Name: ניתוח אימונוהיסטוכימי מולטיפלקס של נוף תאי החיסון המרחביים של מיקרו-סביבה סרטנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: למד ניתוח אימונוהיסטוכימי מולטיפלקס לחקירת נוף תאי החיסון במיקרו-סביבה סרטנית. השיטה מאפשרת זיהוי כמות, סוג ומיקום תאים חיסוניים בדגימות גידול לשיפור אסטרטגיות טיפוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PhenoImager HT נרכש באמצעות מימון שסופק על ידי המרכז הרפואי האוניברסיטאי Radboud והמרכז הטכנולוגי Radboud למיקרוסקופיה. CF נתמך כספית על ידי מענק האגודה ההולנדית לסרטן (10673) ומענק ERC Adv ARTimmune (834618). JT נתמכת כספית על ידי מענק NWO Vidi (VI.Vidi.192.084). המחברים רוצים להודות לאריק ואן דינתר ואנקור אנקן על עזרתם ביצירת זרימות עבודה לאחסון נתוני IHC מרובים ובנגט פונג מודה על ההוראות כיצד ליישם נתוני IHC מרובים ב- QuPath לציור ROI.

מיפוי הנוף החיסוני של הגידול: פרוטוקול ניתוח IHC מולטיפלקס מעמיק

<ol><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+immunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li>
<li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+into+the+tumor%3A+a+roadmap+for+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+of+human+tumors%3A+general+significance+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunoscore%3A+colon+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li>
<li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore%3A+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+classification+using+the+Immunoscore%3A+a+worldwide+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World-wide+Immunoscore+Task+Force%3A+meeting+report+from+the+34%3BMelanoma+Bridge%26%2334%2C+Napoli%2C+November+30th-December+3rd%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).</li>
<li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER+IMMUNOLOGY.+The+%26%2334%3Bcancer+immunogram%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CANCER IMMUNOLOGY. The &#34;cancer immunogram&#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li>
<li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis%3B+a+unique+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762(2020).</li>
<li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).</li>
<li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li>
<li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy%3A+Effects+on+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li>
<li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938(2022).</li>
<li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).</li>
<li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).</li>
<li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology.+Heart+%26+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma%3A+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li>
<li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).</li>
<li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , https://www.leicabiosystems.com/en-nl/ihc-ish/ihc-ish-instruments/bond-rx/ (2022).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

