Name: זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: למד שיטת זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus באמצעות ארגינין או ליזין. גישה זו פשוטה, זולה ויעילה יותר משיטות מסורתיות לבידוד אנזימים פיברינוליטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי לשכת המדע והטכנולוגיה של העיר שיאמן (3502Z20227197) ולשכת המדע והטכנולוגיה של מחוז פוג'יאן (מס '2019J01070, מס '2021Y0027).

1. הכנה
<ol><li>טיפול לדוגמה<ol><li>בזהירות לנתח טרי S. nudus (100 גרם) ולאסוף את המעי ואת הנוזל הפנימי שלה.</li>
		<li>הוסף 300 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4) להומוגניזציה (1,000 סל"ד, 60 שניות).</li>
		<li>להקפיא-להפשיר את הומוגנט 3x.</li>
		<li>צנטריפוגו את הדגימה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) ואספו את הסופרנטנט. יש לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.</li>
	</ol></li>
	<li>משקעים חלבוניים<ol><li>מערבבים את הסופרנאטנט עם תמיסת אמוניום סולפט רווי (תשעה כרכים) ומניחים לתערובת לעמוד במשך 12 שעות ב-4°C. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולהמשיך אותו מאוחר יותר.</li>
		<li>צנטריפוגה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) כדי להשיג את משקע החלבון; יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>תרחיף חלבונים<ol><li>להשהות מחדש את משקע החלבון עם 30 מ"ל של מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4). אחסנו את תמיסת החלבון הגולמי בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
</ol>2. כרומטוגרפיית זיקה
<ol><li>סינון פתרונות<ol><li>סנן את תמיסת החלבון הגולמי דרך קרום מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן דגימה זו בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>אריזת עמודות<ol><li>ארוז את עמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז ואת עמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין-אגרוז על ידי טעינת כמות מתאימה של מדיום מטריצת ליזין-אגרוז ומדיום מטריצת ארגינין-אגרוז לעמודות כרומטוגרפיה ריקות של 5 מ"ל. הערה: ניתן לאחסן את העמודה בטמפרטורה של 2-8°C, כאשר המטריצה שקועה במאגר האחסון (20% אתנול).</li>
	</ol></li>
	<li>טיהור אהדה<ol><li>אזן את עמודת כרומטוגרפיית הזיקה עם ddH2O תחילה (1 מ"ל/דקה, 10 כרכים של עמודות), ואחריו מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 8.0, 1 מ"ל/דקה, 5 אמצעי אחסון).</li>
		<li>טען את דגימת תמיסת החלבון על העמודה המאוזנת מראש (1 מ"ל/דקה, נפח של 1/3 עמודה). הערה: נפח טעינת הדגימה תלוי בריכוז sFE.</li>
		<li>שטוף את העמודה באמצעות מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 8.0, חמישה כרכי עמודות).</li>
		<li>הצביעו על העמוד ברצף באורך 0.15 מ', 0.25 מ', 0.35 מ', 0.45 מ', 0.55 מ' ו-0.65 מ' NaCl (1 מ"ל/דקה, חמישה כרכי עמודות).</li>
		<li>חפש את שיא האלוציה שאמור להופיע ב- 0.15 M NaCl elution, ולאחר מכן אסוף את השברים בצינורות 5 מ"ל.</li>
		<li>רכז את דגימת האלוציה באמצעות מסנן אולטרה צנטריפוגלי 3 kD (3,944 × גרם, 1.5 שעות, 4 ° C). אחסן דגימה זו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הערכת טוהר
<ol><li>נתרן דודציל-סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'ל הכנה<ol><li>הכינו את ג'ל SDS-PAGE לפי השיטה של Laemmli באמצעות 5% ג'ל מרוכז ו-12% ג'ל הפרדה13.</li>
	</ol></li>
	<li>אלקטרופורזה<ol><li>ערבבו את הדגימה (15 מיקרוליטר) עם מאגר העמסת חלבון 5x SDS-PAGE (1/4 נפח), חממו במים רותחים למשך 5 דקות, טענו על ג'ל SDS-PAGE והפעילו את הג'ל במתח של 80 וולט, 60 מיליאמפר למשך שעה וחצי.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח<ol><li>לאחר אלקטרופורזה יש לצבוע את הג'ל בערכת כתמים כסופה, בהתאם לפרוטוקול היצרן, ולצפות בג'ל המוכתם באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנטית.</li>
		<li>נתח את טוהר חלבון המטרה באמצעות הנוסחה הבאה: טוהר חלבון המטרה = ערך העוצמה של חלבון המטרה / ערך העוצמה של סך החלבון.</li>
	</ol></li>
</ol>4. הערכת פעילות פיברינוליטית
<ol><li>הכנת צלחת פיברין<ol><li>הכן את הפתרון פיברינוגן על ידי ערבוב 25 מ"ג של פיברינוגן עם 1.25 מ"ל של מלוחים פיזיולוגיים.</li>
		<li>הכן את פתרון תרומבין על ידי ערבוב מלא 100 U של תרומבין עם 1.05 מ"ל של מלוחים פיזיולוגיים.</li>
		<li>הכן את תמיסת האגרוז על ידי הוספת 0.5 גרם אגרוז ל 22.5 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 mol/L, pH 7.4). מערבבים ומחממים את תמיסת האגרוז ב-100°C עד להמסה מלאה.</li>
		<li>מצננים את תמיסת האגרוז עד לסביבות 50°C ומוסיפים תמיסת פיברינוגן. לאחר מכן, מיד להוסיף את פתרון טרומבין, לערבב אותם במהירות, ויוצקים אותם לתוך צלחת תרבית 60 מ"מ.</li>
	</ol></li>
	<li>טעינת<ol><li>ניקבו בארות 3 מ"מ על לוחות הפיברין המוכנים באמצעות בורר סטרילי ומלאו את הבארות בדגימות 10 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח<ol><li>לאחר 18 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, למדוד את הפעילות הפיברינוליטית על ידי חישוב גודל האזורים השפלה שלהם. פעילות פיברינוליטית = (גודל אזור הדגימה / גודל אזור האורוקינאז) x 100 U. גודל אזור = קוטר x קוטר. הערה: חיץ מלח פיזיולוגי, חלבון גולמי (הדגימה המתקבלת בשלב פרוטוקול 1.3.1) ואורוקינאז שימשו לבקרה הריקה, השלילית והחיובית, בהתאמה. בהשוואה לאורוקינאז, מצאנו כי הפעילות הפיברינוליטית של sFE מטוהר הייתה ~ 19,200 U/mL.</li>
	</ol></li>
</ol>

טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

<ol><li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li>
<li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li>
<li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li>
<li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmin-antiplasmin+system%3A+structural+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li>
<li>Ge, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li>
<li>Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starase%3A+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris%3A+purification%2C+identification%2C+antithrombotic+evaluation%2C+and+mechanisms+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant%2C+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).</li>
<li>Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019).</li>
<li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li>
<li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li>
<li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li>
<li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-chromatographic+purification+of+human+%CE%B12-antiplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li>
<li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li>
<li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+plasma%2Fcellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li>
<li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+%28rt-PA%29+from+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li>
<li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בשל חוסר הזמינות של רצף הגן המדויק של sFE, sFE הנמצא בשימוש כיום הופק מ-S. nudus14 טרי. יתר על כן, הליכי הטיהור של sFE שדווחו בספרות היו מסובכים ויקרים, מכיוון שהם התבססו על כמה תכונות כלליות של sFE, כגון משקל מולקולרי, נקודה איזואלקטרית, חוזק יוני וקוטביות15,16. עד כה לא דווח על פרוטוקול טיהור זיקה של sFE. במחקר זה, פרוטוקול טיהור זיקה של sFE פותח בהצלחה בהתבסס על הידע של המבנה הגבישי שלו. בהשוואה לשיטות הטיהור המדווחות, שיטת טיה...

