Name: ביטוי טרנסגנים בתאים בתרבית באמצעות וקטורים נגיפיים רקומביננטיים לא מטוהרים הקשורים באדנו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: למדו שיטה יעילה להעברת גנים בתאים בתרבית באמצעות וקטורים נגיפיים רקומביננטיים לא מטוהרים. שיטה זו מציעה חלופה פשוטה וחסכונית לשיטות טרנספקציה מסורתיות במחקר תרפיית גנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לרוברט טג'יאן וחאווייר דרזק על תמיכתם והשימוש בציוד מעבדה. אנו מודים למארק קיי על תרומתו לפלסמידים KP1 ו- LK03 rep/cap, וללוק ונדנברגה על פלסמיד AAV4 rep/cap. המימון ניתן על ידי המכון הרפואי הווארד יוז (34430, R. T.) והמכון הקליפורני לרפואה רגנרטיבית תוכנית הכשרה EDUC4-12790. נ.ו. מודה על מימון ממרכז תאי הגזע בברקלי באמצעות מלגת סיבל לפוסט-דוקטורט ומקרן המחקר הגרמנית (DFG) באמצעות מלגת וולטר בנימין.

ייצור וקטורי גולמי והעברת DNA יעילה בתרביות תאים

<ol><li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corrigendum%3A+An+essential+receptor+for+adeno-associated+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corrigendum: An essential receptor for adeno-associated virus infection.</a> Nature. 539 (7629), 456(2016).</li>
<li>Nicolson, S. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+utilizes+host+cell+nuclear+import+machinery+to+enter+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus utilizes host cell nuclear import machinery to enter the nucleus.</a> Journal of Virology. 88 (8), 4132-4144 (2014).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Vectors+in+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases%22%5BJournal%5D)">Viral Vectors in Gene Therapy.</a> Diseases. 6 (2), 42(2018).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li>
<li>Ling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Adeno-Associated+Virus+Genome+Packaging+Puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Genetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Adeno-Associated Virus Genome Packaging Puzzle.</a> Journal of Molecular and Genetic Medicine. 9 (3), 175(2015).</li>
<li>Maurer, A. C., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+Genome+Interactions+Important+for+Vector+Production+and+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus Genome Interactions Important for Vector Production and Transduction.</a> Human Gene Therapy. 31 (9-10), 499-511 (2020).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+the+adeno-associated+virus+DNA+termini+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Replication of the adeno-associated virus DNA termini in vitro.</a> Intervirology. 27 (3), 138-147 (1987).</li>
<li>Wang, X. S., Ponnazhagan, S., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+and+replication+of+adeno-associated+virus+type+2+as+well+as+vector+DNA+sequences+from+recombinant+plasmids+containing+deletions+in+the+viral+inverted+terminal+repeats%3A+selective+encapsidation+of+viral+genomes+in+progeny+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rescue and replication of adeno-associated virus type 2 as well as vector DNA sequences from recombinant plasmids containing deletions in the viral inverted terminal repeats: selective encapsidation of viral genomes in progeny virions.</a> Journal of Virology. 70 (3), 1668-1677 (1996).</li>
<li>Earley, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus+Serotype-Specific+Inverted+Terminal+Repeat+Sequence+Role+in+Vector+Transgene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 151-162 (2020).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concatamerization+of+adeno-associated+virus+circular+genomes+occurs+through+intermolecular+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Concatamerization of adeno-associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination.</a> Journal of Virology. 73 (11), 9468-9477 (1999).</li>
<li>Au, H. K. E., Isalan, M., Mielcarek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Advances%3A+A+Meta-Analysis+of+AAV+Usage+in+Clinical+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Advances: A Meta-Analysis of AAV Usage in Clinical Settings.</a> Frontiers in Medicine. 8, 809118(2021).</li>
<li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+ex+vivo%2Fin+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+%28AAV1-9%29+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Associated+Defective+Virus+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Associated Defective Virus Particles.</a> Science. 149 (3685), 754-756 (1965).</li>
<li>Meier, A. F., Fraefel, C., Seyffert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interplay+between+Adeno-Associated+Virus+and+its+Helper+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The Interplay between Adeno-Associated Virus and its Helper Viruses.</a> Viruses. 12 (6), 662(2020).</li>
<li>Djurovic, S., Iversen, N., Jeansson, S., Hoover, F., Christensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+nonviral+transfection+and+adeno-associated+viral+transduction+on+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of nonviral transfection and adeno-associated viral transduction on cardiomyocytes.</a> Molecular Biotechnology. 28 (1), 21-32 (2004).</li>
<li>Batista Napotnik, T., Polajzer, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+due+to+electroporation+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell death due to electroporation - A review.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).</li>
<li>McCarty, D. M., Young, S. M. Jr, Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+and+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 334-338 (2016).</li>
<li>Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).</li>
<li>Parks, W. P., Melnick, J. L., Rongey, R., Mayor, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+assay+and+growth+cycle+studies+of+a+defective+adeno-satellite+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Physical assay and growth cycle studies of a defective adeno-satellite virus.</a> Journal of Virology. 1 (1), 171-180 (1967).</li>
