Name: בידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם בשבר כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למדו בידוד ותרבית של פרדיפוציטים מרקמת שומן פריאורטית בעכבר. הפרוטוקול מאפשר חקר אדיפוגנזה ותקשורת בין תאי שומן לתאי כלי דם במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82130012 ו -81830010) ופרויקטי טיפוח למחקר בסיסי של בית החולים לחזה בשנחאי (מספר מענק: 2022YNJCQ03).

הפרוטוקולים של בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית החולים החזה בשנחאי המסונף לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנגחאי (מספר אישור: KS23010) ועמדו בתקנות האתיות הרלוונטיות. יש להעדיף עכברי C57BL/6 זכרים ונקבות בגילאי 4-8 שבועות לניסוי זה.
1. הכנת כלים כירורגיים, חוצצים ומדיה תרבותית
<ol><li>כלים כירורגיים אוטוקלאביים (למשל, מספריים כירורגיים ומלקחיים סטנדרטיים) בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות. חיטוי מכשירים מיקרוכירורגיים עם 75% אלכוהול.</li>
	<li>הכינו מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) בתוספת 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין ועוד 10 מ"ל של PBS בתוספת 10% v/v פניצילין-סטרפטומיצין. הערה: בסעיפים הבאים, אם לא הוזכר במפורש, PBS מתייחס PBS סטרילי רגיל.</li>
	<li>הכינו את מאגר קרבס רינגר HEPES BSA: אלבומין 1% בסרום בקר (BSA), 20 mM HEPES מומס בתמיסת קרבס רינגר.</li>
	<li>הכינו תמיסת עיכול טרייה: collagenase מסוג 1 (1 מ"ג/מ"ל) ו-dispase II (4 מ"ג/מ"ל) מומסים במאגר Krebs Ringer HEPES BSA. יש לעקר את התמיסה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.</li>
	<li>הכינו צלחת מצופה קולגן עם 12 בארות.<ol><li>יש לדלל את תמיסת הקולגן (1 מ"ג/מ"ל) במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה עד לריכוז של 40 מק"ג/מ"ל. הוסף 1 מ"ל של תמיסת הקולגן המדולל על פני כל באר כדי להשיג ריכוז של 6-10 מיקרוגרם / ס"מ2. דוגרים על הציפוי במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר את התמיסה הנותרת ושטוף כל באר 2x עם 1 מ"ל של PBS. השתמש בצלחת מיד, או יבש את הצלחת באוויר במכסה מנוע זרימה למינרית Class II ואחסן את הצלחת המצופה ב 2-8 ° C. בעת אחסון, לאטום את לוחות מצופים עם parafilm.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו מדיום תרבית: גלוקוז גבוה Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM), 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.</li>
	<li>הכן אמצעי השראה ליפוגני: DMEM גלוקוז גבוה, 10% FBS, 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין, 1 ננומטר triiodothyronine, 1 μM rosiglitazone, 1 μM אינסולין, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), ו 1 μM dexamethasone. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.</li>
	<li>הכן אמצעי תחזוקה: DMEM גלוקוז גבוה, 10% FBS, 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין, 1 ננומטר triiodothyronine, 1 μM rosiglitazone, ו 1 מיקרומטר אינסולין. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.</li>
</ol>2. דיסקציה ובידוד של רקמת שומן פריווסקולרית (PVAT)
<ol><li>הרדימו את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם תחת הרדמה איזופלורנית 2% או עם מנת יתר של פחמן דו חמצני. יש לרסס עם 75% אלכוהול לחיטוי העור.</li>
	<li>הנח את העכבר במצב שכיבה (פונה כלפי מעלה).</li>
	<li>הרימו את העור, בצעו חתך קטן והפרידו בבוטות בין העור לשרירי הבטן בעזרת מספריים כירורגיים לאורך קו האמצע הגחוני מהאגן ועד הצוואר. חשוף את הלב והריאות על ידי חיתוך הסרעפת והצלעות לאורך שני צידי קו האמצע.</li>
	<li>הסר בזהירות את הכבד, הטחול, המעיים והכליות. הימנע חיתוך דופן המעי.</li>
	<li>הסר את הריאות ואת הוושט.</li>
	<li>הרימו בעדינות את הלב עם מלקחיים ביד אחת והפרידו את אבי העורקים מעמוד השדרה בעזרת מספריים כירורגיים ביד השנייה. לאחר מכן, הניחו את הלב ואבי העורקים בצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ עם PBS המכילה 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