פקקת היא איום מרכזי על בריאות הציבור, במיוחד לאחר מגיפת Covid-19 העולמית 1,2. מבחינה קלינית, מפעילי פלסמינוגן רבים (PAs), כגון מפעיל פלסמינוגן מסוג רקמות (tPA) ואורוקינאז (בריטניה), נמצאים בשימוש נרחב כתרופות טרומבוליטיות. PAs יכולים להפעיל את הפלזמינוגן של החולים לפלסמין פעיל כדי לפרק פיברין. לפיכך, יעילות thrombolytic שלהם מוגבל מאוד על ידי מצב פלסמינוגןשל החולים 3,4. חומרים פיברינוליטיים, כגון פלסמין מטאלופרוטאינאז ופלסמין סרין, הם סוג נוסף של תרופה תרומבוליטית קלינית הכוללת גם אנזימים פיברינוליטיים (FE) כגון פלסמין, אשר יכולים להמיס קרישי דם ישירות אך מושבתים במהירות על ידי מעכבי פלסמין שונים5. לאחר מכן, דווח על סוג חדש של סוכן פיברינוליטי שיכול להמיס את הפקקת לא רק על ידי הפעלת הפלזמינוגן לפלסמין, אלא גם פירוק הפיברין ישירות 6-האנזים הפיברינוליטי מתולעת הבוטנים העתיקה Sipunculus nudus (sFE)6. דו-תפקודי זה מעניק ל-sFE יתרונות נוספים על פני תרופות טרומבוליטיות מסורתיות, במיוחד במונחים של מצב פלסמינוגן חריג. בהשוואה לחומרים פיברינוליטיים דו-תפקודיים אחרים 7,8,9, sFE מציג מספר יתרונות, כולל בטיחות, על פני חומרים שאינם נגזרים ממזון לפיתוח תרופות, במיוחד עבור תרופות דרך הפה. הסיבה לכך היא שהבטיחות הביולוגית והתאימות הביולוגית של Sipunculus nudus התבססו היטב10.
בדומה לחומרים פיברינוליטיים טבעיים אחרים שבודדו ממיקרואורגניזמים, תולעי אדמה ופטריות, טיהור sFE מ-S. nudus הוא מסובך מאוד וכולל שלבים מרובים, כגון הומוגניזציה של רקמות, משקעים של אמוניום סולפט, התפלה, כרומטוגרפיה של חילופי אניון, כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית וניפוי מולקולרי10,11,12. מערכת טיהור כזו לא רק תלויה במיומנויות מיומנות וחומרים יקרים, אלא גם דורשת מספר ימים כדי להשלים את כל ההליך. לכן, תוכנית טיהור פשוטה של sFE היא בעלת משמעות רבה לפיתוח נוסף של sFE. למרבה המזל, שני גבישים של sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) הושגו בהצלחה (ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2). באמצעות ניתוח מבני וניסויי עגינה מולקולרית, מצאנו כי הליבה הקטליטית של sFE יכולה להיקשר באופן ספציפי למטרות המכילות שאריות ארגינין או ליזין.
כאן הוצעה לראשונה מערכת טיהור זיקה, המבוססת על המבנה הגבישי של sFE. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לטהר sFE טהור מאוד ופעיל מאוד מהתמציות הגולמיות בשלב טיהור זיקה יחיד. הפרוטוקול שפותח כאן חשוב לא רק להכנת בקנה מידה גדול של sFE, אלא גם עשוי להיות מיושם לטיהור של סוכנים פיברינוליטיים אחרים.

