בסביבה הפנימית. לאחר מכן, דקסטרן עם תווית פלואורסצנטית מוזרק דרך וריד הזנב, כדי לזרום דרך התקע, והתווית מומחשת כדי לציין ניאו-כלי. התוכן של אנגיוגנזה ניתן להעריך כמותית על ידי אורך כלי. שיטה זו יכולה ליצור כלי דם פונקציונליים שלא ניתן לייצר במודלים אנגיוגנזה דו-ממדית12, ואינה זקוקה לתהליך כתמים מורכב כמו בבדיקת תקע ג'ל מטריצה רגילה11. זה גם לא דורש מכשירים ספציפיים יקרים כמו מערכת הדמיה זרימת דם לייזר כתמים באיסכמיה של הגפיים האחוריות מודל 13,14,19. שיטה זו היא רב-תכליתית, זולה, ניתנת לכימות וקלה לביצוע, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע את היכולת הפרו-אנגיוגנית או האנטי-אנגיוגנית של תרופות או לשמש במחקר מכני המעורב באנגיוגנזה.

<table><tbody><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ הידבקות</td><td>CITOTEST</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הרדמה</td><td>RWD</td><td>R640-S1</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים</td><td>קורנינג</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Cryoslicer</td><td>תרמו פישר</td><td>CryoStar NX50</td><td></td></tr><tr><td>Dextrans-FITC-150kDa</td><td>WEIHUA BIO</td><td></td><td></td>WH007N07</tr><tr><td>Dextrans-FITC-4kDa</td><td>WEIHUA BIO</td><td>WH007N0705</td><td></td></tr><tr><td>הטמעת קלטות</td><td>CITOTEST</td><td>80203-0007</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל בינוני</td><td>ScienCell</td><td>35809</td><td></td></tr><tr><td>תוספי גדילה אנדותל</td><td>ScienCell</td><td>1025</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10100147C</td><td></td></tr><tr><td>פיברובלסט גורם גדילה 1</td><td>AtaGenix</td><td>9043p-082318-A01</td><td>FGF1</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ni</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>Boruida</td><td>30-50-30</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין</td><td>BD</td><td>300841</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>מעבדה&nbsp; איזון</td><td>Sartorius</td><td>BSA124S-CW</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>מטריקס ג'ל</td></tr><tr><td>בינוני 199 אבקה</td><td>Gibco</td><td>31100-035</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-צינורות</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)</td><td>SUKURA</td><td>4583</td><td>ג'ל הטמעת רקמות</td></tr><tr><td>חומצה פלמיטטית</td><td>KunChuang</td><td>KC001</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין נוזלי</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט מי מלח</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td></td></tr><tr><td>מכשירים כירורגיים</td><td>RWD</td><td>RWD</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר הזרקת וריד זנב</td><td>KEW BASIS</td><td>KW-XXY</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין-EDTA</td><td>Solarbio</td><td>T1320</td><td></td></tr><tr><td>טמפרטורה נמוכה במיוחד מקפיא</td><td>eppendorf</td><td>U410</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אנדותל כלי דם</td><td>CHAMOT</td><td>CM058-5HP</td><td>VEGF</td></tr></tbody></table>

שונה בבדיקת תקע ג'ל מטריצת vivo למחקרי אנגיוגנזה

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

מספר מודלים פותחו כדי לחקור אנגיוגנזה in vivo. עם זאת, רוב המודלים הללו מורכבים ויקרים, דורשים ציוד מיוחד, או קשה לבצע אותם לניתוח כמותי לאחר מכן. כאן אנו מציגים בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה להערכת אנגיוגנזה in vivo. בפרוטוקול זה, תאי כלי הדם עורבבו עם ג'ל מטריקס בנוכחות או היעדר ריאגנטים פרו-אנגיוגניים או אנטי-אנגיוגניים, ולאחר מכן הוזרקו תת עורית לגבם של עכברים מושתלים. לאחר 7 ימים, מלח חיץ פוספט המכיל dextran-FITC מוזרק דרך וריד הזנב ומופץ בכלי הדם במשך 30 דקות. תקעי ג'ל מטריקס נאספים ומוטבעים בג'ל הטבעה רקמות, ואז חותכים קטעי 12 מיקרומטר לזיהוי פלואורסצנטי ללא כתמים. בבדיקה זו, dextran-FITC עם משקל מולקולרי גבוה (~ 150,000 Da) יכול לשמש כדי לציין כלי דם פונקציונליים לגילוי אורכם, בעוד dextran-FITC עם משקל מולקולרי נמוך (~ 4,400 Da) יכול לשמש כדי לציין את החדירות של neo-vessels. לסיכום, פרוטוקול זה יכול לספק שיטה אמינה ונוחה למחקר כמותי של אנגיוגנזה in vivo.

