בדיקת שינוי היסטון באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה בזמן טיסה
12 בינואר 2024
תהליך עבודה אנליטי המבוסס על כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסה של זמן טיסה (LC-TIMS-ToF MS/MS) לביטחון גבוה וניתוח "מלמטה למעלה" בעל יכולת שחזור גבוהה של שינויים וזיהוי של היסטון בהתבסס על פרמטרים עיקריים (זמן שמירה [RT], חתך התנגשות [CCS] ויחס מסה למטען מדויק [m/z]).
שיטה מוצעת באמצעות פרוטוקול מיצוי היסטון עם יעילות של 95%. יחד עם LC-TIMS-ToF MS/MS, תוך זמן קצר, ניתן לקבל סינון עבור אותם PTMs הנמצאים בהיסטון. ומעל לכל, את האפשרות של הפרדת איזומרים.
ההפרדה של פפטידים איזומריים, למרות שהיא אפשרית באמצעות ספקטרומטריית מסות טנדם בלבד, היא לעתים קרובות קשה. על ידי שילוב TIMS, אנו מציגים ממד נוסף של הפרדה, ומפשטים זיהויים רבים של איזומרים מיקום. בנוסף, טכנולוגיה פסיבית מגבירה את הרגישות של ניסויים אלה, ומשפרת עוד יותר את יכולתנו לנתח וריאציות אפיגנטיות.
עם היכולת המוגברת לזהות עמדות PTM, מגיעה היכולת לקבוע עוד יותר את הקשר בין גורמים סביבתיים או ביולוגיים שונים, ואת השפעתם על האפיגנום. שיטות המשפרות ומקלות על ניתוח היסטונים יכולות להיות מיושמות במספר תחומי מחקר, כולל כימיה רפואית וסביבתית. הדינמיקה של אישור חלבון במצבים טבעיים או פגומים תיקבע מיישום TIMS MS/MS עם HDX.
באמצעות LC-TIMS-ToF MS/MS ו-Nano LC-TIMS-ToF MS/MS, ימופו ההבדלים ב-PTM הקיימים בדגימות ביולוגיות שונות.
סקירה כללית
מחקר זה מציג תזרים עבודה אנליטי המשתמש בכרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית ניידות יונים לכודים וספקטרומטריית מסות עם זמן מעוף (LC-TIMS-ToF MS/MS) לצורך ניתוח ברמת ביטחון גבוהה של מודיפיקציות בהיסטונים. השיטה משפרת באופן משמעותי את הזיהוי של מודיפיקציות לאחר תרגום (PTMs) ואת האיזומרים המיקומיים שלהן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- אפיגנטיקה
רקע
- היסטונים ממלאים תפקיד מכריע בבקרת ביטוי גנים באמצעות מ модиפיקציות שונות.
- זיהוי מודיפיקציות אלו חיוני להבנת מנגנונים אפיגנטיים.
- שיטות מסורתיות ניצבות בפני אתגרים בהפרדת איזומרים.
- שילוב של TIMS מציע ממד חדש להפרדה משופרת.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להפקה ולניתוח יעילים של היסטונים.
- שיפור הזיהוי של PTMs והאיזומרים שלהם.
- ביצוע קורלציה בין גורמים סביבתיים לבין וריאציות אפיגנטיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרוטוקול למיצוי היסטונים המשיג יעילות של 95%.
- LC-TIMS-ToF MS/MS לאנליזה ברזולוציה גבוהה.
- טכנולוגיה פסיבית להגברת הרגישות בניסויים.
- סריקה של PTMs הנוכחים בהיסטונים.
תוצאות עיקריות
- הפרדה מוצלחת של פפטידים איזומריים באמצעות TIMS.
- זיהוי משופר של מיקומי PTM.
- יכולת משופרת לניתוח וריאציות אפיגנטיות.
- מתאמים פוטנציאליים בין גורמים ביולוגיים לבין האפיגנום.