<li>Bantel-Schaal, U., zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+DNA+of+a+defective+human+parvovirus+isolated+from+a+genital+site%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site.</a> Virology. 134 (1), 52-63 (1984).</li>
<li>Gao, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+adeno-associated+viruses+from+rhesus+monkeys+as+vectors+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 99 (18), 11854-11859 (2002).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clades+of+Adeno-associated+viruses+are+widely+disseminated+in+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clades of Adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6381-6388 (2004).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Reports. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+gene+therapy+vector+evolution+via+multispecies+interbreeding+and+retargeting+of+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses.</a> Journal of Virology. 82 (12), 5887-5911 (2008).</li>
<li>Lisowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+evaluation+of+clinically+relevant+AAV+variants+in+a+xenograft+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selection and evaluation of clinically relevant AAV variants in a xenograft liver model.</a> Nature. 506 (7488), 382-386 (2014).</li>
<li>Pekrun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+barcoded+AAV+capsid+library+to+select+for+clinically+relevant+gene+therapy+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors.</a> JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).</li>
<li>Colon-Thillet, R., Jerome, K. R., Stone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+AAV+vectors+to+target+persistent+viral+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of AAV vectors to target persistent viral reservoirs.</a> Virology Journal. 18 (1), 85(2021).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+high-resolution+imaging+of+Ku+foci+to+decipher+mechanisms+of+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair.</a> The Journal of Cell Biology. 202 (3), 579-595 (2013).</li>
<li>Bi, X., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+rearrangement+mediated+by+inverted+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA rearrangement mediated by inverted repeats.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 93 (2), 819-823 (1996).</li>
<li>Samulski, R. J., Berns, K. I., Tan, M., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+adeno-associated+virus+into+pBR322%3A+rescue+of+intact+virus+from+the+recombinant+plasmid+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning of adeno-associated virus into pBR322: rescue of intact virus from the recombinant plasmid in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 79 (6), 2077-2081 (1982).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Sommer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adeno-associated+virus+particles+and+empty+capsids+by+optical+density+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement.</a> Molecular Therapy. 7 (1), 122-128 (2003).</li>
<li>Zhu, J., Huang, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TLR9-MyD88+pathway+is+critical+for+adaptive+immune+responses+to+adeno-associated+virus+gene+therapy+vectors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The TLR9-MyD88 pathway is critical for adaptive immune responses to adeno-associated virus gene therapy vectors in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (8), 2388-2398 (2009).</li>
<li>Wagner, H., Bauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+is+not+Toll%3A+new+pathways+in+DNA+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">All is not Toll: new pathways in DNA recognition.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (2), 265-268 (2006).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Digital+Droplet-Based+AAV+Genome+Titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Digital Droplet-Based AAV Genome Titration.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Therapy. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
<li>Summerford, C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-associated+heparan+sulfate+proteoglycan+is+a+receptor+for+adeno-associated+virus+type+2+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions.</a> Journal of Virology. 72 (2), 1438-1445 (1998).</li>
<li>Bell, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV9+receptor+and+its+modification+to+improve+in+vivo+lung+gene+transfer+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2427-2435 (2011).</li>
<li>McCown, T. J., Xiao, X., Li, J., Breese, G. R., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+persistent+expression+patterns+of+CNS+gene+transfer+by+an+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Differential and persistent expression patterns of CNS gene transfer by an adeno-associated virus (AAV) vector.</a> Brain Research. 713 (1-2), 99-107 (1996).</li>
<li>Weitzman, M. D., Kyostio, S. R., Kotin, R. M., Owens, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+Rep+proteins+mediate+complex+formation+between+AAV+DNA+and+its+integration+site+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) Rep proteins mediate complex formation between AAV DNA and its integration site in human DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science United States of America. 91 (13), 5808-5812 (1994).</li>
<li>Miller, D. G., Petek, L. M., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+integrate+at+chromosome+breakage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites.</a> Nature Genetics. 36 (7), 767-773 (2004).</li>
<li>Hanlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+AAV+vector+integration+into+CRISPR-induced+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High levels of AAV vector integration into CRISPR-induced DNA breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 4439(2019).</li>
<li>Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+mediated+by+adeno-associated+virus+and+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (10), 3558-3565 (2003).</li>
</ol>