ניתוח מרחבי של TME הוא טכניקה מבוקשת כדי ללמוד יותר על תא תאי החיסון ולגלות סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ומנבאים חדשים, במיוחד בתחום האימונו-אונקולוגיה16. טכניקות רבות ושונות מפותחות למטרה זו, הכוללות זיהוי חלבונים, תעתיקי mRNA, או שילוב של השניים, עם הערכות של עד 100-1,000 מטרות. עם זאת, ריבוב גבוה יותר מגיע במחיר של ניסויים בעלי תפוקה נמוכה יותר, עלויות ניסוי גבוהות יותר ואתגרים טכניים, ולעתים קרובות ניתן לנתח רק חלק קטן מה-TME. Multiplex IHC בשיטה מבוססת TSA שאנו מתארים כאן, מזהה שישה סמנים שונים + DAPI בו זמנית, הוא יחסית זול יותר לביצוע, ומקטעי רקמות שלמים מצולמים תוך פחות מ -20 דקות, מוכנים לניתוח מלא. טכניקה זו הפכה פחות מורכבת עם אוטומציה של הליך הצביעה. שיפורים במיקרוסקופ המולטיספקטרלי, הכוללים תוספת של שני מסננים נוספים, שיפרו מאוד את זמני הערבוב והסריקה הספקטרליים. ניתן לזהות עד שמונה סמנים שונים + DAPI בו זמנית. עם זאת, על ידי הרחבת המרבב עם יותר סמנים, היתרונות הנ"ל נעלמים ככל שהערבוב הספקטרלי הופך למאתגר יותר וזמני הסריקה של שקופיות שלמות גדלים באופן משמעותי. נעשים מאמצים לתקנן IHC מולטיפלקס בין מוסדות שונים כדי להקל על היישום בהגדרת האבחון ביתר קלות. עבור סטנדרטיזציה זו של IHC מולטיפלקס, אנו ממליצים למשתמשים לדבוק בפרוטוקול נגיש יותר עם שישה סמנים שונים + DAPI. עם זאת, עדיין יש צורך בידע טכני לא מבוטל וניתוח במורד הזרם יכול להיות מאתגר, עבורו פיתחנו מתודולוגיות המתוארות בפרוטוקול זה.
התקינה מתחילה בפיתוח פאנל IHC מרובה אולמות. חשיבות הבחירה של נוגדנים ראשוניים המזהים מטרות חלבון מסוימות הודגשה לפניגיל 17. לוחות IHC המולטיפלקס שלנו מפותחים בעיקר עם שיבוטים ראשוניים של נוגדנים המשמשים ומאומתים גם עבור IHC במחלקת האבחון שלנו. עם זאת, במקרה של פאנל IHC מרובה תאים דנדריטיים, רוב הנוגדנים לא שימשו במסגרת האבחון (Van der Hoorn et al., כתב יד בהגשה). כדי להבטיח ספציפיות ולמזער את הבדלי האצווה, בחרנו להשתמש בנוגדנים חד-שבטיים על פני נוגדנים רב-שבטיים וגם תיקפנו את רוב הנוגדנים באמצעות קווי תאים נגועים ותאים ראשוניים. במהלך השנים נעשה שימוש בגרסאות שונות של לוחות IHC מרובי אולמות במחקרים רבים באמצעות מערכת Vectra 3 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. כדי ליישם לוחות IHC מרובים אלה בצורה אופטימלית על מערכת PhenoImager HT, היה צורך לבצע התאמות מסוימות בשילובי נוגדנים ראשוניים ופלואורופורים. כדי ליהנות מפירוק ספקטרלי טוב יותר וזמני סריקה מהירים יותר של חלקי רקמות שלמות, יש צורך ביישום הפלואורופורים העדכניים ביותר של Opal480 ו-Opal780 והימנעות משימוש בפלואורופורים של Opal540 ו-Opal650 בלוחות IHC מרובי צבעים בעלי שבעה צבעים. זמני הסריקה מהירים פי 3-10 בהתאם לגודל קטע הרקמה. התאמות פאנל IHC מרובות היו די קלות להשגה, אך יש לזכור כמה שיקולים. הספקטרום הפלואורסצנטי של Opal480 חופף הרבה עם ספקטרום אוטופלואורסצנטי ולכן, מפריע לערבוב ספקטרלי של אריתרוציטים ומבנים אוטופלואורסצנטיים אחרים. שימוש בריכוז מוגבר של הנוגדן הראשוני בשילוב עם Opal480 פתר בעיה זו ברוב המקרים. היישום של מסנן המיקוד האוטומטי לדוגמה הקנייני על PhenoImager HT מקל על ביטול הערבוב של Opal480 ו autofluorescence. עם זאת, עדיף להשתמש בנוגדן ראשוני המניב אות ברור בעת שימוש עם Opal480, כך שהאות שלו גבוה יותר מאשר autofluorescence.
למרות שלוחות IHC מרובים אלה מבוססים, וריאציה מאצווה לאצווה היא משהו שצריך לקחת בחשבון. על ידי ביצוע בקרות מונופלקס IHC לפני תחילת ניסוי IHC המרובב המלא, ראינו לפעמים כי נוגדנים ראשוניים מתפקדים חזקים או חלשים יותר מניסוי לניסוי. הסיבות לכך יכולות להיות טעויות צנרת, תנאי אחסון ריאגנטים לא אופטימליים וחיי מדף. פתרנו זאת על ידי התאמת תמיסת הנוגדנים הראשונית על סמך הניסיון שלנו. גם כאשר לא היה צורך לבצע אף אחת מההתאמות הנ"ל, בכל ניסוי אצווה של IHC מולטיפלקס, חשוב לקבוע זמני חשיפה בהתבסס על שקופיות בקרה מוכתמות במונופלקס IHC.