מסקנות
- השיטה המוצעת משפרת באופן משמעותי את ניתוח המודיפיקציות של ההיסטונים.
- שילוב של TIMS מפשט את זיהוי האיזומרים.
- גישה זו פותחת נתיבים למחקר נוסף של השפעות אפיגנטיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סריקה בתושבה גבוהה (High-throughput screening) של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות (PTMs) של היסטונים באמצעות LC-TIMS-ToF MS/MS נותנת מענה לצורך קריטי במיפוי אפיגנטי מדויק בשלבי הגילוי המוקדמים ובתיקוף מטרות. היכולת לשייך בביטחון את מיקומי ה-PTM ולהבחין בין צורות איזומריות מגבירה את רמת הוודאות החיזויית בקישור מצבים אפיגנטיים לתגובות ביולוגיות. תהליך עבודה זה תומך בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח מותאמות סיכון על ידי מתן אפשרות לניתוח כמותי ואיתן של מודיפיקציות כרומטין הרלוונטיות למנגנוני מחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מנגנוני בקרה אפיגנטיים באמצעות מיפוי PTM ברמת ביטחון גבוהה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי הבחנה בין איזומרים מיקומיים של מודיפיקציות היסטון.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי קישור דפוסי PTM לגורמים סביבתיים או גנטיים.
- משפר את הביטחון החזוי לקידום מטרות אפיגנטיות בצינור הגילוי.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מכין דגימות ביולוגיות מתוקפות לסריקה המשכית של תרכובות המשנות כרומטין.
- מספק פרופילי PTM כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה והשוואה לביצועים (benchmarking).
- מאפשר ניתוח רב-דגימתי (high-throughput) הניתן להרחבה ומתאים למסעות סריקה.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על נופי המודיפיקציות של ההיסטונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם את זיהוי ה-PTM עם סמנים אפיגנטיים רלוונטיים למחלה כאשר הקשר של הדגימה תומך בכך.
- מספק רציפות משלב מיפוי אפיגנטי של שלב הגילוי ועד לתיקוף במודל פרה-קליני.
- מאפשר התקדמות מותאמת סיכונים על ידי כימות שינויי PTM בתגובה להפרעות ביולוגיות.
- תומך בהורדת סיכונים מנגנונית במחקר תרגומי באמצעות פרופיל מפורט של מודיפיקציות.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
פרוטוקול LC-TIMS-ToF MS/MS זה משלב שלבים החל מגילוי ראשוני ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ותומך בתהליכי עבודה המבוססים הן על השערות והן על סריקה במחקר אפיגנטיקה.
- ביולוגיה של התגליות: מקלה על בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים על ידי מיפוי תבניות PTM לתוצאות ביולוגיות.
- סריקה: מספקת נתוני PTM כמותיים המוכנים לבדיקה לצורך הערכת תרכובות ובחינת הדירות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות ברזולוציה גבוהה של מיקומי PTM, הפרדת איזומרים וספקטרום פרגמנטציה לצורך אנליזה השוואתית.
- מחקר תרגומי: מאפשרת התאמה של פרופילי PTM למודלים של מחלות ולאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים במידת הרלוונטיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה אנליטית הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרים אפיגנטיים שוטפים במסגרת תוכניות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות אפיגנטיות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של ניתוח PTM עם רמת הדירות ותפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ובניהול יעיל של תיק הנכסים מבחינת הון.
- השפעה על תיק הנכסים: מאפשר תעדוף של מטרות ותוכניות אפיגנטיות מותאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בספקטרומטריית מסות, כרומטוגרפיה וניתוח נתוני פרוטאומיקה.
- מחייב גישה למכשור LC-TIMS-ToF MS/MS מתקדם ולתוכנות תומכות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת דגימות ופירוש נתונים.
- עשוי לדרוש התאמה למטריצות ביולוגיות שונות או למקורות היסטונים שונים.
- כיול המכשיר ואופטימיזציה של השיטה הם קריטיים עבור השחזוריות והרגישות.