	<li>הסר מלקחיים מיקרוכירורגיים ומספריים מיקרוכירורגיים מאלכוהול ושטוף ב -25 מ"ל של PBS כדי להסיר את עודף האלכוהול. תחת מיקרוסקופ סטריאו, הסר את בלוטת התימוס ורקמות אחרות מהלב ומאבי העורקים, ולאחר מכן הסר את הלב, והשאיר את אבי העורקים עם PVATs.</li>
	<li>מעבירים את אבי העורקים עם PVAT לצלחת פטרי נקייה בקוטר 60 מ"מ עם PBS המכילה 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין.</li>
	<li>השתמש במלקחיים מיקרוכירורגיים כדי להפשיט PVATs, כאשר זוג אחד של מלקחיים מתקן את אבי העורקים והשני מושך את רקמת השומן. הסר את רקמת כלי הדם ככל האפשר תוך מזעור הנזק לרקמת השומן ההיקפית.</li>
	<li>אספו את ה-PVAT המקיף את אבי העורקים החזי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל המכיל DMEM עתיר גלוקוז בתוספת 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין המונח על קרח.</li>
</ol>3. בידוד של מקטע כלי דם סטרומה (SVF)
<ol><li>יש לשטוף את הרקמות שנאספו ברצף עם PBS המכיל 10% v/v פניצילין-סטרפטומיצין ו-PBS המכיל 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין. הערה: משלב זה ואילך, כל הניסויים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית סוג II.</li>
	<li>מעבירים את הרקמות לצלחת פטרי סטרילית בקוטר 60 מ"מ, מוסיפים 200 מיקרוליטר של תמיסת עיכול וטוחנים אותן ל-1 מ"מ3 חתיכות באמצעות מספריים סטריליים.</li>
	<li>מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק, שקצהו מורחב על ידי חיתוך מספריים סטרילי, ומוסיפים 6 מ"ל של תמיסת עיכול כדי להתחיל את תגובת העיכול. הערה: תגובת עיכול אחת (3 מ"ל של תמיסת עיכול) מספיקה למחסני PVAT משישה עכברים.</li>
	<li>לדגור את הרקמות ב 37 ° C באינקובטור עם שייקר מסלולית (תדר 150 סל"ד לערבוב יעיל) במשך 30-45 דקות. קשרו את הצינורות בצורה שטוחה על מתלה כדי לגרום לצינורות לרעוד אופקית. נערו מעלה ומטה במרץ ביד במשך 10 שניות כל 5-10 דקות. הערה: ניתן להפסיק את העיכול כאשר נוזל עיכול הומוגני וצהבהב נראה ללא שברי רקמות.</li>
	<li>מסננים את הרקמות המעוכלות דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. שטפו את מסננת התאים בנפח שווה של מדיום תרבית כדי למקסם את תפוקת התאים ולעצור את העיכול.</li>
	<li>מעבירים את התסנין לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 15 מ"ל וצנטריפוגה בעוצמה של 1,800 × גרם למשך 10 דקות. הפוך את הצינור כדי להשליך את supernatant ו resuspend את הכדורים ב 5 מ"ל של PBS. צנטריפוגה בעוצמה של 1,800 × גרם למשך 5 דקות.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט על ידי היפוך הצינור והשעו מחדש את הכדוריות בנפח מתאים של מדיום תרבית. הערה: כדורי התא שנאספו מכל שישה עכברים מושעים מחדש ב-1 מ"ל של מדיום תרבית ונזרעים לבאר אחת של צלחת בת 12 בארות.</li>
	<li>זרעו את התאים לתוך צלחת מצופה קולגן של 12 בארות ודגרו בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה עם 5%CO2 למשך הלילה.</li>
	<li>למחרת, שאפו את מדיום התרבית, שטפו את התאים עם PBS שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) המכיל 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין כדי להסיר פסולת תאים ותאי דם אדומים, והוסיפו בחזרה 1 מ"ל של מדיום תרבית טרי כל באר.</li>
</ol>4. אינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מרקמת שומן פריאורטית
<ol><li>שנה את מדיום התרבית כל יומיים עד שהתאים מגיעים ~ 60-70% מפגש. הערה: בדרך כלל לוקח 3-4 ימים לתאים להגיע למפגש של 60-70%.</li>
	<li>כאשר התאים מגיעים למפגש של 60-70%, שואפים את מדיום התרבית ומחליפים אותו בתווך אינדוקציה אדיפוגני חום. שקול את יום האינדוקציה של התמיינות אדיפוגנית כיום 0 של התמיינות.</li>
	<li>לאחר 72 שעות (יום 3 של בידול), רענן את המדיום עם אמצעי תחזוקה. שנה את אמצעי התחזוקה כל יומיים עד שהתאים ישמשו לניסויים.</li>
	<li>לנתח את התאים האדיפוגניים בצורה מתאימה, כגון שמן אדום O צביעה14 ו blotting המערבי15.</li>
</ol>