מכיוון שהמחקר שלנו התמקד בתחילה בסוגים שונים של קרצינומה ומלנומה, לוחות IHC מרובים נדרשו להיות ניתנים להחלפה בין סוגי גידולים עם התאמות מינימליות. לכן, תמיד כללנו סוגים מרובים של רקמות (גידולים) בתהליך האופטימיזציה וראינו כי דילול נוגדנים ראשוניים לסמנים של תאי מערכת החיסון יכול להישמר דומה בין סוגי גידולים שונים. עם זאת, גילוי רקמת הגידול בין קרצינומה למלנומה דורש סמני גידול שונים. בהתאם לכך, סמן הגידול תמיד הותאם לעבודה בסוף כל פאנל IHC מולטיפלקס וכיום משמש תמיד בשילוב עם אופל780, שבמקרה גם צריך להיות בפלואורופור האחרון בהליך צביעת IHC מולטיפלקס. על ידי שימוש בסמן הגידול בסוף המולטיפלקס IHC, לוחות IHC מרובים אלה יכולים להיות מוחלפים בקלות עבור סוגי גידולים אחרים, כגון גליובלסטומה (כלומר, GFAP) ולימפומה הודג'קין (כלומר, CD30). עבור אנגיוסרקומה, השתמשנו בפאנל IHC מרובה לימפוציטים זה עם גן הקשור לטרנספורמציה אריתרובלסטית ספציפית (ERG) כסמן הגידול עם שני ניסויי אופטימיזציה בלבד25. האופטימיזציה כללה טיטרציה של הנוגדן הראשוני ERG ובדיקת פאנל IHC מולטיפלקס עם ERG בקצהו.
התאמות אחרות ללוחות IHC מרובים אלה יכולות להתבצע גם על ידי החלפת סמן תאי חיסון מסוים בסמן חיסוני או פונקציונלי אחר. כל שינוי דורש אופטימיזציה. ניתן לעקוב אחר פרוטוקול האופטימיזציה כמתואר קודם17. שינויים מסוימים בלוחות IHC המרובבים המוצעים יפריעו לאלגוריתמים של ImmuNet שיצרנו. יש להפיק מספיק נתונים ולהקדיש זמן להטמעת שינויים אלה באלגוריתם (לפחות 750 ביאורים לכל סמן חדש ו/או פנוטיפים של תאים, ו-150 ביאורים לאימות סמנים שאומנו בעבר). הפאנלים המוצגים כאן אינם מכילים סמנים פונקציונליים, אם כי הטמעת סמני בקרה חיסונית כגון PD-1 ו- PD-L1 בלוחות IHC מרובים מתבצעת במעבדה שלנו. עם זאת, ניתוח סמנים שהם פחות בינאריים באותות שליליים וחיוביים הוכח כקשה יותר והוא תחום מחקר פעיל בקבוצה שלנו.
מספר הסמנים שניתן להעריך בו זמנית עם IHC מולטיפלקס מוגבל בהשוואה לטכניקות חדשניות אחרות. בעוד שניתן לעקוף זאת על ידי ניתוח לוחות שונים על פרוסות עוקבות של גוש FFPE, יהיה קשה להשוות פרוסות אלה באופן מרחבי. סביר להניח שהכיוון והממצאים המקופלים אינם זהים לאחר הכנת השקופית. עם זאת, מולטיפלקס IHC נגיש למדי, מה שהופך אותו לכלי אטרקטיבי עבור מוסדות וחוקרים נוספים ולכן מתאים יותר ליישום עתידי במסגרת אבחון. עם הסטנדרטיזציה של לוחות תאי חיסון IHC מרובים עבור סוגי גידולים מרובים וצינורות ניתוח במורד הזרם, ניתן היה לצבור ידע נוסף על הבדלים ב- TME בין חולים וסוגי גידולים. זה יכול, למשל, להוביל לתובנות נוספות לגבי התפקיד של TME בתגובה אנטי-סרטנית לטיפולים ספציפיים. זה עשוי אפילו להצמיח סמנים ביולוגיים חדשים כדי לחזות גורמים כגון תגובה לטיפול והישרדות צפויה. בסך הכל, זה יכול לאפשר למולטיפלקס IHC להפוך לכלי קליני המסייע בקבלת החלטות קליניות, בגישת רפואה מותאמת אישית. אמנם, שלבים נוספים של הליך הניתוח צריכים כנראה להיות אוטומטיים וסטנדרטיים כדי שיהיה אפשרי לשימוש בסביבה אבחנתית יומית, כך שנכון לעכשיו, זו בעיקר פרספקטיבה עתידנית.
ניתוח של סמנים מרובים בשקופית מדגם אחת יכול להיות כלי רב עוצמה למרות האתגרים הטכניים שלו. עם פרוטוקולים ניסיוניים סטנדרטיים ושיטת ניתוח חזקה, כפי שתיארנו כאן באמצעות ImmuNet, הכימות של סמנים מרובים הופך אותו לאינפורמטיבי יותר מאשר IHC קלאסי, בעוד IHC מולטיפלקס נשאר בתפוקה גבוהה יחסית בהשוואה לשיטות ניסוי חדשניות עם plex גבוה יותר.