איור 1 הוא תרשים זרימה המתאר כיצד להכין את התערובת של ג'ל מטריצה, תאי כלי דם, מדיום תרבית ומגיב. לאחר מכן התערובת הוזרקה באופן תת-עורי לחלק האחורי של עכברי Nu/Nu וחוממה באמצעות כרית חימום כדי להאיץ את הקרישה שלה כדי ליצור לבסוף תקע ג'ל.
איור 2A הוא תרשים זרימה שמציין כלי דם עם תווית פלואורסצנטית של דקסטרן. פלואורסצנט שכותרתו דקסטרן הוזרק דרך וריד הזנב והעיגול למשך 30 דקות, כך שהוא יכול להיכנס לכלי הפונקציונלי בתקע הג'ל. לאחר מכן, אטמי...

השיטה המוצגת כאן יכולה להעריך את ההשפעה של ריאגנטים על אנגיוגנזה או חדירות כלי הדם in vivo ללא כתמים. השיטה משתמשת בהזרקת דקסטרן-FITC דרך וריד הזנב כדי לדמיין ניאו-כלי דם או דליפת כלי דם.

שונה בבדיקת תקע ג'ל מטריצת Vivo למחקרי אנגיוגנזה

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

המחקר שלנו עוסק באנגיוגנזה, תהליך היווצרות כלי דם חדשים מכלי דם קיימים. הוא ממלא תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון התפתחות עוברית או ריפוי טרשת עורקים, התפתחות גידולים וכו '. בניית מודל אמין להערכת היקף האנגיוגנזה היא קריטית למחקר שריר הלב או לגילוי תרופות למחלות תלויות אנגיוגנזה.עם זאת, רוב הדגמים הקיימים מורכבים, יקרים ודורשים ציוד מיוחד. כאן, אנו מציגים בדיקת תקע ג'ל מטריצה שונה שניתן להשתמש בה כדי לחקור אנגיוגנזה וחדירות כלי מבלי להכתים בצורה פשוטה, אינטואיטיבית יותר, כמו גם יעילה.

modified-in-vivo-matrix-gel-plug-assay-for-angiogenesis-studies

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

Assay הקמת הצינור משמש להערכת פעילות כלי הדם של תאים סרטניים.

Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים

הרקמות מבוגר vascularized יונקים כי חסרה אנגיוגנזה פיזיולוגי שלא נחשף התערבות כירורגית משמש המחקר: (i) ייזום ופיתוח של אנגיוגנזה הבאים הממשל intraperitoneal של סוכני הבדיקה; (ii) שינוי של אנגיוגנזה הבאים מערכתית של הממשל נבחרת סוכני הבדיקה.

עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה

Assay היווצרות הצינור הוא שיטה מהירה, לכימות למדידת אנגיוגנזה במבחנה. תאי האנדותל הם בשילוב עם אמצעי תקשורת מותנה ומצופים על תמצית קרום במרתף. היווצרות צינור מתרחשת בתוך שעות וצינוריות שהוקמו זה עתה לכמת בקלות.

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

אנו מתארים בדיקת פקק מטריג'ל כדי להמחיש את הפוטנציאל האנגיוגני של מאגר של גורמים המופרשים על ידי תאים סרטניים באמצעות שתי שיטות הדמיה משלימות, אולטרסאונד ואנדומיקרוסקופיה. המטריגל, ג'ל מחקה מטריצה חוץ-תאית (ECM), משמש להחדרת גורמים אנגיוגניים למארח (עכבר) המופרשים למדיה המותנית (C.M).

פונקציונליות ניטור ומורפולוגיה של כלי דם גויס על ידי גורמים מופרשים על ידי תאים מניבי גידול בצמיחה מהיר

כתב יד זה מתאר בדיקת היווצרות צינור כדי לכמת את ההשפעות של תרכובת או מצב נתון על אנגיוגנזה על ידי שימוש בהיווצרות צינור תא אנדותל בסביבה מבוקרת.

Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות אנדותל-pericyte אדם העכבר באמצעות וריאציה של assay אנגיוגנזה תקע ג'ל מטריקס.

In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג&#39;ל עכבר

שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

. הנה, פרוטוקול מוצג לבצע, culturing בתאי poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized עם fluorogenic מטריקס מטאלו-פרוטאינאז (MMP)-פפטיד מתכלה. MMP הסלולר ופעילות מטבולית נמדדים ישירות מן התרבויות הידרוג שימוש בקורא microplate סטנדרטיים.

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

למד שיטה מודифיקציה של מטריצת ג'ל פלאג להערכת אנגיוגנזה וחדירות כלי דם אינ ויוו. השיטה מאפשרת הדמיית כלי דם חדשים באמצעות דקסטרן-FITC ללא צורך בצביעה.

שונה בבדיקת תקע ג'ל מטריצת Vivo למחקרי אנגיוגנזה

גלה סרטונים נוספים