גידול פרא-אדיפוציטים שבודדו מרקמת שומן פרי-וסקולרית מורין

<ol><li>Akoumianakis, I., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+adipose+tissue+and+the+cardiovascular+system%3A+is+fat+always+bad%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad.</a> Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).</li>
<li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thoracic+perivascular+adipose+tissue+inhibits+VSMC+apoptosis+and+aortic+aneurysm+formation+in+mice+via+the+secretome+of+browning+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).</li>
<li>Xia, N., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+perivascular+adipose+tissue+in+obesity-induced+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).</li>
<li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease%3A+a+review+of+current+research+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li>
<li>Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+consensus+view+of+mammalian+adipocyte+stem+and+progenitor+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity.</a> Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).</li>
<li>Angueira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+lineage+of+thermogenic+perivascular+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue.</a> Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).</li>
<li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab27a+regulates+human+perivascular+adipose+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li>
<li>Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+sympathetic+nerves+and+inflammation+in+perivascular+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).</li>
<li>Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+isolate+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells.</a> Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).</li>
<li>Senesi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+enzymatic+procedures+to+isolate+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue%3A+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88(2019).</li>
<li>Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+vascular+fraction+technologies+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Stromal vascular fraction technologies and clinical applications.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).</li>
<li>Suh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+cellular+and+cell-derived+regenerative+therapies+in+dermatology+and+aesthetic+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation.</a> Ageing Research Reviews. 54, 100933(2019).</li>
<li>Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+adipose+tissue-derivatives+in+modern+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology.</a> Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).</li>
<li>Kraus, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+adipocyte+differentiation+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture.</a> Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).</li>
<li>Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+imaging+of+brown+adipocytes+from+the+stromal+vascular+fraction+of+interscapular+adipose+tissue+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methotrexate+improves+perivascular+adipose+tissue%2Fendothelial+dysfunction+via+activation+of+AMPK%2FeNOS+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).</li>
<li>Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue-derived+extracellular+vesicle+miR-221-3p+mediates+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling.</a> FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).</li>
<li>Ruan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue-derived+complement+3+is+required+for+adventitial+fibroblast+functions+and+adventitial+remodeling+in+deoxycorticosterone+acetate-salt+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).</li>
<li>Adachi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beiging+of+perivascular+adipose+tissue+regulates+its+inflammation+and+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling.</a> Nature Communications. 13 (1), 5117(2022).</li>
<li>Ye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+functional+characteristics+of+the+thoracic+aorta+perivascular+adipocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).</li>
<li>Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+obesity-induced+perivascular+adipose+tissue+%28PVAT%29+dysfunction+in+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis.</a> Nutrients. 13 (11), 3843(2021).</li>
<li>Queiroz, M., Sena, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+adipose+tissue+in+age-related+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease.</a> Ageing Research Reviews. 59, 101040(2020).</li>
<li>Fitzgibbons, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+of+mouse+perivascular+and+brown+adipose+tissues+and+their+resistance+to+diet-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+perivascular+adipose+tissue+on+peroxisome+proliferator-activated+receptor-%CE%B3+deletion+in+smooth+muscle+cells+impairs+intravascular+thermoregulation+and+enhances+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis.</a> Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).</li>
<li>Piacentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profiling+unveils+autoimmune+response+signatures+in+the+perivascular+adipose+tissue+of+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+reveals+perivascular+adipose+tissue+plasticity+in+response+to+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II.</a> Pharmacological Research. 178, 106183(2022).</li>
<li>Shi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending+aortic+perivascular+adipose+tissue+inflammation+associates+with+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease.</a> Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+differentiate+into+brown+adipocytes+and+contribute+to+periaortic+arch+adipose+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).</li>
<li>Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+perivascular+adipose+tissue+impacting+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).</li>
<li>Bar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+resonance+imaging-based+detection+of+heterogeneous+endothelial+response+in+thoracic+and+abdominal+aorta+to+short-term+high-fat+diet+ascribed+to+differences+in+perivascular+adipose+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929(2020).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים, כספיים או אחרים, להצהיר.