תאי מערכת החיסון ממלאים תפקיד מכריע בהגנה מפני פתוגנים כגון וירוסים וחיידקים, אך גם מפני תאים סרטניים1. לכן, מערכת החיסון בתוך המיקרו-סביבה של הגידול (TME) טומנת בחובה הבטחה רבה לגילוי סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ומנבאים2. חדירות תאי מערכת החיסון נמצאו בקורלציה לפרוגנוזה בסוגים שונים של סרטן, אם כי זה עדיין לא יושם בטיפול קליני 3,4. ברוב סוגי הגידולים, מספר גבוה של תאי T ציטוטוקסיים ותאי T עוזר 1 ו/או מספר נמוך של תאי T רגולטוריים קשורים לפרוגנוזות טובות. נמשכים המאמצים לשלב את מה שמכונה "Immunoscore" בבימוי TNM של סרטן המעי הגס, ולהפוך אותו ל-TNM-I בימוי 5,6. ה- Immunoscore נגזר מהמספר הכולל של תאי T (שזוהו עם CD3) ותאי T ציטוטוקסיים (שזוהו עם CD8) בשני אזורי גידול שונים: ליבת הגידול לעומת השוליים הפולשניים (IM) של גידולים. הדירוג החיסוני הוצע גם להיות בעל ערך פרוגנוסטי בסוגי סרטן אחרים, כגון מלנומה, סרטן ריאות וסרטן השד 6,7,8,9. יתר על כן, חדירות תאי מערכת החיסון עשויות גם להיות בקורלציה לתגובה לאימונותרפיה של חסימת נקודות ביקורת10. עם זאת, סמנים ביולוגיים מנבאים אלה חייבים להיות מאומתים במחקרים פרוספקטיביים לפני שניתן יהיה ליישם אותם באופן שגרתי בפרקטיקה קלינית. יתר על כן, הוצע גם כי סמן ביולוגי יחיד לא יספיק לחיזוי משמעותי11. לכן, יצירת מפה מלאה של דגימת חולה על ידי שילוב סמנים ביולוגיים שונים הוצעה כסמן ביולוגי מנבא מקיף יותר במה שמכונה "אימונוגרמה של סרטן"12.
בין השיטות לחקר תאי מערכת החיסון בתוך TME, הטכניקה הוותיקה והידועה ביותר היא אימונוהיסטוכימיה (IHC), המשמשת באופן שגרתי לבדיקות אבחון במספר מחלות, במיוחד סרטן13. טכניקה זו הוגבלה לשימוש בסמן אחד או רק כמה סמנים14 במשך זמן רב, ולכן התחרתה במסגרות מחקר על ידי טכניקות אחרות כגון ציטומטריית זרימה ופרופיל ביטוי גנים (GEP). עם זאת, רקמות הגידול הקבועות בפורמלין ומשובצות פרפין (FFPE) המשמשות בדרך כלל באבחון ומחקר שגרתיים אינן מתאימות (באופן אופטימלי) לציטומטריית זרימה ו- GEP. יתר על כן, למרות GEP וציטומטריית זרימה לספק הרבה תובנה על פנוטיפ התא ותפקוד, חוסר מידע מרחבי הוא חסרון גדול. לכן, הטרוגניות בתוך דגימה, כגון הבדלים באזורים שחדרו לתאי מערכת החיסון לעומת אזורים שאינם נכללים בתאי מערכת החיסון של גידול, עלולה להיעלם15. פלטפורמות חדשניות פותחו לניתוח מולטיפלקס של רקמות FFPE, כגון מולטיפלקס IHC, ציטומטריית מסה של הדמיה וזיהוי CO-Detection על ידי indEXing (CODEX) שניתן להשתמש בהן כדי לזהות סמנים מרובים בו זמנית בתוך קטערקמות 16. תאי מערכת החיסון ב-TME נחקרים באופן נרחב כדי למצוא את הסמנים הביולוגיים הטובים ביותר לאימונותרפיה. עם זאת, טכניקות מולטיפלקס וניתוח תמונה אוטומטי מציבים מכשולים משלהם.