A.C.M. היא יועצת עבור Janssen Pharmaceuticals ומכהנת ב-SAB עבור NewBiologix. לכל שאר המחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

שיבוט פרוטוקול השיבוט אינו מוגבל לפלסמיד pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 המשמש לעיל וניתן לשנות אותו בקלות בהתבסס על צרכי הניסוי של החוקר. פלסמידים רבים המכילים ITR זמינים באינטרנט לרכישה. לדוגמה, פלסמידים המכילים גם Cas9 וגם אתר שיבוט sgRNA זמינים אך דורשים כמה שלבים נוספים כגון חישול אוליגונוקלאוטיד וטיפול PNK30. בנוסף, ניתן למצוא פלסמידים המכילים אתר שיבוט מרובה (MCS) עם ITR בלבד וללא אלמנטים רגולטוריים פנימיים31. אם רוצים להשתמש בפלסמידים שונים, אנזימי ההגבלה (RE) המשמשים לעיכול הם בדרך כלל המרכיבים היחידים שייתכן שיהיה צורך לשנות בפרוטוקול זה. עם זאת, מגבלה של rAAV היא קיבולת המטען המוגבלת שלה. בשל מגבלות פיזיות של הקפסיד, הגנום הווקטורי לא יעלה על 4.9 קילובייט, כולל ITR.
בעת בידוד פלסמיד מחיידקים, חיוני להשתמש בערכת midiprep או maxiprep נמוכה או נטולת אנדוטוקסין כדי להפחית את הנזק לתאים במהלך טרנספקציה או התמרה של פלסמיד משולש. פלסמיד מערכות miniprep מכיל לעתים קרובות זיהומים גבוהים יותר, ריכוזים מופחתים, ופחות DNA סליל, כל אלה יכולים להשפיע על הייצור במורד הזרם של rAAV ולכן אינו מומלץ.
זה קריטי להבין את המבנה והמאפיינים של ITR במהלך השיבוט. ראשית, קשה מאוד להשתמש ב- PCR באמצעות ITR. יש להימנע מעיצובי שיבוט הדורשים הגברה של PCR באמצעות ITR, ובנוסף להגביל את השימוש בטכניקת שיבוט ההרכבה של גיבסון. ככזה, שיבוט אנזים הגבלה הוא השיטה המועדפת לשיבוט לפלסמידים המכילים ITR. יתר על כן, פריימרים מסוימים לריצוף Sanger עשויים שלא להיות תואמים אם האזור הרצף מכיל את ITR. במקום זאת, מומלץ להשתמש בפריימרים שרצפים הרחק מה-ITR ולתוך גוף הגנום הווקטורי כדי לקבל תוצאות ריצוף מדויקות יותר. שנית, ITR מועדים למחיקות, סידורים מחדש ומוטציות כאשר הם הופכים לחיידקים להגברת פלסמיד32,33. כדי למתן אירועים אלה, מומלץ להשתמש בזני חיידקים מוכשרים חסרי רקומבינציה, כגון Stbl3, ולדגור עליהם בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס כדי להאט את חלוקות התאים. לבסוף, נצפה כי מושבות קטנות יותר עשויות להתאים לשיבוטים ללא סידורים מחדש או מחיקות, שכן אלה ללא ITR עשויים להעניק יתרון צמיחה ולהיות גדולים יותר. לכן, מומלץ לבחור מושבות קטנות.
ייצור וקטורי הייצור המוצלח של וקטור rAAV יכול להיות מושפע ממספר אלמנטים. גורם קריטי אחד הוא בריאותם של תאי HEK293 או 293T המשמשים להעברה. באופן כללי, מספרי מעבר נמוכים הם אידיאליים, מכיוון שתאים בעלי מעבר גבוה עשויים להציג שונות גנוטיפית ופנוטיפית שיכולה להפחית את רמות ה-rAAV. בנוסף, צפיפות תאי הזרע צריכה להיות 75%-90% מפגש לייצור יעיל. תאים דלילים מייצרים תפוקות וקטוריות נמוכות מכיוון שיש פחות תאים זמינים לייצור וקטורים, בעוד שתאים מגודלים לא יהיו נגועים ביעילות.
שינויים בין מגרשים מגיבים, מלאי תאים, ושונות כללית ממעבדה למעבדה תורמים להבדלים ביעילות הטרנספקציה ובטיטר הייצור. גורם אופטימלי אחד שיכול להוביל לשיפור הטיטר הוא יחס פלסמיד:PEI בתגובות טרנספקציה. חיוני להשתמש ב-PEI MAX טרי (בן &lt; חודש). מומלץ להשתמש ביחס פלסמיד:PEI של 1:1 כנקודת התחלה, ואם יעילות הטרנספקציה או הטרנסדוקציה נראית גרועה, בדוק מספר יחסים שונים. אופטימיזציה של Titer היא הקלה ביותר אם משתמשים בטרנסגן עם קריאה חזותית, כגון CMV.Luc.IRES.EGFP reporter trangene המשמש כאן כחומר מוצא לשיבוט. כדי לבצע את האופטימיזציה, בצע את שלב 3 של הפרוטוקול באמצעות צלחת של 12 בארות והקטנת מסות הפלסמיד ונפחי הריאגנט בשניים (מסת הפלסמיד הסופית היא 2.6 מיקרוגרם). כוונן את נפח PEI בהתאם כך שיתאים ליחסים הנעים בין 1:0.75 ל-1:3, עם דרגות הולכות וגדלות של 0.25 (איור 6). לדלל כל תגובה עם 950 μL של מדיה SF לאחר 15 דקות. לנוחיותכם, ניתן להכין תערובת מאסטר המכילה את הפלסמידים המשולשים ולהכניס בנפרד לצינורות של 1.5 מ"ל לפני הוספת קובץ משלים 2 של PEI-see. קצור את הווקטור, התמיר תאים בעלי עניין ותמונה. הבאר עם יעילות ההולכה הגבוהה ביותר (שיעור תאי GFP+) מתאימה לטיטר הגבוה ביותר וליחס האופטימלי ביותר של PEI:DNA.
<img alt="תרשים תהליך טרנספקציה של פלסמיד: הכן תערובת מאסטר, שנה יחסי PEI, התמר תאים, וקטור קציר." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> איור 6: זרימת עבודה של אופטימיזציה של PEI. סכמה של השלבים הדרושים למיטוב PEI. יחסים מרובים של פלסמיד: PEI נבדקים כדי לקבוע את היחס האופטימלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
שיקולי קציר וטיטר טכניקת ההקפאה/הפשרה המשמשת לקצירת וקטור rAAV מבליחה ביעילות תאי HEK293 באופן התואם את השימוש הישיר בליזט המזוקק כדי להתמיר תאים בתרבית. סרוטיפים מסוימים של rAAV, כגון AAV1, AAV8 ו-AAV9 משתחררים מתאים במהלך הייצור הווקטורי וניתן לקצור אותם מתווך התא בתרבית ללא מחזורי הקפאה/הפשרה34. השיטה המתוארת כאן מניבה בדרך כלל טיטרים בסדר גודל של 1 x 10 10 VG/mL בעת שימוש בקפסידים AAV2, ו- 1 x10 11 VG/mL עבור AAV8. בעוד טיטרים גבוהים יותר ניתן להשיג על ידי דטרגנט או ליזה כימית אחרת, אלה מזיקים לתאים בשימוש במורד הזרם דורשים rAAV להיות מטוהרים עוד יותר מן הליזט. טיטר תחתון הוא פשרה אחת שחוקר צריך לשקול כאשר הוא קובע אם תכשירים גולמיים מתאימים לצרכי המחקר שלהם, עם זאת, טיטרים נמוכים יותר באופן שולי המיוצרים על ידי השיטות המתוארות כאן יכולים להתמיר סוגי תאים רבים היטב (ראה תוצאות מייצגות). בנוסף ליעילות הטרנספקציה ובריאות התא, טיטרים וקטוריים משתנים בהתאם לקפסיד המשמש במהלך ייצור rAAV ולגודל ולרצף של הטרנסגן בתוך VG35.