אנו מציעים גישה מעשית וישימה לבידוד ואינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מרקמת שומן פריאורטית של עכבר. היתרונות של פרוטוקול זה הם שהוא פשוט וחסכוני. מספר מספיק של עכברים הוא קריטי לבידוד מוצלח, שכן רקמה לא מספקת עלולה לגרום לצפיפות SVF נמוכה ולמצב גדילה ירוד, מה שבסופו של דבר משפיע על יעילות הליפוגנית. בנוסף, גיל העכבר הוא גורם חשוב שיש לקחת בחשבון, שכן הפוטנציאל האידיפוגני של SVF פוחת עם הגיל. הפרדה מהירה וזהירה של PVAT תוך מזעור זיהום כלי הדם היא חיונית. תמיסת העיכול היא גם מרכיב מרכזי, שכן תוספת של disp...

רקמת שומן פריווסקולרית (PVAT), מבנה פריווסקולרי המורכב מתערובת של אדיפוציטים בוגרים ומקטע כלי דם סטרומה (SVF), הוא האמין אינטראקציה עם דופן כלי הדם הסמוך באמצעות ההפרשה שלהparacrineally 1. כמווסת קריטי של הומאוסטזיס כלי דם, תפקוד לקוי של PVAT מעורב בפתוגנזה של מחלות לב וכלי דם 2,3,4. SVF של רקמת השומן מורכב ממספר אוכלוסיות תאים צפויות, כולל תאי אנדותל, תאי חיסון, תאי מזותליום, תאים עצביים ותאי גזע ותאי אב שומניים (ASPCs)5,6. ידוע היטב כי ASPCs השוכנים ב- SVF של רקמת השומן יכולים להצמיח אדיפוציטים בוגרים5. SVF מוסק להיות מקור קריטי של אדיפוציטים בוגרים PVAT. מספר מחקרים הראו כי PVAT-SVF יכול להתמיין לאדיפוציטים בוגרים בתנאי אינדוקציה ספציפיים 6,7,8.
כיום קיימות שתי מערכות בידוד לבידוד SVF מרקמת השומן, האחת היא עיכול אנזימטי והשנייה אינה אנזימטית9. שיטות אנזימטיות בדרך כלל מביאות לתשואה גבוהה יותר של תאי אב בעלי גרעין10. עד כה, היתרונות של SVF בקידום התחדשות כלי הדם וניאו-וסקולריזציה בריפוי פצעים, מחלות אורוגניטליות ומחלות לב וכלי דם הוכחו באופן נרחב11, במיוחד בדרמטולוגיה ובכירורגיה פלסטית12,13. עם זאת, סיכויי היישום הקליני של SVF הנגזר מ- PVAT לא נחקרו היטב, וניתן לייחס זאת להיעדר שיטה סטנדרטית לבידוד SVF מ- PVAT. מטרת פרוטוקול זה היא לבסס גישה סטנדרטית לבידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-SVF מ-PVAT עכברי סביב אבי העורקים החזי, מה שיאפשר חקירה נוספת של תפקוד PVAT. פרוטוקול זה מייעל את עיבוד רקמות וטכניקות התמיינות תאים לגידול אדיפוציטים פריאורטיים המתקבלים מעכברים צעירים.

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu; מסנני מזרק m</td><td>PALL</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות&nbsp;</td><td>Labselect</td><td>11210</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>Labserv</td><td>310109003</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2877</td><td>1 ננומטר</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור צנטריפוגה</td><td>Labselect</td><td>CT-002-50A</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אדיפונקטין</td><td>Abcam</td><td>ab22554</td><td>1:1,000 ריכוז עבודה</td></tr><tr><td>אנטי-COX IV</td><td>CST</td><td>4850</td><td>1:1,000 ריכוז עבודה</td></tr><tr><td>אנטי-FABP4</td><td>CST</td><td>2120</td><td>1:1,000 ריכוז