למעבדה שלנו ניסיון רב בצביעת IHC מולטיפלקס בשיטת הגברת אותות אופל/טירמיד (TSA) והפכה זאת לאוטומטי על פלטפורמת IHC (ראה טבלת חומרים)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. יש לנו פאנלים אופטימליים של תאי מערכת החיסון לזיהוי תת-קבוצות שונות של לימפוציטים, תאים מיאלואידים ותאים דנדריטיים (DC). רקמות המכילות אזורים צפופים של תאי מערכת החיסון - עבור לימפוציטים או מורפולוגיות מורכבות של תאים (כלומר, תאים מיאלואידים ו-DC) - מאתגרות במיוחד לניתוח, עם סיכון להערכת יתר או חסר של מספר תאי החיסון הנוכחים. כדי להתגבר על בעיה זו, תוכנת הניתוח ImmuNet פותחה על ידי קבוצה32 שלנו, וצינור למידת מכונה זה שיפר מאוד את איכות הזיהוי של סוגים שונים אלה של תאי חיסון. פרוטוקול מפורט החל מקבלת החומר FFPE ועד לניתוח צפיפות תאי החיסון בתאי רקמה שונים ומרחקים בין סוגי תאי מערכת החיסון מתואר כאן.
פרוטוקול זה מתאר כיצד מבוצעים לוחות IHC מרובים במרכז הרפואי האוניברסיטאי Radboud מאז יישום הדמיית הפתולוגיה הדיגיטלית בשנת 2022. לוחות IHC הרב-תכליתיים המתוארים יכולים לשמש עבור קרצינומות שונות (למשל, ריאות, ערמונית, מעי גס, שלפוחית השתן, שד) עם שימוש בנוגדן pan-cytokeratin כסמן גידול או עבור מלנומה עם שימוש בנוגדנים הקשורים למלנוציטים כסמנים סרטניים. פרוטוקולי IHC מרובים אלה עברו אופטימיזציה קפדנית במונחים של ריכוז נוגדנים ראשוני, שילובים פלואורופוריים ורצף הליך הצביעה. אנו ואחרים תיארנו אופטימיזציה של פאנל IHC מרובה מוקדם יותר 17,33,34,35. ניתן להתאים לוחות IHC מרובים, אך יש להעריך את צינורות הניתוח המתוארים ואולי להתאים אותם או להכשיר אותם בהתאם. פרוטוקולי IHC מרובי הצבעים המתוארים עושים שימוש בפלואורופורים של אופל Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 ו- 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), כך שפירוק קל של ערבוב וסריקה מהירה במכונת ההדמיה מופעלים באמצעות "Multispectral One Touch ImmunoFluorescence" (MOTiF). צביעה וסריקה של תשעה צבעים אינן מתוארות בפרוטוקול זה מכיוון שהדבר דורש כוונון עדין עוד יותר של מערך הניסוי ומצב סריקה נוסף במכונת ההדמיה המשתמשת במסנן הגביש הנוזלי.

