Name: בידוד, הרחבה חוץ גופית ואפיון תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן אפידידימלית של עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: למדו בידוד ואפיון תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן אפידידימלית של עכבר. הפרוטוקול מדגים פוטנציאל טיפולי בדלקת ובמחלות זיהומיות כגון Schistosoma mansoni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי מענק של Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) ו- Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). מחקר זה מומן בחלקו על ידי PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG ו- URS הודות למלגה שהוענקה על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB), ו- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), בהתאמה.

תרבית ראשונית של רקמת שומן שמקורם בתאי גזע מאפידידימיס עכבר

<ol><li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells.</a> J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).</li>
<li>Pittenger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+perspective%3A+cell+biology+to+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress.</a> npj Regen Med. 4, 22(2019).</li>
<li>Lin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+and+cancer%3A+Clinical+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities.</a> BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).</li>
<li>Mazini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hopes+and+limits+of+adipose-derived+stem+cells+%28ADSCs%29+and+mesenchymal+stem+cells+%28MSCs%29+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing.</a> Int J Mol Sci. 21 (4), 1306(2020).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+mechanisms+of+mesenchymal+stem+and+stromal+cells+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases.</a> Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).</li>
<li>Uccelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue-derived+small+extracellular+vesicles+promote+soft+tissue+repair+through+modulating+M1-to-M2+polarization+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages.</a> Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67(2023).</li>
<li>Maffioli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+primed+by+pro-inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines.</a> J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).</li>
<li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-stem-cell-induced+immunoregulation+involves+FAS-ligand-%2FFAS-mediated+T+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis.</a> Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+mesenchymal+stem+cells+in+immunomodulation%3A+pathological+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications.</a> Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+vs.+autologous+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+in+their+medication+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice.</a> Cell Biosci. 11, 187(2021).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+and+promises+of+allogeneic+mesenchymal+stem+cells+for+use+as+a+cell-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 234(2015).</li>
<li>Jurado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stromal+cells+as+part+of+therapy+for+chronic+graft-versus-host+disease%3A+A+phase+I%2FII+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study.</a> Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+exosome-educated+macrophages+alleviate+systemic+lupus+erythematosus+by+promoting+efferocytosis+and+recruitment+of+IL-17%2B+regulatory+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484(2022).</li>
<li>Fernández, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+%28AdMSC%29+for+the+treatment+of+secondary-progressive+multiple+sclerosis%3A+A+triple+blinded%2C+placebo+controlled%2C+randomized+phase+I%2FII+safety+and+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study.</a> PLoS One. 13 (5), 0195891(2018).</li>
<li>Abdolmohammadi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-based+therapy+as+a+new+therapeutic+approach+for+acute+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation.</a> Life Sci. 312, 121206(2023).</li>
<li>Hoang, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+therapy+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based therapy for human diseases.</a> Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272(2022).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+expression+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+bone+marrow+and+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue.</a> Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).</li>
<li>Strem, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+differentiation+of+adipose+tissue+derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Keio+J+Med%22%5BJournal%5D)">Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells.</a> Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).</li>
<li>Kern, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow%2C+umbilical+cord+blood%2C+or+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).</li>
<li>Dominici, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Berryman, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+hormone%27s+effect+on+adipose+tissue%3A+Quality+versus+quantity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621(2017).</li>
<li>Shomer, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+rodent+euthanasia+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Review of rodent euthanasia methods.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).</li>
<li>Miranda, V. H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+damage+in+schistosomiasis+is+reduced+by+adipose+tissue-derived+stem+cell+therapy+after+praziquantel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment.</a> PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635(2020).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+primary+bone+marrow+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells.</a> Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).</li>
<li>Boregowda, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).</li>
<li>Sreejit, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li>
<li>Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Cells. 10 (12), 3433(2021).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

MSCs ניתן לחלץ רקמות שונות. למרות שמח עצם מייצג מקור משותף של MSCs הן במורין והן בבני אדם25,26, בחרנו לעבוד עם רקמת השומן במחקר זה בגלל העושר שלה ב- MSCs, הפיזור בגוף וקלות הגישה אליה. כחלופה, ניתן להשתמש בתאי גזע שמקורם בשומן כדי ליצור תאים אימורטליים דמויי MSCs27.
כמה נקודות של החילוץ ראויות לתשומת לב מיוחדת להצלחת הפרוטוקולים המשותפים כאן. ראשית, אנו מדגישים את הטיפול לאסוף את הרקמה כי חייב להיעשות בתנאים אספטיים. לכן, ודא שהעכברים מחוטאים כראוי עם 70% אלכוהול לפני תחילת הניתוח. נקודה חשובה נוספת היא לא להשתמש באותו סט של פינצטה ומספריים כדי להרים את רקמת השומן האפידידימלית, ובכך להימנע מכל מקור זיהום. 