<table><tbody><tr><td>30% אקרילאמיד-ביסקרילאמיד (29:1)</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose G-10</td><td>Biowest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמוניום סולפט</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארגינין-ספרוז 4B</td><td>Solarbio</td><td>Arginine-agarose matrix</td><td></td></tr><tr><td>ברומוקסילנול כחול (BPB)</td> <td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fast Silver Stain Kit</td><td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinase</td><td>RHAWN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ליזין-ספרוז 4B</td><td>Solarbio</td> מטריצת <td></td><td>ליזין-אגרוז</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-טטרמתילאתילנדיאמין (TEMED)</td>סמן חלבון צבע <td>מוכתם-סיגמא-אולדריץ</td><td></td><td></td></tr>' <tr><td>(10-170 kD)</td><td>ביוטיים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סינופארם</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפונאט (SDS)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>' נתרן הידרוקסיד</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרומבין</td><td>מיילונביו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן</td><td>סולארביו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן הידרוכלוריד</td><td>סולארביו</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT מערכת טיהור חלבון GE</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>טהורמעקר קיטור בלחץ אנכי אוטומטי MLS-3750</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיה כימילומינסנציה</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבת זרימה קבועה BT-100</td><td>QITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממת טמפרטורה קבועה</td><td>JINGHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת שולחנית 3-30KS</td> תנור חימום וייבוש מסדרת <td>SIGMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DHG DGG-9140AD</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר זכוכית חשמלית DY89-II</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי אלקטרוני</td><td>DENVER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים אלקטרו-תרמוסטטי DK-S12</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שייקר אופקי להסרת צבע</td> מכונת קרח <td>קיילין-בל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AF 103</td><td>סקוטי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KQ-500E מנקה אולטרסאונד</td><td>ShuMei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בוחש מגנטי</td><td>Zhi wei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מיקרו מקוררת H1650-W</td><td>Cence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תנור מיקרוגל</td><td>Galanz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q התייחסות</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מד pH שולחני מדויק</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנד מערבולת בגודל קטן</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה אנכית</td><td>ביו-רד</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומר מתכלה&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; צינור L PCR (200 ומיקרו; L)</td>צינור צנטריפוגה <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1.5 מ"ל)</td><td></td>צינור צנטריפוגה Biosharp <td></td><td></td></tr><tr><td>(5 מ"ל)</td><td></td>צינור צנטריפוגה Biosharp <td></td><td></td></tr><tr><td>(50 מ"ל)</td><td></td>צינור צנטריפוגה NEST <td></td><td></td></tr><tr><td>(7 מ"ל)</td>צלחת תרבית <td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(60 מ"מ)</td>קרום מסנן <td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(0.22 & מיקרו; m)</td> <td>Millex GP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tip Tip (1 מ"ל</td>) <td>KIRGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tip (10 ומיקרו; L)</td> קצה פיפטה <td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(200 ומיקרו; L)</td> נייר אינדיקטור מיוחד <td>של Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>יחידת מסנן אולטרה צנטריפוגלי TZAKZY</td><td></td> (15 מ"ל 3 KDa)יחידת מסנן אולטרה צנטריפוגלית Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td>(4 מ"ל 3 KDa)</td> <td>מגיב</td> SSS מחוון pH אוניברסלי של Millipore <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-sipunculus nudus

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

האנזים הפיברינוליטי של Sipunculus nudus (sFE) הוא סוכן פיברינוליטי חדשני שיכול גם להפעיל פלסמינוגן לפלסמין וגם לפרק פיברין ישירות, מה שמראה יתרונות גדולים על פני סוכנים טרומבוליטיים מסורתיים. עם זאת, בשל היעדר מידע מבני, כל תוכניות הטיהור עבור sFE מבוססות על טיהור כרומטוגרפיה רב-שלבית, שהם מסובכים ויקרים מדי. כאן, פרוטוקול טיהור זיקה של sFE פותח לראשונה על בסיס מבנה גבישי של sFE; הוא כולל הכנת הדגימה הגולמי ועמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין/ארגינין-אגרוז, טיהור זיקה ואפיון ה-SFE המטוהר. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לטהר אצווה של sFE תוך יום אחד. יתר על כן, הטוהר והפעילות של sFE מטוהר עולה ל 92% ו 19,200 U / mL, בהתאמה. לכן, זוהי גישה פשוטה, זולה ויעילה לטיהור sFE. הפיתוח של פרוטוקול זה הוא בעל משמעות רבה לשימוש נוסף של sFE וסוכנים דומים אחרים.

בעקבות פרוטוקול זה הופקו ליזטים גולמיים של רקמות, נבנו עמודות כרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז וליזין-אגרוז, התקבל sFE מטוהר, והטוהר והפעילות הפיברינוליטית של ה-sFE המטוהר נמדדו על ידי לוחות SDS-PAGE ופיברין, בהתאמה.
לאחר הצנטריפוגה, הסופרנאטנט שנאסף היה נוזל צמיגי שזוף שקוף. המשקעים החלו כאשר סופרנאטנט זה עורבב עם תמיסת אמוניום סולפט רווי (תשעה כרכים). לאחר עמידה של 12 שעות, נוצר שקע כבד בתחתית הצינור. כאשר הוא הושעה מחדש עם חיץ Tris-HCl, המשקע החלבוני נעלם במהירות והתמוסס בחיץ, והופיע כנו...