בעת קצירת תכשירים וקטוריים גולמיים, DNA פלסמיד ששימש במהלך טרנספקציה פלסמיד משולש עשוי להיות נוכח, ולמרות שהוא נדיר, לגרום לטרנספקציה במורד הזרם במהלך הטרנסדוקציה. יתר על כן, VGs לא ארוזים עשויים להיקשר לחלק החיצוני של קפסידים ולעורר תגובה חיסונית מולדת לדנ"א חד-גדילי עירום וזר36,37. לכן, סוגי תאים רגישים עשויים לדרוש תכשירים וקטוריים להיות מעוכלים ומטוהרים DNase כדי להסיר VGs ופלסמיד לא ארוזים.
אם רוצים לחשב את הטיטר של תכשיר גולמי, ניתן לבצע qPCR כדי לכמת את מספר VG ארוז בתוך חלקיקים עמידים בפני DNase (DRP). בקצרה, כמות קטנה של הכנה גולמית מתעכלת DNase כדי להסיר DNA פלסמיד, חומצות גרעין מזהמות, או VG ארוז חלקית. לאחר מכן הדגימה כפופה ל-qPCR וה-VG המוגן בתוך DRPs מכומת, והתוצאה היא טיטר עם יחידות של גנום וקטורי לכל מ"ל של הכנה גולמית38. לא מומלץ לבצע טיטרציה וקטורית באמצעות בדיקות מבוססות ELISA המכמתות את הטיטרים של קפסיד. בהשוואה לנגיף AAV מסוג פראי, rAAV סובל משיעור של קפסידים ריקים וארוזים חלקית39. ELISA תכמת את כל הקפסידים ללא קשר לתכולת הגנום שלהם ותעריך יתר על המידה את היחידות המתומרות הקיימות בהכנה, הדורשת VG ארוז.
שיקולי התמרה גורמים רבים משפיעים על התמרה של rAAV ויש לקחת בחשבון כל ניסוי חדש. בהתאם למקדם המניע את ביטוי הטרנסגנים, הופעת הביטוי יכולה להתרחש כבר 4 שעות לאחר הטרנסדוקציה (hpt), וביטוי שיא מושג בדרך כלל על ידי 48 hpt. חשוב לזכור את משך הזמן מהזריעה הראשונית של התאים ועד לנקודת הסיום של הניסוי. זאת כדי להעריך את המפגש ההתחלתי של התאים ולוודא שהם לא יגדלו יתר על המידה עד סוף הניסוי. אם התאים מתמזגים יתר על המידה, ההתנהגות התאית עשויה להשתנות עקב תגובת סטרס ויכולה לבלבל את תוצאות הניסוי. סוגי תאים מסוימים, כמו U2-OS, יכולים לסבול צמיחת יתר/עיכוב מגע די טוב. בנוסף, הם יכולים לעמוד בפרקי זמן ארוכים (48 שעות+) בתווך ממוזג ללא סרום - תוצר של פרוטוקול ייצור זה. עם זאת, סוגי תאים רגישים עשויים לדרוש הוספה בסרום או דילול של ההכנה הגולמית עם מדיום גידול מיוחד כדי לשמור על הבריאות במהלך ההעברה. יעילות התמרה מופחתת מעט משימוש במדיה המכילה סרום היא פשרה פוטנציאלית לבריאות התא ויש לשקול אותה על ידי החוקר.
בדרך כלל, עבור תאים המתחלקים במהירות, מפגש התחלתי של כ -50% הוא אופטימלי עבור יישומים שיסתיימו 48 hpt. עם זאת, ניתן להתאים את המפגש בהתאם לצרכי הניסוי. לא מומלץ להתמיר קווי תאים אימורטליים מסוג חד-שכבתי מעל 75% מפגש עקב ירידה ביעילות הטרנסדוקציה. רוב סוגי התאים בתרבית מומרים בהצלחה ובריאים לאחר דגירה של לילה עם תכשירי rAAV גולמיים, ולאחר מכן שינוי למדיה טרייה המכילה סרום בבוקר.
סרוטיפ קפסיד הוא גורם חשוב שיש לקחת בחשבון בעת ייצור rAAV כדי להתמיר תא מטרה, שכן הקפסיד הוא הגורם העיקרי של טרופיזם תאי וביטוי טרנסגנים לאחר מכן13. AAV2 הוא סרוטיפ בשימוש נרחב בשל יכולתו להתמיר ביעילות סוגים רבים של תאים בתרבית12. ניתן לייחס תכונה זו של AAV2 לפרוטאוגליקנים של הפרין סולפט (HSPGs) המשמשים כגורם ההתקשרות העיקרי עבור AAV2 ולרמות הגבוהות של HSPGs על תאים בתרבית מההסתגלות לגידול בצלחת40. קפסידים אחרים, כגון AAV9, יעילים פחות בהתמרת סוגי תאים רחבים ועשויים להיות מוסברים על ידי גורמי התקשרות ההסתמכות שלהם שאינם באים לידי ביטוי בהגדרה זו41. לכן, אנו ממליצים על AAV2 כקפסיד הבחירה הראשונה בתאים בתרבית אם תא יעד רצוי לא נבדק בעבר עם rAAV בספרות.
שימו לב שמגבלה עיקרית של תכשירים וקטוריים גולמיים היא שהם אינם מתאימים להתמרה של מודלים של בעלי חיים. מחקרי In vivo דורשים הכנות לטיהור ולהערכת איכות.
ביטוי טרנסגנים ושיקולי אינטגרציה פוטנציאליים rAAVs אינם מביאים באופן אמין לביטוי קבוע של הטרנסגן. עם הזמן, VGs יכולים להיות מושתקים וביטוי מהונדס עשוי להיסגר בעקבות כמה קטעים42. בנוסף, רוב ה-VGs נשארים אפיזומליים, ו-rAAVs אינם מכילים את חלבוני ה-Rep הנגיפיים שיתוווכו אינטגרציה תכופה בגנום המארח כמו בזיהום ליזוגני נגיפי מסוג פראי או יקדמו שכפול של VGs43. כתוצאה מכך, אפיזומים בתאים מותמרים ידוללו בסופו של דבר בין תאי הבת באמצעות חלוקות.
אינטגרציה ברמת הבסיס היא אפשרות לכל חומר הדנ"א המהונדס המועבר. עם זאת, VGs המכילים ITR נוטים לאינטגרציה בתדר גבוה יותר44. לכן, ביטוי קבוע של טרנסגן ניתן לראות בתת-קבוצה קטנה של תאים. משתמשים צריכים לשקול אפשרות זו במיוחד בעת שימוש ב- rAAV כדי לספק אנזימים חותכי DNA, כגון Cas9, מכיוון שהפסקות דו-גדיליות עלולות לגרום לתדירות גדולה עוד יותר של אינטגרציה וביטוי קבוע45. בעוד שזה הופך את rAAV למועמד טוב לאספקת תבניות תיקון מכוונות הומולוגיה לתיוג אנדוגני או הוספת גנים, יש לשקול את האפשרות של החדרת Cas919,46.