דאגה שנייה היא עיבוד של רקמות. השברים בצינור החרוטי חייבים להיות מזועזעים כראוי ובמרץ עם 10 דקות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס. חשוב מאוד לשנות את המדיום למחרת ולאחר מכן כל 2-3 ימים. מומלץ להתבונן בתרבית מדי יום, לבדוק את הצבע הבינוני, צורת התא וכל הפרעה בסביבת התרבית. 
דאגה שלישית היא לגבי הזמן/המעבר הטוב ביותר לאפיון MSC. כאן, אנו ממליצים לעשות את זה במעבר השלישי של תאים, אבל זה לא חובה. זה תלוי במטרת המחקר. בקטע השלישי, יש לנו כ -80% מהתאים המאופיינים כ- MSCs, וזה מספיק למטרות המחקר הזה למשל. האפיון הפנוטיפי מתבצע על ידי ניתוח ביטוי של סמנים המטופויטיים (CD34 ו- CD45, למשל) וסמנים מזנכימליים (CD29, CD73, CD90 ו- CD105, למשל). יתר על כן, האגודה הבינלאומית לתרפיה תאית וגנטית (ISCT)21 מדגישה כי ADSCs צריכים להיות בעלי מורפולוגיה דמוית פיברובלסטים ולדבוק בפלסטיק של פלטפורמת התרבית. ניתן לצפות במורפולוגיה תחת מיקרוסקופ במהלך התרבות הגדלה. האפיון הפונקציונלי מתבצע על ידי ניתוח הפוטנציאל של ADSCs להתמיין לתאי אוסטאובלסט, אדיפובלסטים וכונדרובלסטים. באפיון הפנוטיפי, אחוז הסמנים המזנכימליים וההמטופויטיים עשוי להשתנות בהתאם למין החי ולמקור התא, ואינו עומד באופן מלא במספרים המומלצים על ידי ISCT. לדוגמה, ISCT ממליץ עבור MSCs אנושיים ≥95% של CD105, CD73, CD90, ו ≤2% של CD45, CD34, CD14 או CD11b, CD79a או CD19, אנטיגן לויקוציטים אנושי - DR איזוטיפ (HLA-DR)21. יתר על כן, חשוב לבצע את האפיון הפונקציונלי ולאשר את הרב-עוצמה של תאים המתמיינים לשושלות אוסטאובלסטים, כונדרוציטים ואדיפוציטים. לפחות שתיים מהשושלות הללו מומלצות להוכחת רב-עוצמה. 
בנוסף לנקודות מודגשות אלה, ניתן להחליף כמה בדיקות המוצעות כאן, למשל, Alizarin Red S במקום צביעת פון קוסה, Periodic Acid Shiff במקום Alcian Blue, ותגובת שרשרת פולימראז (PCR) במקום ציטומטריית זרימה. 
מבין שלושת סוגי רקמת השומן המתוארים בבני אדם (לבן, חום ובז'), רקמת השומן הלבנה היא בעלת המקור הגבוה ביותר של MSCs28. רקמה זו יכולה להתקבל מאזורים תת עוריים, בטניים ומפשעתיים, כגון השומן מעל האפידידימיס המדווח כאן. הפיצול הפיזי והעיכול האנזימטי על ידי collagenase המשמש בפרוטוקול המשותף כאן גוזרים את מקטע כלי הדם הסטרומה (SVF) המורכב מסוגי תאים רבים, למעט האדיפוציטים, אשר מתרוקנים במהלך העיבוד. 
לסיכום, היתרונות העיקריים של שימוש ברקמת השומן כמקור ל-MSCs כוללים את השפע והקלות של שיטות בידוד תאים, הקשורות לפוטנציאל הטיפולי של MSCs כתכונות אנטי דלקתיות ורגנרטיביות.

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הם תאים רב-פוטנציאליים בוגרים המתמיינים לתאים כגון אוסטאובלסט, כונדרובלסט ואדיפוציט 1,2. תאים אלה שוכנים במספר איברים, ובגלל זה, הם יכולים להיות מופקים מרקמות בוגרות כגון מח עצם, שריר, שומן, זקיק שיער, שורש השן, שליה, דרמיס, פריכונדריה, חבל הטבור, ריאות, כבד, טחול 3,4.
