הכנה איכותית של גרעיני מוח ומח עצם לבדיקות מולטיום של גרעינים בודדים
22 בדצמבר 2023
ההצלחה של תעתיק חד-תאי/חד-גרעיני ומולטי-אומיקה תלויה במידה רבה באיכות התאים/גרעינים. לכן, בידוד תאים/גרעינים מרקמה וטיהורם חייבים להיות סטנדרטיים ביותר. פרוטוקול זה מתאר את הכנת הגרעינים מהמוח וממח העצם לבדיקת מולטיום-גרעינים חד-גרעיניים במורד הזרם.
היחידה לטכנולוגיות ציטומטריה וסמנים ביולוגיים תומכת בפרויקטים ביו-רפואיים באמצעות טכנולוגיות וצינורות מתקדמים לפנוטיפ תאים ופרופיל מולקולרי ברזולוציה של תא יחיד. בהקשר זה, אנו משתמשים בכלים שונים לניתוח מולטיומי של תא בודד כדי לקבל תובנות על ביטוי גנים ובקרת גנים בבריאות ובחולי. ציטומטריית זרימה מזהה ומקור תאים בודדים בהתבסס על מאפיין ייחודי.
ההתקדמות האחרונה כוללת ממיינים ספקטרליים מבוססי תמונה בעלי תפוקה גבוהה, וטכנולוגיות אלה מציעות גמישות בעיצוב פאנלים, מאפשרות שימוש סימולטני בצבעים דומים וניהול אוטופלואורסצנטיות. אתגר ניסיוני מרכזי בשימוש בטכנולוגיות חד-תאיות חדשניות הוא עבודה עם אוכלוסיות תאים שבריריות או נדירות במיוחד. כל רקמה או סוג תא צריכים לעבור אופטימיזציה של פרוטוקולים מכווננים היטב כדי להשיג מספיק תאים בני קיימא המתורגמים לנתוני רצף באיכות גבוהה.
פרוטוקול הכנת הגרעינים הבודדים המותאם שלנו משפר את התאוששות הגרעינים וממזער את הלחץ על הגרעינים. הוא מותאם במיוחד לרקמות המוח ומח העצם ומכסה את כל השלבים מדיסוציאציה של דגימות לטיהור גרעינים.
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד באופטימיזציה של בידוד גרעינים מרקמות מוח ומחול לשם ביצוע בדיקות multiome של גרעינים בודדים. חשיבותה של הפקת גרעינים באיכות גבוהה מודגשת בשל השפעתה על אנליזות של טרנסקריפטומיקה של תא בודד ומולטי-אומיקה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המחקר
- טרנסקריפטומיקה של תא בודד
- מולטי-אומיקה
- טכניקות לבדילת גרעינים
רקע
- ההצלחה של טרנסקריפטומיקה תלויה בטוהר ובאיכות של תאים או גרעינים מבודדים.
- התקדמויות אחרונות בציטומטריית זרימה ובטכנולוגיות מבוססות תמונה משפרות את יכולות מיון התאים.
- נדרשת התייחסות מיוחדת עבור אוכלוסיות תאים שבירות או נדירות, מה שמחייב פרוטוקולים מותאמים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פרוטוקול מעודכן להכנת גרעינים מרקמות מוח ומחול לשד
- מערכת מודל עכברים
- הטכניקות כוללות ציטומטריה של זרימה וספירה אוטומטית של תאים
תוצאות עיקריות
- שיעורי התאוששות משופרים של גרעינים עם מזעור העקה במהלך ההכנה.
- טוהר הגרעינים המוחיים עלה מ-36% לכמעט 100% לאחר המיון.
- ביסוס זרימת עבודה אמינה להכנת גרעינים עבור נתוני רצף באיכות גבוהה.
מסקנות
- מחקר זה מדגים פרוטוקול יעיל לבידוד גרעיני תאים בטוהר גבוה מרקמות ספציפיות.
- לממצאים יש השלכות משמעותיות על שיפור ניתוחים מולטי-אומיים של תא בודד במחקרי בריאות ומחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הכנה איכותית של גרעינים ממוח וממח העצם היא הבסיס לבדיקות מולטי-אום (multiome) חסונות של גרעינים בודדים, המשפיעה ישירות על מהימנות הפרופיילינג הטרנסקריפטומי והאפיגנטי בשלבי הגילוי המוקדמים. פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד גרעינים מאפשרים יצירת נתונים עקביים, התומכת בביטחון חיזוי ובהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקרי רקמות מורכבות. יכולת זו היא קריטית לקידום מודלים רלוונטיים למחלה ולהאצת קבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח במחקרי נוירוביולוגיה והמטולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מצבים תעתוקיים ואפיגנטיים ספציפיים לסוג תא ברקמות מורכבות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי אספקת גרעינים באיכות גבוהה עבור קריאות מולטי-אומיות (multiomic).
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות הכנת דגימות שניתן לשחזר ואיכות נתונים גבוהה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק תרחיפי גרעינים מאושרים שעברו אופטימיזציה עבור זרימות עבודה של 10X Genomics multiome במדרגות הבאות.
- משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי מזעור השונות בין הדגימות.
- מאפשר הכנה ניתנת להרחבה של ספריות גרעינים עבור סריקה של תרכובות או הפרעות בספיק גבוה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים של רקמות הרלוונטיים למחלה לצורך גילוי ביומרקרים תרגומיים.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על איכות הגרעינים לאורך הניסויים.
- מפחית את הסיכון לארטפקטים טכניים שעלולים להטעות את פרשנות הנתונים הפרה-קליניים.
שילוב תהליכים וזרימות עבודה
פרוטוקול זה להכנת גרעינים משלב בין עיבוד רקמות לבין ריצוף מולטי-אום של גרעינים בודדים (single-nuclei multiome sequencing), ותומך בתהליכי עבודה החל משלב הגילוי המוקדם ועד למחקר פרה-קליני.
- ביולוגיית גילוי: מספקת גרעינים באיכות גבוהה לבדיקת היפותזות וניתוח מסלולים ברקמות מוח ומח עצם.
- סריקה: מבטיחה מוכנות של הבדיקה ויכולת שחזור עבור פלטפורמות של פרופיל מולטי-אומי.
- אנליטיקה: מספקת מדדי איכות כמותיים של הגרעינים כדי להנחות את ניתוח הנתונים הבא ואת השוואת התנאים.
- מחקר טרנסלציונלי: תומכת בהתאמת ביומרקרים ובנאמנות של מודלי מחלה על ידי שימור שלם של הגרעינים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פרוטוקול סטנדרטי וניתן לשימוש חוזר, הניתן להתאמה לסוגי רקמות ומחקרים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים מולטי-אומיים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקלביליות של תהליכי בידוד גרעינים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי הבטחת קלטים מהימנים של נתונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מקוים לסיכון וקידום של תוכניות בנושאי נוירוביולוגיה והמטולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפירוק רקמות, בידוד גרעינים והערכת בקרת איכות.
- דורש גישה לציטומטריה זרימה, ספירת תאים אוטומטית ותשתיות ריצוף.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח שחזוריות בין מחקרים ואתרים שונים.
- עשוי לדרוש התאמת פרוטוקול לסוגי רקמות או מינים שונים.
- תלוי בשמירה על חיוניות ושלמות הגרעינים לאורך שלבי העיבוד.