בירור הבסיסים המולקולריים של תפקודים תאיים דורש לעתים קרובות ביטוי של דנ"א מהונדס בתרבית תאים. כדי לבוא לידי ביטוי, טרנסגנים חייבים לחדור דרך הממברנה הסלקטיבית של התא ולהגיע לגרעין 1,2. לכן, היכולת לעקוף ביעילות את המחסומים הפיזיים של התא ולתפעל את התהליכים המרכזיים שלו היא הכרחית ליישום טרנסגנזה כדי לחשוף תופעות ביולוגיות חדשות. גישה אחת מנצלת את היכולת הפנימית של נגיפים להעביר ולבטא דנ"א זר 3,4.
נגיף הקשור לאדנו (AAV) הוא אחד מנגיפי היונקים הקטנים ביותר: גנום הדנ"א החד-גדילי שלו, 4.7 קילו-בסיס (kb), מכיל שני גנים, rep (עבור רפליאז) ו-cap (עבור קפסיד), ארוזים בתוך קפסיד איקוסהדרלי של 60 מר בגודל 25 ננומטר. לגנים rep/cap יש מספר רב של מקדמים, מסגרות קריאה ומוצרי splice המקודדים לפחות תשעה חלבונים ייחודיים הדרושים לשכפול נגיפי, ייצור ואריזה 5,6. בנוסף, שני קצוות הגנום מכילים מבנים משניים הנקראים חזרות מסוף הפוכות (ITR) הנחוצים לשכפול DNA, אריזת גנום ועיבוד במורד הזרם במהלך התמרה 7,8,9,10. ה- ITR הם רכיבי ה- DNA היחידים הנדרשים לאריזת הגנום לתוך הקפסיד, ולכן ניתן לשכפל AAV למטרות העברת טרנסגנים על ידי החלפת הגנים החוזרים / כובע הנגיפים בבחירת החוקר של אלמנטים רגולטוריים ו / או גנים בעלי עניין6. ה-AAV הרקומביננטי (rAAV) המתקבל, עם גנום וקטורי מהונדס (VG), נמצא בשימוש נרחב במרפאה לטיפול גנטי אנושי וצבר הצלחות11. שימוש לא מוערך מספיק בווקטור נמצא במעבדה; rAAVs יכולים להשיג ביעילות ביטוי טרנסגנים בתאים בתרבית כדי למלא את צרכי הניסוי של החוקר12.
השיטה הנפוצה ביותר לייצור rAAV היא באמצעות טרנספקציה של פלסמיד משולש לתאי HEK293 או 293T (איור 1). הפלסמיד הראשון, המכונה בדרך כלל פלסמיד סיס, מכיל את הטרנסגן הרצוי משני צדדיו ITR (pAAV). בהתאם ליישום, פלסמידים סיס עם אלמנטים נפוצים, כגון מקדמים חזקים או כלים מבוססי קריספר, זמינים לרכישה. השני הוא פלסמיד pRep/Cap המכיל את הגנים מסוג פרא AAV rep ו-cap המסופקים בטרנס - כלומר, על פלסמיד נפרד, שאינו מכיל ITR המבטא אלמנטים רגולטוריים ומבניים המקיימים אינטראקציה עם פלסמיד סיס - ולכן נקרא פלסמיד טרנס. בנוסף לסגירה פיזית של VG, הקפסיד משפיע על טרופיזם תאי12,13. על ידי אספקת גן הכובע הספציפי לסרוטיפ בטרנס, החוקרים יכולים בקלות למקסם את יעילות ההולכה על ידי בחירת סרוטיפ קפסיד אופטימלי עבור תא היעד הנתון שלהם. לבסוף, כ-Dependoparvovirus, AAV דורש וירוס עוזר כדי להפעיל ביטוי rep/cap מהמקדמים הנגיפיים שלו, המושג על ידי גנים מסייעים אדנו-ויראליים, המסופקים על פלסמיד שלישי כגון pAdΔF614,15. לאחר 72 שעות של טרנספקציית פלסמיד משולש, הווקטור יכול להשתחרר מתאי היצרן למדיה התרבית על ידי מחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים. לאחר מכן נאספים כל תכולת הצלחת, ופסולת תאית גדולה מוסרת באמצעות צנטריפוגה; הסופרנאטנט התקשורתי המתקבל הוא הכנת rAAV גסה המוכנה לתמריצים במורד הזרם.
<img alt="העברת תאים HEK 293 (T), קציר וקטור, דיאגרמת תהליך התמרה, ניתוח ביטוי גנים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: סקירה כללית של ייצור וקטורי rAAV גולמי. ייצור rAAV גולמי וטרנסדוקציה ניתן לבצע בתוך 5 ימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
rAAV עשוי להיות נוח יותר עבור העברת טרנסגנים בהשוואה לשיטות טרנספקציה אחרות, אשר קשורות בדרך כלל עם רעילות תאית, יעילות נמוכה, ריאגנטים יקרים וציוד, כגון עבור electroporation או transfection כימי / שומנים מבוססי16,17. rAAV עוקף מכשולים אלה ולעתים קרובות מספק ביטוי טרנסגנים חזק עם רעילות מינימלית, וזמן מעשי מינימלי. חשוב לציין, ייצור rAAV ויישומו בתרבית תאים הוא פשוט, ורק לעתים רחוקות דורש טיהור של הווקטור ממדיית התרבית (איור 1). בנוסף, rAAV אינו משלב את ה-VG שלו בגנום המארח, בניגוד להעברת טרנסגנים לנטיויראליים, ובכך מפחית את הסיכון למוטגנזה החדרתית18. למרות היתרונות הפוטנציאליים של שימוש ב- rAAV להעברת טרנסגנים, יש לקחת בחשבון מגבלות. חשוב לציין, גודל הטרנסגן, כולל ITRs, לא יעלה על 4.9 KB בשל אילוצים פיזיים של הקפסיד, ובכך להגביל את יכולתו של החוקר לספק ביעילות אלמנטים רגולטוריים גדולים וטרנסגנים. יתר על כן, מכיוון ש-rAAV הוא וירוס שאינו משתלב, התמרה גורמת לביטוי טרנסגנים חולפים בתאים מתחלקים ועשויה שלא להיות מעשית לביטוי יציב. עם זאת, ניתן להשתמש בשיטות המשתמשות בתבניות Cas9 כפולות של rAAV ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR) כדי להכניס רצפים במיקומים גנומיים ספציפיים אם חוקר מעוניין בכך19.