<table><tbody><tr><td>סמל תא אנטי-CD14</td><td>&nbsp;</td><td>114R-16</td><td>סעיף 3, שיבוט EPR3653</td></tr><tr><td>אנטי-CD163</td><td>Cell Marque&nbsp;</td><td>163M-15</td><td>סעיף 3, שיבוט MRQ-26</td></tr><tr><td>anti-CD19</td><td>Abcam</td><td>ab134114</td><td>סעיף 3, שיבוט</td></tr><tr><td>EPR5906 anti-CD1c (BDCA1)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>TA505411 סעיף 3, שיבוט OTI2F4</td></tr><tr><td>anti-CD20</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-340-S</td><td>סעיף 3, שיבוט L26</td></tr><tr><td>anti-CD3</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9107</td><td>סעיף 3, שיבוט sp7</td></tr><tr><td>anti-CD303/ BDCA2</td><td>Dendritics באמצעות Enzo Lifesciences/Axxora</td><td>DDX0043</td><td>סעיף 3, שיבוט 124B3.13</td></tr><tr><td>אנטי-CD56</td><td>Cell Marque&nbsp;</td><td>156R-94</td><td>סעיף 3, שיבוט MRQ-42</td></tr><tr><td>anti-CD66b</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>555723 סעיף 3, שיבוט G10F5</td></tr><tr><td>anti-CD68</td><td>Dako Agilent</td><td></td><td>M087601 סעיף 3, שיבוט PG-M1</td></tr><tr><td>anti-CD8</td><td>Dako Agilent</td><td>M7103</td><td>סעיף 3, שיבוט C8/144B</td></tr><tr><td>anti-Foxp3</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-4777</td><td>סעיף 3, שיבוט 236A/E7</td></tr><tr><td>אנטי-Gp100</td><td>Dako Agilent</td><td>M063401</td><td>סעיף 3, שיבוט HMB45</td></tr><tr><td>anti-HLA-DR, DP, DQ</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53302</td><td>סעיף 3, שיבוט CR3/43</td></tr><tr><td>anti-MART-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-799</td><td>סעיף 3, שיבוט A103</td></tr><tr><td>anti-pan cytokeratin</td><td>Abcam</td><td>ab86734</td><td>סעיף 3, שיבוט AE1/AE3 + 5D3</td></tr><tr><td>anti-SOX10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383R</td><td>סעיף 3, שיבוט EP268</td></tr><tr><td>אנטי-טירוזינאז</td><td>Sanbio</td><td>MONX10591</td><td>סעיף 3, שיבוט T311</td></tr><tr><td>anti-XCR1</td><td>טכנולוגיות איתות תאים באמצעות Biok&eacute;</td><td>44665S</td><td>סעיף 3, שיבוט</td></tr><tr><td>מדלל נוגדנים</td> D2F8T <td>Akoya BioSciences</td><td>מק"ט&nbsp; ARD1001EA</td><td>סעיף 3, מתוך Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 שקופית (ניתן להחליף גם ב-TBST עם 10% BSA)</td></tr> <tr><td>Bond Aspirating Probe</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.0605</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>Bond Aspirating Probe</td><td>Cleaning Leica Biosciences</td><td>CS9100</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>תמיסת הסרת שעווה בונד</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9222</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>Bond Objectglas תווית + מוך הדפסה</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4564.A</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>מערכת איתור מחקר בונד 2</td><td>Leica Biosciences</td><td>DS9777</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>Bond RX autostainer&nbsp;</td><td>Leica Biosciences-סעיף</td><td></td> <td>3, פלטפורמה אוטומטית</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9961</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9640</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>Bond TM Wash Solution 10x - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9590</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>BOND אוניברסלי Covertile</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4611</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>ערכת טיטרציה של בונד (TM)</td><td>Leica Biosciences</td><td>OPT9049</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>כיסוי 24 x 32 מ"מ #1 (0.13-0.16 מ"מ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15717592</td><td>סעיף 2</td></tr><tr><td>כיסוי 24 x 50 מ"מ</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td>סעיף 2</td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-20</td><td>סעיף 3, בכל פעם שצריך לבדוק במהירות שקופיות מונופלקס, לא לניתוח רשמי, אז DAPI מוכתם בנפרד לתוצאות טובות יותר</td></tr><tr><td>Eosine</td><td></td><td></td><td>סעיף 2, אתנול תוצרת בית</td></tr><tr><td>99.5%</td> <td>VWR</td><td>4099.9005</td><td>סעיף 2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-01</td><td>סעיף 3&nbsp;</td></tr><tr><td>המטוקסילין-סעיף</td><td></td><td></td> <td>2, תוצרת בית</td></tr><tr><td>ImmuNet-ImmuNet-Immune</td><td></td><td></td> <td>Cell Detection and phenotyping Pipeline</td></tr><tr><td>inForm software 2.4.10</td><td>Akoya BioSciences-section</td><td></td> <td>4 & 6</td></tr><tr><td>OPAL 480 Reagent</td><td>Pack Akoya BioSciences</td><td>FP1500001KT</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>OPAL 520 חבילת ריאגנטים</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1487001KT</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>OPAL 570 חבילת ריאגנטים</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1488001KT</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>OPAL 620 חבילת ריאגנטים</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1495001KT</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>OPAL 690 חבילת ריאגנטים</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1497001KT</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>OPAL 780 חבילת ריאגנטים</td><td>Akoya BioSciences</td><td></td><td>FP1501001KT סעיף 3</td></tr><tr><td>ערכת IHC אוטומציה 7 צבעים של אופל 50 שקופית</td><td>Akoya BioSciences</td><td></td><td>NEL821001KT סעיף 3</td></tr><tr><td>PhenoChart 1.1.0</td><td>Akoya BioSciences-סעיף</td><td></td> <td>5</td></tr><tr><td>PhenoImagerHT</td><td>Akoya BioSciences</td><td></td><td>CLS143455 סעיף 4, מצלמת פתולוגיה דיגיטלית עם מציג שקופיות ותוכנת הדמיה (שנודעה בעבר בשם Vectra Polaris)</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה מהיר-D</td><td>Klinipath</td><td>7280</td><td>סעיף 2</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>פלטפורמת תוכנה לניתוח תמונות שקופיות שלמות</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קופסאות שקופיות</td><td>VWR</td><td>631-0737</td><td>סעיף 1</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Thermo Scientific דרך VWR</td><td>631-9483</td><td>סעיף 1</td></tr><tr><td>תוכנת Vectra Polaris 1.0.13</td><td>Akoya BioSciences-סעיף</td><td></td> <td>4</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>4055-9005</td><td>סעיף 2</td></tr></tbody></table>