כאן, אנו מציגים שיטת טיהור זיקה של אנזים פיברינוליטי מ Sipunculus nudus שהיא פשוטה, זולה ויעילה.

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

המחקר שלנו עוסק בעיקר בטיהור אנזים פיברינוליטי. עבודה זו מנסה להקים שיטת טיהור פשוטה עבור אנזים פיברינוליטי. בעבודה זו, אנו מדווחים לראשונה על מערכת טיהור ארגינין או ליזין בעלת הזיקה הטובה ביותר של אנזים פיברינוליטי.בהשוואה לשיטות הטיהור הקונבנציונליות, זוהי גישה פשוטה, זולה ויעילה לטיהור אנזימים פיברינוליטיים מ- Sipunculus nudus. לפיתוח פרוטוקול זה יש משמעות רבה יותר לניצול נוסף של אנזימים פיברינוליטיים מ- Sipunculus nudus וחומרים דומים אחרים.

affinity-purification-of-a-fibrinolytic-enzyme-from-sipunculus-nudus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אמא הוא חלבון ייחודי הקשור Magnetosome אשר הוצגה להיות מעורב ההפעלה magnetosome. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול טיהור של אמא המחיקה מוטציה (MamAΔ41)...

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

אב טיפוס רקומביננטי וירוס קצפית integrase חלבון נגוע לעיתים קרובות נוקלאז חיידקי במהלך טיהור. שיטה זו מזהה נוקלאז זיהום ומסירה אותו הכנת הסופי של האנזים.

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחלץ את החלבון 1 המכיל הידרולאז 1 (FAHD1) מכליות החזירים ומכבד העכברים. השיטות המפורטות עשויות להיות מותאמות לחלבונים אחרים בעלי עניין ולשנות אותן עבור רקמות אחרות.

מיצוי וטיהור של חלבון FAHD1 מכבד כליות ועכבר חזירים

מאמר זה מספק הליך לטיהור זיקה של חלבון רקומביננטי אנושי, דש אנדונוקלאז 1 (FEN1), אשר תויג בתג 6X-היסטידין. הפרוטוקול כולל שימוש בשני עמודי יונים מתכתיים משותקים נפרדים לטיהור החלבון המתויג.

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר 

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורזה של ג'ל פיברינוגן-פוליאקרילאמיד (PAGE) כדי להפריד במהירות ולהציג את הסוכנים הפיברינוגנוליטיים של Sipunculus nudus.

הפרדה מהירה והצגה של חומרים פיברינוגנוליטיים פעילים ב- Sipunculus nudus באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פיברינוגן-פוליאקרילאמיד

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לביטוי יתר של Nsp15 רקומביננטי, נוקלאז רעיל, במערכת ביטוי C41(DE3), ואחריה טיהור החלבון המתויג באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה והדרת גודל. ניתן להתאים את הפרוטוקולים האלה לחלבונים רעילים מאתגרים אחרים.

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

מוצג פרוטוקול לייצור, טיהור ושימוש בשלפוחיות ממברנה חיצוניות ארוזות אנזימים (OMV) המספק יציבות אנזימים משופרת ליישום ביישומים מגוונים.

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

אנו מתארים כאן שיטה חדשנית, חזקה ויעילה לטיהור זיקה טנדם (TAP) לביטוי, בידוד ואפיון של קומפלקסים של חלבונים מתאים אוקריוטיים. פרוטוקול זה יכול לשמש לאפיון ביוכימי של קומפלקסים בדידים כמו גם לזיהוי אינטראקטורים חדשים ושינויים לאחר תרגום המווסתים את תפקודם.

טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

למד שיטת זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus באמצעות ארגינין או ליזין. גישה זו פשוטה, זולה ויעילה יותר משיטות מסורתיות לבידוד אנזימים פיברינוליטיים.

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

גלה סרטונים נוספים