עבודה</td></tr><tr><td>אנטי-PGC1&אלפא;</td><td>Abcam</td><td>ab191838</td><td>1:1,000 ריכוז עבודה</td></tr><tr><td>אנטי-PPAR&gamma;</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-14889</td><td>1:1,000 ריכוז עבודה</td></tr><tr><td>אנטי-UCP1</td><td>Abcam</td><td>ab10983</td><td>1:1,000 ריכוז עבודה</td></tr><tr><td>אנטי-אלפא;-אקטינין</td><td>CST</td><td>6487</td><td>1:1,000 ריכוז עבודה</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beyotime</td><td>ST023-200g</td><td>1%</td></tr><tr><td>C57BL/6 עכברים בגילאי 4-8 שבועות משני המינים</td><td>מרכז האורגניזמים מודל שנחאי, בע"מ.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים 70 ומיקרו; m, ניילון</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>קולגן מעור עגל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז, סוג 1</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS004196</td><td>1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D1756</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693-1G</td><td>4 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>10%</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-25G</td><td>20 מ"מ</td></tr><tr><td>גלוקוז גבוה DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>IBMX&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I7018</td><td>0.5 מ"מ</td></tr><tr><td>חממה עם שייקר מסלולי</td><td>שנחאי longyue מכשיר Eruipment ושות', בע"מ</td><td>LYZ-103B</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין (בקר)&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>11070-73-8</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת קרבס-רינגר</td><td>מחירlla&nbsp;</td><td>PB180347</td><td>להגן מפני אור&nbsp;</td></tr><tr><td>מלקחיים מיקרו-כירורגיים</td><td>Beyotime</td><td>FS233</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרוכירורגיים</td><td>Beyotime</td><td>FS217</td><td></td></tr><tr><td>שמן אדום O&nbsp;</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td>A600395-0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS (מי מלח חוצץ פוספט)</td><td>סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ</td><td>B548117-0500</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פרוקסידאז AffiniPure עז אנטי-עכבר IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>115-035-146</td><td>1:5,000 ריכוז עבודה</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>111-035-144</td><td>1:5,000 ריכוז עבודה</td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td>1 &mu; </td></tr><tr><td>מלקחיים סטנדרטיים</td><td>M Beyotime</td><td>FS225</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>Beyotime</td><td>FS001</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם בשבר כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