<table><tbody><tr><td>Snapgene DNA צפייה בתוכנה</td><td>Snapgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40</td><td>AddGene</td><td>105533</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/2 (Rep/Cap)</td><td>AddGene</td><td>104963</td><td></td></tr><tr><td>pAd&Delta; F6</td><td>AddGene</td><td>112867</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0418</td><td></td></tr><tr><td>Boekel Scientific Economy חממה דיגיטלית</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000</td><td></td></tr><tr><td>LB בינוני, אבקה</td><td>MP Biomedicals</td><td>113002042</td><td></td></tr><tr><td>קרבנצילין (דיסודיום)</td><td>GoldBio</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>ניו ברונסוויק I26 שייקר</td><td>אפנדורף</td><td>M1324-0000</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>קורנינג</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>22627040</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN פלסמיד פלוס מידי ערכת</td><td>Qiagen</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>PCR לשלוף 8 רצועות צינור</td><td>ארה"ב Scientific</td><td>1402-3900</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler NEXUS</td><td>Eppendorf</td><td>6333000022</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Buffer</td><td>NEB</td><td>B0518S</td><td>מסופק עם רכישת Phusion Polymerase</td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; DNA פולימראז NEB</td><td></td><td>M0530S</td><td></td></tr> צבע <tr><td>טעינת ג'ל בנאמנות גבוהה, כתום (6X)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>DNA נקי & Concentrator-100</td><td>Zymo</td><td>D4029</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean ג'ל שחזור DNA ערכת Zymo</td><td></td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>NotHF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer (10x)</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>מסופק עם רכישת אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ליגאז</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ליגאז מאגר תגובה</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>מסופק עם רכישת צינורות נעילה בטוחה T4 Ligase</td></tr><tr><td>Eppendorf (1.5 מ"ל)</td> <td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>דיוק מיקרו-מעבד אמבט מים</td><td>תרמו מדעי</td><td>51221046</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית פלסטיק סטריליים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>149566B</td><td></td></tr><tr><td>2.0 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>1149Y01</td><td></td></tr><tr><td>ZR פלסמיד מיני-פרפ - קלאסי</td><td>Zymo</td><td>D4015</td><td></td></tr><tr><td>Xma1</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>Sma1</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>תאי HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט</td><td>תרמו-פישר</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Sanyo MCO-18AIC (UV) CO2 אינקובטור</td><td>מרשל סיינטיפיק</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX (פוליאתילנימין הידרוכלוריד)</td> <td>Polysciences</td><td>24765-100</td><td></td></tr><tr><td>מיקסר מערבולת ג'יני 2</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>102091-234</td><td></td></tr><tr><td>Sanyo מקפיא נמוך במיוחד</td><td>Sanyo</td><td>14656-15267-16219</td><td></td></tr><tr><td>INCU-Line IL 10 עם חלון שקוף</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגות אפנדורף</td><td>אפנדורף</td><td>05-400-005</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 96 בארות</td><td>קורנינג</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J עכברי</td><td>JAX</td><td>#000664</td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול אורגנואיד</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>6005</td><td></td></tr><tr><td>תאי L Wnt-3A</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>סיגמא</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>מעכב</td><td>ROCK STEMCELL</td><td>Technologies 72302</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג מטריג'ל גורם גדילה מופחת (GFR) קרום מרתף</td><td>פישר</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>פישר</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 עם 15 מ"מ HEPES</td><td>Stemcell Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>פוליברן</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>48 בארות</td><td>צלחות פישר</td><td>08-772-3D</td><td></td></tr><tr><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp; Nunc Lab-Tek Coverglass Chambered</td><td>Fisher</td><td>12-565-470</td><td></td></tr><tr><td>תאי BeWo</td><td>ATCC</td><td>CCL-98</td><td></td></tr><tr><td>F-12K בינוני</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Hepa1-6</td><td>ATCC</td><td>CRL-1830</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>UC Berkeley BSD מתקן תרבית תאים</td><td>HUH-7</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>HSkMC</td><td>ATCC</td><td>PCS-950-010</td><td></td></tr><tr><td>צמיחת תאי שריר שלד בינונית</td><td>סיגמא</td><td>C-23060</td><td></td></tr><tr><td>התמיינות שרירי השלד בינונית</td><td>סיגמא</td><td>C-23061</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; EVOS מיקרוסקופ פלואורסצנטי צבעוני</td><td>דיגיטלי פישר סיינטיפיק</td><td>12-563-340</td><td></td></tr><tr><td>פרקין אלמר אופרה פניקס</td><td>פרקין אלמר</td><td>HH14001000</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 96 בארות</td><td>פרקין אלמר</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין, ללא פנול אדום</td><td>תרמו-פישר</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>תרמו-פישר</td><td>35050079</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>תרמו-פישר</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/5 (חזרה/כובע)</td><td>Addgene</td><td>104964</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/8 (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td></td> 112864-pAAV-DJ-N589X <td></td></tr><tr><td>(Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td></td> 130878-pAAV2<td></td></tr><tr><td>/9n (Rep/Cap)</td><td>Addgene</td><td></td> 112865-pAnc80L65AAP <td></td></tr><tr><td></td><td>Addgene</td><td>92307</td><td></td></tr><tr><td>KP1 (נציג/כובע)</td><td></td><td></td><td>מתנה על ידי פרופסור מארק קיי (אוניברסיטת סטנפורד)</td></tr><tr><td>LK03 (נציג/כובע)</td><td></td><td></td><td>מתנה על ידי פרופסור מארק קיי (אוניברסיטת סטנפורד)</td></tr><tr><td>pAAV4 (נציג/כובע)</td><td></td><td></td><td>מתנה על ידי פרופסור לוק ונדנברג (בית הספר לרפואה של הרווארד)</td></tr><tr><td>pAAV.Cas9.sgRNA</td><td>Addgene</td><td>61591</td><td></td></tr><tr><td>pAAV.MCS</td><td>Addgene</td><td>46954</td><td></td></tr><tr><td>gBlock (פרגמנט DNA סינתטי)</td> <td>IDT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ביטוי טרנסגנים בתאים בתרבית באמצעות וקטורים נגיפיים רקומביננטיים לא מטוהרים הקשורים באדנו