ניתוח אימונוהיסטוכימי מולטיפלקס של נוף תאי החיסון המרחביים של מיקרו-סביבה סרטנית

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

נוף תאי החיסון של המיקרו-סביבה של הגידול עשוי להכיל מידע לגילוי סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים ומנבאים. אימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס היא כלי רב ערך לדמיין ולזהות סוגים שונים של תאים חיסוניים ברקמות הגידול תוך שמירה על המידע המרחבי שלה. כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לניתוח אוכלוסיות לימפוציטים, מיאלואידים ותאים דנדריטיים בקטעי רקמות. החל מחיתוך מקטעים משובצי פרפין קבועים בפורמלין, הליכי צביעת מולטיפלקס אוטומטיים על פלטפורמה אוטומטית, סריקת השקופיות במיקרוסקופ הדמיה מולטיספקטרלי, ועד ניתוח תמונות באמצעות אלגוריתם למידת מכונה שפותח בתוך החברה ImmuNet. פרוטוקולים אלה יכולים להיות מיושמים על מגוון רחב של דגימות גידול פשוט על ידי החלפת סמני הגידול כדי לנתח תאים חיסוניים בתאים שונים של הדגימה (גידול לעומת שוליים פולשניים) וליישם ניתוח השכן הקרוב ביותר. ניתוח זה אינו מוגבל לדגימות גידול, אלא יכול להיות מיושם גם על רקמות אחרות (שאינן ) פתוגניות. שיפורים בציוד ובזרימת העבודה בשנים האחרונות קיצרו באופן משמעותי את זמני התפוקה, מה שמקל על היישום העתידי של הליך זה במסגרת האבחון.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד מתבצע אפיון תאי החיסון של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות אימונוהיסטוכימיה מרובה.

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

מטרתנו היא לזהות את הכמות, הסוג והמיקום של תאי החיסון בתוך המיקרו-סביבות של הגידול. בתחום האימונוכימיה חלה התקדמות טכנולוגית משמעותית בשנים האחרונות. התקדמות בטכנולוגיית אימונוכימיה מרובת מרבבים מאפשרת לחקור סמנים נוספים באופן אמין.אתגרי הניסוי הנוכחיים הם לדמיין סוגים ספציפיים של תאים חיסוניים בתוך דגימות גידול, אשר התגברו באמצעות שיטות אימונוכימיה מרובה. עם זאת, ניתוח אוטומטי מדויק של תמונות אלה הוא עדיין אתגר שאנחנו עובדים עליו. ההבדלים בין נוף תאי החיסון בין גידולים ראשוניים לגרורתיים מעוררים שאלות כגון, אילו תכונות מהותיות של הגידול מניעות הבדלים אלה, ומה המשמעות של הבדלים אלה עבור טיפולים המכוונים למערכת החיסון?לצד עבודת הגישוש שלנו, נתמקד גם בשאלות רלוונטיות מבחינה קלינית כגון כיצד נוף תאי החיסון של הגידול מושפע מסוגים שונים של טיפולים אנטי-סרטניים והאם נוף תאי החיסון יכול לחזות את תוצאות הטיפול.

multiplex-immunohistochemical-analysis-spatial-immune-cell-landscape

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מדגים טכניקת הדמיה מולטיספקטרלית פלואורסצנטית באתרה לניתוח תת-אוכלוסיות שונות של תאי T חודרים ברקמת הגידול. קריוסקציה של רקמת קרצינומה של תאי הכליה מטופלת בנוגדנים כדי לתייג תאי T CD8+ המבטאים קולטנים מעכבים ספציפיים ומציגים פנוטיפ עמיד לאימונותרפיה. החלק המסומן מוצג באמצעות מיקרוסקופ מולטיספקטרלי כדי לזהות את תת-האוכלוסיות השונות של תאי CD8+ T.

הדמיה אימונופלואורסצנטית מרובת משתתפים לניתוח תת-אוכלוסיות תאי T עמידים לאימונותרפיה

לומד microenvironment הגידול עשוי לזהות סמנים ביולוגיים prognostic או ניבוי של תגובה קלינית חיסוני. המוצג כאן, שיטה חדשנית מבוסס על בחיי עיר פלורסצנטיות מולטי ספקטריאליות הדמיה לנתח ולספור באופן אוטומטי שונים subpopulations של CD8+ T תאים. טכניקה זו אמינה הדירים מתאים עוקבה גדול ניתוחים.