רקמת שומן פריווסקולרית (PVAT) היא מחסן רקמת שומן המקיף כלי דם ומציג את הפנוטיפים של אדיפוציטים לבנים, בז' וחומים. תגליות אחרונות שפכו אור על התפקיד המרכזי של PVAT בוויסות הומאוסטזיס כלי הדם והשתתפות בפתוגנזה של מחלות לב וכלי דם. הבנה מקיפה של תכונות PVAT ורגולציה היא בעלת חשיבות רבה לפיתוח טיפולים עתידיים. תרביות ראשוניות של אדיפוציטים פריאורטיים הן בעלות ערך לחקר תפקוד PVAT וההצלבה בין אדיפוציטים פריאורטיים ותאי כלי דם. מאמר זה מציג פרוטוקול חסכוני וישים לבידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם במקטע כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר, אשר יכול להיות שימושי למידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה במבחנה. הפרוטוקול מתאר עיבוד רקמות והתמיינות תאים לגידול אדיפוציטים פריאורטיים מעכברים צעירים. פרוטוקול זה יספק את אבן הפינה הטכנולוגית בצד הספסל לחקירת תפקוד PVAT.

באמצעות פרוטוקול זה שתואר לעיל, בודדנו בקפידה PVAT סביב אבי העורקים החזי של עכבר (איור 1A-D). לאחר שטיפה וטחינה של PVAT לחתיכות קטנות באמצעות מספריים סטריליים (איור 1E,F), שברי רקמות עוכלו בתמיסת עיכול שהכילה collagenase מסוג 1 (1 מ"ג/מ"ל) ו-dispase II (4 מ"ג/מ"ל) והודגרו ב-37°C על שייקר במשך 30-45 דקות (איור 1G). הרקמות המעוכלות נמתחו דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפ...

במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, התרבית והאינדוקציה האידיפוגנית של קדם-אדיפוציטים שמקורם בשברי כלי דם סטרומה מרקמת השומן הפריאו-אורטית של עכבר, מה שמאפשר לחקור את תפקוד רקמת השומן הפריווסקולרית ואת הקשר שלה עם תאי כלי הדם.

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown ...

אנו שואפים לבסס גישה סטנדרטית לתרבית בידוד ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם בשבר כלי דם סטרומה ממסה PVAT. פרוטוקול זה מאפשר לנו לבצע חקירות נוספות על תפקוד PVAT ועל התקשורת בין אדיפוציטים פריאורטיים ותאי כלי דם במבחנה. האתגרים העיקריים העומדים בפנינו כיום בניסויים שלנו כוללים את הגבלת הזמינות של PVAT ואת הדרישות למשאבים אנושיים וחומריים נוספים בהשוואה לשימוש בפראדיפוציטים אלמותיים.הפרוטוקול שלנו מאפשר לחקור את תפקוד רקמת השומן הפריווסקולרית ואת הקשר שלה עם תאי כלי הדם. אנו מציעים גם בסיס לחקר טבעות וגנים של PVAT והטרוגניות, ומספקים פלטפורמה לחקר הרגולטור החשוב של התמיינות PVAT והאדיפוגנזה במבחנה.

isolation-culture-adipogenic-induction-stromal-vascular-fraction

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) המסומנים באופן פלואורסצנטי מרקמת השומן של קשת פריאורטית. לאחר הבידוד, NCADSCs מזוהים, ממוינים באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ולאחר מכן תרבית על צלחת, קידום התפשטות תאים.