Transgene Expression in Cultured Cells Using Unpurified Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors

וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו (rAAV) יכולים להשיג ביטוי טרנסגנים חזק ועמיד ללא אינטגרציה במגוון רחב של סוגי רקמות, מה שהופך אותם לבחירה פופולרית להעברת גנים במודלים של בעלי חיים ובמסגרות קליניות. בנוסף ליישומים טיפוליים, rAAVs הם כלי מעבדה שימושי להעברת טרנסגנים המותאמים לצרכי הניסוי של החוקר ולמטרות המדעיות שלו בתאים בתרבית. כמה דוגמאות כוללות גנים אקסוגניים של כתבים, קלטות ביטוי יתר, הפרעות RNA וכלים מבוססי קריספר, כולל אלה עבור מסכים ברחבי הגנום. התמרה rAAV פחות מזיקה לתאים מאשר אלקטרופורציה או הדבקה כימית ואינה דורשת ציוד מיוחד או ריאגנטים יקרים כדי לייצר. ניתן להוסיף ליזטים גולמיים או מדיה מותנית המכילה rAAV ישירות לתאים בתרבית ללא טיהור נוסף כדי להתמיר סוגי תאים רבים – תכונה שאינה מוערכת מספיק של rAAVs. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים לשיבוט קלטות טרנסגנים בסיסיות ומדגימים כיצד לייצר וליישם תכשירי rAAV גולמיים על תאים בתרבית. כהוכחה עקרונית, אנו מדגימים התמרה של שלושה סוגי תאים שעדיין לא דווחו ביישומי rAAV: תאי שליה, מיובלסטים ואורגנואידים של המעי הדק. אנו דנים בשימושים מתאימים לתכשירי rAAV גולמיים, במגבלות של rAAV להעברת גנים, ובשיקולים לבחירת קפסיד. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, זולה ויעילה עבור חוקרים להשגת העברת DNA פרודוקטיבית בתרבית תאים באמצעות rAAV ללא צורך בשלבי טיטרציה וטיהור מייגעים.

מציאת קפסיד אופטימלי להמרת תאים מתורבתים בעלי עניין מגוון סוגי תאים הומרו כדי לקבוע את הטרופיזם של סרוטיפים שונים של קפסיד (איור 5). הסרוטיפים הטבעיים AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24, וגרסאות הקפסיד המהונדסות Anc80 25, DJ 26, LK0327 ו-KP1 28 נארזו עם גנום וקטורי המבטא mScarlet תחת מקדם CMV, ששובט בשיטות המפורטות בפרוטוקול זה. תכשירי וקטור גולמי ללא טיטציה דוללו באמצעי התרבית המתאימים, ותאים הומרו במשך 24+ שעות וצולמו (איור 5B). יעילות ההתמרה חושבה על ידי החלק היחסי של סך התאים שהיו mScarlet+, או שיעור התאים במישור z יחיד שהיו mScarlet+ (עבור אורגנואידים של עכבר במעי הדק; איור 5C). יעילות התמרה (תאי mScarlet+) אינה מסופקת עבור צינוריות מיו-צינוריות C2C12 ו-HSkMC ממוינות, אלא עבור מיובלסטים C2C12 ו-HSkMC לא ממוינים (איור 5A).
AAV2 ו-KP1 היו הסרוטיפים החזקים ביותר בקווי תאים שנבדקו (איור 5A). כמו כן נצפה כי סוגי תאים דומים שמקורם במינים שונים מומרים ביעילות משתנה. לדוגמה, Hepa1-6 (קו תאי כבד שמקורו במורין) מציג ירידה ניכרת בהתמרה בהשוואה ל-Huh7 (קו תאי כבד שמקורו בבני אדם) בעת שימוש ב-AAV2 (איור 5B). יתר על כן, תנאי מדיה שונים ממלאים תפקיד חשוב במהלך ההעברה. אורגנואידים של עכברים במעי דק (mSIOs) שגודלו בתרבית במצע קדם-טרנסדוקציה עוברים פחות טרנסדוקציה בהשוואה לאלה שגודלו בתרבית במצעי גדילה אורגנואידים (איור 5C). נוסף על כך, AAV2 מתמיר ביעילות מיובלסטים לא ממוינים של HSkMC ומיובלסטים של HSkMC ממוינים (איור 5B), אף על פי שניתוח כמותי של מיו-צינוריות הוא קשה ולכן אינו מסופק.
יעילות ההתמרה הגבוהה שנצפתה עבור סוגי תאים שונים באיור 5 מראה שניתן להשתמש בתכשירים וקטוריים גולמיים ביעילות כדי להתמיר מגוון סוגי תאים ללא שלבים נוספים כגון טיהור וטיטרציה. עם זאת, יש לשקול היטב בעת בחירת קפסיד כדי למקסם את העברת הטרנסגנים. קווי תאים וקפסידים רבים אחרים נבדקו בעבר ומתפרסמים, אם כי עם תכשירים וקטוריים מטוהרים12.
השפעה בלתי תלויה של חלקיק וקטורי בתנאי מדיה יכולה להשפיע על יעילות הטרנסדוקציה. עם זאת, מקובל כי טרופיזם (כלומר, ספיגה ספציפית לסוג התא וביטוי של וקטור) הוא תכונה שהיא ספציפית לקפסיד29. השוואה בין תכשירים גולמיים ומטוהרים התואמים למינון עדיין לא נצפתה כמשפיעה על הטרופיזם התאי. לכן, ניתן להשתמש בתכשירים וקטוריים גולמיים באופן דומה לווקטורים מטוהרים בתרבית תאים.
<img alt="יעילות התמרה וקטורית AAV בקווי תאים; תרשים נתונים, תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65572/65572fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> איור 5: התמרה וקטורית גולמית של סוגי תאים שונים. (A) אחוז mScarlet+ לאחר הוספה של וקטורי AAV שונים המכילים טרנסגן mScarlet . (B) תאים המבטאים mScarlet המועברים מסרוטיפ AAV 2. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר (Hepa1-6, Huh7, C2C12 ו-HSkMC), 200 מיקרומטר (BeWo), 20 מיקרומטר (mSIO). קיצורים: hpt = שעות לאחר ההעברה. (C) אורגנואידים של עכברים במעי דק (mSIOs) טופלו ב-rAAV במצע קדם-התמרה או במצע גדילה אורגנואידי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/65572fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה משלימה 1: דף עבודה של טרנספקציה פלסמיד משולש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/TriplePlasmidTransfection_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 2: גליון עבודה לאופטימיזציה של PEI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65572/PEIoptimization_Worksheet_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

וירוס רקומביננטי הקשור באדנו (rAAV) נמצא בשימוש נרחב להעברת גנים קליניים ופרה-קליניים. שימוש לא מוערך מספיק עבור rAAVs הוא התמרה חזקה של תאים בתרבית ללא צורך בטיהור. עבור חוקרים חדשים ב-rAAV, אנו מספקים פרוטוקול לשיבוט קלטות טרנסגניות, ייצור וקטורים גולמיים והתמרה של תרביות תאים.

Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) can achieve potent and durable transgene expression without integration in a broad range of tissue ...

ריפוי גנטי משתמש בקפסיד נגיפי כדי להחדיר דנ"א לתאים, ואז התאים מעבדים את הדנ"א הזה באמצעות מנגנונים שאינם מובנים במלואם. על ידי חקר האופן שבו התא מעבד AAV מספק DNA, אנו מקווים לשפר את הבטיחות, היעילות ואריכות הימים של טיפולים גנטיים AAV. חקר עיבוד דנ"א AAV ברמת הרקמה או האורגניזם היה די קשה.ובזמן שפיתחנו פרוטוקולים להתמרה של תרביות תאים עבור הדמיה של AAV באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציית על, גילינו שהפשטות של ייצור ושימוש בתכשירי AAV לא מטוהרים בתרבית תאים אינה ידועה. שיטה פשוטה זו לביטוי ארעי יכולה להועיל לחוקרים בתחומים רבים. יצירת תכשירי AAV גולמיים היא די פשוטה, ויש להם חיי מדף ארוכים F4C, המאפשר להם לשמש בניסויים רבים.החלתם היא פשוטה, מה שהופך אותם לחלופה זמן וחסכונית לריאגנטים טרנספקציה סטנדרטיים. לעתים קרובות תכשירים גולמיים AAV יעילים יותר ורעילים פחות מאשר טרנספקציה. לווקטרולוגיה יש שתי זרועות, ייצור והתמירה, ושתיהן תלויות לחלוטין במנגנון התאי המארח.המחקר העתידי שלנו נועד לזהות את המנגנונים התאיים המעורבים בתהליכים אלה ודרכים לתמרן אותם כדי שנוכל לשפר את יעילות הייצור וההולכה. הבנת הביולוגיה הבסיסית העומדת בבסיס שתי זרועות הווקטרולוגיה חיונית להצלחת הטיפולים הגנטיים.

transgene-expression-cultured-cells-using-unpurified-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה, אנו מתארים את הזיהוי של adeno הקשורים וירוס סרוטיפ 3 (AAV3) כווקטור היעילה ביותר להכוונת האדם תאים סרטניים בכבד.

יעילות גבוהה התמרה של תאים סרטניים בכבד על ידי סרוטיפ Adeno-Associated וירוס רקומביננטי 3 וקטורים

רקומביננטי adeno הקשורים וירוס (rAAVs) וקטורים נעשים חשובים יותר ויותר...

ייצור Titering של Adeno הקשורים ווקטורים רקומביננטי ויראלי

אנחנו מדגימים את הטכניקה הבסיסית מולקולרי מהנדס ולהתפתח סינתטיים Adeno הקשורים נגיפיים (AAV) טיפול וקטורים גנים באמצעות DNA המשפחה גרירת רגליים. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כלליות ודוגמאות נציג לבחירת וניתוח של capsids chimeric בודדים בעלי תכונות משופרות על תאים היעד בתרבות או בעכברים.

הנדסה האבולוציה של הנגיף Adeno הקשורים סינתטי (AAV) בריפוי גנטי באמצעות וקטור משפחת ה-DNA של גרירת רגליים

העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T...

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

תוך הזרקה של recombinase תלויה רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV) ניתן להשתמש כדי לטפל בכל סוג התא גנטית שכותרתה בחוט השדרה. כאן נתאר כיצד מגלי נוירונים ב הצופר הגבי של חוט השדרה המותני. טכניקה זו מאפשרת פונקציונלי חקירתו של המשנה נוירון מניפולציה.

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

כאן, אנו מתארים אסטרטגיית לשחזור ויעילה כדי לייצר כייל נוגדנים, בקרת איכות קבוצות של וקטורים adeno-הקשורים וירוס. היא מאפשרת למשתמש לקבל הכנה וקטור עם כייל גבוה (≥1 x 1013 וקטור הגנום/mL) ואת טוהר גבוהה, מוכן לשימוש במבחנה או ויוו .

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור אדנווירוס באמצעות מערכת pAdEasy. הטכנולוגיה כוללת שילוב מחדש של pAdTrack ו pAdEasy-1 פלסמידים, האריזה וההגברה אדנווירוס, טיהור של חלקיקים אדנו-ויראליים מן מדיום lysate ותרבות התא, titration ויראלי, ואת הבדיקה הפונקציונלית של אדנווירוס.

שיטה יעילה לייצור אדנווירוס

שיטות מתוארות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוסים רקומביננטיים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי להתמיר את המכרסם המקומי urothelium המאפשר ביטוי של transgenes או downregulation של תוצרי גנים אנדוגניים.

ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס

וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .

תרבית תרחיף ייצור וטיהור של וירוס הקשור לאדנו על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול עבור יישומי in vivo

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירה וטיהור של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות שיטת כרומטוגרפיית זיקה אופטימלית מבוססת הפרין. הוא מציג גישה פשוטה, ניתנת להרחבה וחסכונית, ומבטל את הצורך באולטרה-צנטריפוגה. הווקטורים המתקבלים מפגינים טוהר גבוה ופעילות ביולוגית, מה שמוכיח את ערכם במחקרים פרה-קליניים.

בידוד של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות פרוטוקול כרומטוגרפיית זיקה הפרין חד-שלבי וחצי אוטומטי

למדו שיטה יעילה להעברת גנים בתאים בתרבית באמצעות וקטורים נגיפיים רקומביננטיים לא מטוהרים. שיטה זו מציעה חלופה פשוטה וחסכונית לשיטות טרנספקציה מסורתיות במחקר תרפיית גנים.

ביטוי טרנסגנים בתאים בתרבית באמצעות וקטורים נגיפיים רקומביננטיים לא מטוהרים הקשורים באדנו

גלה סרטונים נוספים