מרובב ניתוח Immunofluorescence, כימות של CD8 טים-3+ PD-1+ Intratumoral+ T תאים

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה פשוטה ונגישה להמחיש, לכמת, ומיפוי תאים חיסוניים ב-formalin-קבוע פרפין מוטבע רקמת הגידול סעיפים. מתודולוגיה זו משלבת הדמיה קיימת טכניקות ניתוח דיגיטלי עם המטרה של הרחבת יכולת ריבוב וניתוח רב פרמטרים של הדמיה מספר.

הדמיה, קוונפיקציה, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית במיקרו סביבה הגידול

ניתוח תמונת ברקוד מרובה שיפר לאחרונה את אפיון המיקרו-סביבה של הגידול, ומאפשר מחקרים מקיפים של הרכב התא, המצב התפקודי והאינטראקציות בין התא לתא. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול צביעה והדמיה באמצעות ברקוד של נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים והדמיית מחזור, המאפשרת שימוש בטכניקת ניתוח תמונה בממד גבוה.

ניתוח תמונת ברקוד מרובה פרופיל חיסוני ואפיון מיפוי מרחבי באנליזה חד-תאית של דגימות רקמת פרפין

במאמר זה מתואר פרוטוקול להגברת אות טירמיד ידנית (TSA) מולטיפלקס אימונופלואורסנציה (mIF) בשילוב עם ניתוח תמונה וניתוח מרחבי. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם מקטעים משובצי פרפין קבועים פורמלין (FFPE) לצביעה של שניים עד שישה אנטיגנים לכל שקופית, בהתאם לסורק השקופיות הזמין במעבדה.

מולטיפלקס אימונופלואורסנציה בשילוב עם ניתוח תמונה מרחבית להערכה קלינית וביולוגית של מיקרו-סביבה של הגידול

אימונוהיסטוכימיה מחזורית מולטיפלקס מאפשרת זיהוי באתרו של סמנים מרובים בו זמנית באמצעות דגירה חוזרת של נוגדני אנטיגן, סריקת תמונה ויישור תמונה ואינטגרציה. כאן אנו מציגים את פרוטוקול הפעולה לזיהוי מצעי תאי מערכת החיסון בטכנולוגיה זו בסרטן ריאות ובדגימות גרורות מוחיות זוגיות.

אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מחזורית מרובת משתתפים

התאמנו תוספת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME). המודל מורכב מתרבית תאים מעורבת, מאפשר יצירה פשוטה של אוכלוסיות תאים בודדות מועשרות מאוד ללא שימוש בתיוג פלואורסצנטי או מיון תאים, ומאפשר לחקור תקשורת בין-תאית בתוך ה-TME בתנאים רגילים או בתנאי עקה.

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

פרוטוקול זה משמש ערכה עבור הגדרת מערכת תפקודית ט-על שורות תאים סרטן והשימוש עוקבות, בפרט ללמוד את התפקיד של גידול נגזר התא חלבונים בגיוס ומונוציטים/מקרופאגים כדי microenvironment הגידול.

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

נמוך-שדה (L-band, 1.2 GHz) אלקטרון פאראמגנטיים תהודה באמצעות הגששים nitroxyl ו- trityl מסיס הוא הפגין עבור הערכה של פרמטרים חשובים מבחינה פיזיולוגית ב microenvironment הגידול במודלים של העכבר של סרטן השד.

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

קבלת דנ א גנומי באיכות גבוהה רקמות הגידול, מהווה צעד ראשון חיוני לניתוח שינויים גנטיים באמצעות רצף הדור הבא. במאמר זה, נציג שיטה פשוטה ומהירה כדי להשיג שלמות הדנ א של מגע ההטבעה ציטולוגיה דגימות ולהעשיר תאים סרטניים.

שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה

למד ניתוח אימונוהיסטוכימי מולטיפלקס לחקירת נוף תאי החיסון במיקרו-סביבה סרטנית. השיטה מאפשרת זיהוי כמות, סוג ומיקום תאים חיסוניים בדגימות גידול לשיפור אסטרטגיות טיפוליות.

ניתוח אימונוהיסטוכימי מולטיפלקס של נוף תאי החיסון המרחביים של מיקרו-סביבה סרטנית

גלה סרטונים נוספים