בידוד תאי גזע שמקורם בשומן מרקמת שומן פריאורטית מורין

ב2001, חוקרים באוניברסיטת UCLA תאר את בידודה של אוכלוסייה של תאי גזע בוגרים, המכונה תאי גזע שמקורם בשומן או ASCs, מרקמת שומן. מאמר זה מתאר את הבידוד של ASCs מlipoaspirates באמצעות פרוטוקול עיכול ידני, האנזימטית באמצעות collagenase.

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי גזע שמקורם בשומן חזיר (pADSC) מרקמות שומן תת עוריות עם בחינת מולטיפוטנטיות. ה-pADSC הרב-פוטנטי משמש לתיחום תהליכים של התמיינות אדיפוציטים ולחקר טרנסדיפרנציאציה לשושלות תאים מרובות של מזנכימה מזודרמית או שושלות נוספות של אקטודרם ואנדודרם למחקרים רגנרטיביים.

בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

כאן אנו מדווחים על שיטה לבידוד של אוכלוסיות תאי אב (APC) של אדיפוציטים (APC) מתוך רקמת אדיפוס (Perivascular Adipose Tissue) (PVAT) תוך שימוש במיון תאים מגנטיים המופעל (MCS). שיטה זו מאפשרת בידוד מוגבר של APC לכל גרם של רקמת השומן בהשוואה לפלואורסצנטי המופעל תא מיון (FACS).

הרחבת אדיפוגנזה השראה של אבות אדיפוציטים מ רקמות אדיבוס perivascular מבודדים על ידי מיון מגנטי המופעל תא

אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד, התרבות, והאינדוקציה האדיגנית של הרכס העצבי (NCADSCs) מתוך רקמת השומן של ה-Wnt-1 יצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים. NCADSCs יכול להיות מקור נגיש בקלות של ADSCs עבור מידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה ב מבחנה.

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

פרוטוקול זה מתאר את הגישה הטכנית לבידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני רקמת שומן לבן תוך בטני (WAT) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או הפרדת חרוזים אימונומגנטית.

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד החצי-אוטומטי של מקטע כלי הדם סטרומה (SVF) מרקמת השומן של מורין כדי להשיג קדם-אדיפוציטים ולהשיג התמיינות אדיפוציט במבחנה. שימוש בדיסוציאטור רקמות לעיכול קולגנאז מפחית את השונות הניסיונית ומגביר את יכולת הרבייה.

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

הגודל והשבריריות של אדיפוציטים בוגרים הגבילו את הטכניקות והכלים הזמינים למחקר ולבידוד שלהם. כאן, מתואר פרוטוקול לבידוד של אדיפוציטים עכברים בוגרים, שניתן להתאים בקלות למחסני שומן שונים ולדיאטות עכברים.

בידוד ותרבות של אדיפוציטים עכבריים ראשוניים מעכברים רזים והשמנים

כאן אנו מציגים שיטה סטנדרטית לבידוד יעיל של תאי גזע ומגדלי שומן שמקורם בשומן, המאופיינת בהפחתה של &gt;90% בזמן העיבוד, חיוניות תאית גבוהה ותאימות רחבה.

בידוד יעיל של תאי גזע ושומנים שמקורם בשומן מרקמת שומן חזיר

preadipocytes הלבן העיקרי שבודד מרקמות שומן לבנות בעכברים יכול להיות מובחן לתאים בז'ים / brite. מוצג כאן הוא מודל למערכת סלולרית אמינה ללמוד רגולציה המולקולרית של "השחמה" של שומן לבן.

בידוד והתמיינות של תאי כלי דם לתאי סטרומה בז&#39;ים / Brite

למדו בידוד ותרבית של פרדיפוציטים מרקמת שומן פריאורטית בעכבר. הפרוטוקול מאפשר חקר אדיפוגנזה ותקשורת בין תאי שומן לתאי כלי דם במעבדה.

בידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם בשבר כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר

גלה סרטונים נוספים