ההשפעות של MSCs על הפיזיולוגיה והמערכת החיסונית דווחו 5,6. תאים אלה היו מבטיחים לטיפול במספר מחלות, הן ברפואה האנושית והן ברפואה הווטרינרית. MSCs יכולים לשלוט בדלקת ולקדם אנגיוגנזה והומאוסטזיס רקמות באמצעות מנגנונים שונים, כגון מגע בין תאים, גורמים מסיסים ובועיות חוץ-תאיות קטנות 7,8,9,10. יתר על כן, MSCs הם תאים בעלי זכויות חיסון המסוגלים לשרוד אצל מושתלים אלוגניים שאינם תואמים אימונולוגית מכיוון שתאים אלה מראים ביטוי נמוך של מולקולות מורכבות היסטותאימות עיקריות מסוג I (MHC) ומשמשים בטיפול מבוסס תאים להשתלה אלוגנית11,12. האימונוגניות הנמוכה בשילוב עם הפוטנציאל הרגנרטיבי הופכת MSCs למועמדים אידיאליים לטיפול תאי, כגון מחלת השתל נגד המאכסן (GvHD)13, זאבת אדמנתית מערכתית (SLE)14, וטרשת נפוצה15, בין היתר16,17.
למרות העובדה כי MSCs שוכנים במספר רקמות בוגרות, רקמת השומן מציעה יתרונות על פני מקורות אחרים, כגון נגישות לקציר, עם התערבות כירורגית מינימלית; מספר גדול של תאים זמינים עם קצב התפשטות גבוה; והרחבה קלה במבחנה באמצעות פרוטוקול קל לביצוע ללא צורך בציוד ספציפי וחומרים בעלות נמוכה 18,19,20. לאחר החילוץ, יש לאפיין את תאי הגזע שמקורם ברקמת השומן (ADSCs) כפי שהוקם על ידי האגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT)21. לפיכך, MSCs חייבים להראות מורפולוגיה דמוית פיברובלסט, דבקות בתרבית פלסטית, המבטאת אחוז גבוה (≥95%) של סמנים מזנכימליים כגון אנדוגלין (CD105), ecto-5'-nucleotidase (CD73) ו- Thy-1 (CD90), ואחוז נמוך (≤2%) של סמנים hematopoietic כגון אנטיגן משותף לויקוציטים (CD45), פוספוגליקופרוטאין transmembrane (CD34), גליקופרוטאין קרום מעוגן גליקוליפיד (CD14), integrin alpha M (CD11b), שרשרת אלפא חלבון משויך קולטן אנטיגן B (CD79α) או B-לימפוציטים פני השטח אנטיגן B4 (CD19) ואנטיגן לויקוציטים אנושי סוג II (HLA-II). יתר על כן, נדרש אפיון פונקציונלי, והתאים צריכים להיות מסוגלים להתמיין לתאי אוסטאובלסט, כונדרובלסטים או אדיפובלסטים21.
כאן, אנו מראים כיצד להשיג את MSCs מרקמת שומן אפידידימלית באמצעות דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי עבור מחקרי מבחנה והאפיון המורפולוגי שנקבע מראש על ידי ISCT.

<table><tbody><tr><td>140 מעלות; C חממת עיקור בחום גבוה CO2 חממה</td><td>RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, סין</td><td>C180</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich, סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Sigma-Aldrich, סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>PHR1748</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma-Aldrich, סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>A9186</td><td>BioReagent, מתאים לזיהוי גליקופרוטאינים. 1% בחומצה אצטית, pH 2.5</td></tr><tr><td>אלכוהול 70%</td> <td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"</td>ב <td>65350-M</td><td>70% במים</td></tr><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"</td>ב <td></td> PHR1662 <td></td></tr><tr><td>נוגדנים נגד עכבר נגד CD29 FITC (Clone Ha2/5)</td><td>BD Biosciences, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב</td><td>555005</td><td>פונקציות בתא: הידבקות והפעלה, אמבריוגנזה, לויקוציטים, DC, טסיות דם, תאי פיטום, פיברובלסטים ותאי אנדותל</td></tr><tr><td>נוגדנים נגד עכבר אנטי-CD34 PE (Clone RAM34)</td><td>BD Biosciences, סן דייגו, קליפורניה, ארה"</td>ב <td>551387</td><td>פונקציות בתא: גורם הידבקות תאים. תאי גזע המטופויאטיים</td></tr><tr><td>נוגדנים נגד עכבר אנטי-CD45 APC (Clone 30-F11)</td><td>BD Biosciences, סן דייגו, קליפורניה, ארה"</td><td></td><td>ב 559864 תפקודים בתא: מסייע בהפעלת לויקוציטים</td></tr><tr><td>נוגדנים נגד עכבר אנטי-CD71 FITC (Clone C2)</td><td>BD Biosciences, סן דייגו, קליפורניה, ארה"</td><td></td><td>ב 553266 פונקציות בתא: שולט בספיגת הברזל במהלך התפשטות התאים. תאים מתרבים, רטיקולוציטים וקודמים</td></tr><tr><td>נוגדנים נגד עכבר אנטי-CD90 PerCP (Clone OX-7)</td><td>BD Biosciences, סן דייגו, קליפורניה, ארה"</td><td></td><td>ב 557266 פונקציות בתא: איתות, הידבקות. לימפוציט T, NK, מונוציטים, HSC, נוירון, פיברובלסט</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>PHR1008</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות אוטומטיות</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב</td><td>4700850N</td><td>Finnpipette F1 ערכות צנרת מעבדה טובה (GLP)</td></tr><tr><td></td><td>לא ישים</td><td></td><td>1 יחידה</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזוריארה"ב</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים (6 בארות)</td><td>מרק, דרמשטדט, גרמניה</td><td>Z707759</td><td>07 יחידות סטריליות., לוחות תרבית רקמות TPP</td></tr><tr><td>לוחות תרבית תאים (96 באר. עגול או תחתון V)</td><td>Merck, דרמשטדט, גרמניה</td><td>CLS353077</td><td>01 יחידה סטרילית. בארות, 96, משטח מטופל בתרבית רקמות (TC), בארות שקופות תחתונות עגולות,</td></tr><tr><td>מדיום כונדרוגני</td> סטרילי <td>Stem Pro Chondrogenesis Differentiation&ndash; Life Technologies</td><td>A1007101</td><td>TGF-&BETA; 2, TGF-ובטא; 3, דקסמתזון, אינסולין, טרנספרין, ITS, נתרן-L - אסקורבט, נתרן פירובט, אסקורבט-2-פוספט</td></tr><tr><td>קולגנאז סוג II</td><td>Life Technologies, קליפורניה, ארה"ב</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>שעם או לוח קלקר מכוסה באלומיניום</td><td>לא ישים</td><td></td><td>1 יחידה</td></tr><tr><td>כותנה</td><td>לא ישים</td><td></td><td>50 גרם</td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לניתוח</td><td>לא ישים</td><td></td><td>03 יחידות</td></tr><tr><td>תושבת DPX סטרילית להיסטולוגיה</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s שונה Eagle' s medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>D5523</td><td>עם 1000 מ"ג/ליטר גלוקוז ו-L-גלוטמין, ללא נתרן ביקרבונט, אבקה, מתאימה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>Eosin B</td><td>Sigma-Aldrich, סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>861006</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich, סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>47608</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>ג'נטמיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>המטוקסילין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>מחט היפודרמית (0.3 מ"מ x 13 מ"מ)</td><td>לא ישים</td><td></td><td>5 יחידות</td></tr><tr><td>אינדומתצין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>I0200000</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"</td>ב <td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"</td><td></td><td>ב 563935 70% בתמיסת H2O</td></tr><tr><td>קטמין-D4 הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"</td>ב <td>K-006</td><td>1.0 מ"ג/מ"ל במתנול (כבסיס חופשי), חומר עזר מאושר, Cerilliant&reg;</td></tr><tr><td>לשכת נויבאואר</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>BR718620</td><td>תא ספירת מותגים דפוס BLAUBRAND Neubauer. עם קליפסים,</td></tr><tr><td>קצות פיפטה Nichiryo כפולים (0.1&ndash; 10 &mu; L)</td> <td>Merck, Darmstadt, גרמניה</td><td>Z645540</td><td>טווח נפח 0.1&ndash; 10 &mu; L, מוארך, חבילה בתפזורת. </td></tr><tr><td>קצות פיפטה Nichiryo סטריליים (1&ndash; 10 מ"ל)</td> <td>מרק, דרמשטדט, גרמניה</td><td>Z717401</td><td>טווח נפח 1&ndash; 10 מ"ל, אוניברסלי, חבילה בתפזורת. </td></tr><tr><td>קצות פיפטה Nichiryo סטריליים (200 &mu; L)</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>Z645516</td><td>נפח מקסימלי 200 &mu; L, בוגר, מיני-ערימה. </td></tr><tr><td>שמן סטרילי-תמיסת O אדום</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"</td>ב <td>O1391</td><td>0.5% באיזופרופנול</td></tr><tr><td>פרפין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>107.151</td><td>46&ndash; 48, בצורת בלוק</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"</td>ב תמיסת <td>P4333</td><td>מיוצבת, עם 10,000 יחידות פניצילין ו-10 מ"ג סטרפטומיצין/מ"ל, 0.1 &mu; m מסונן, BioReagent, מתאים לתרבית תאים</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט 1x (PBS).</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td> אבקת <td>P3813</td><td>, pH 7.4, להכנת תמיסות של 1 ליטר. צינורות חרוטיים מפוליפרופילן מאוזנים וסטריליים</td></tr><tr><td>(15 מ"ל)</td><td>Falcon, Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים מפוליפרופילן סטריליים (50 מ"ל)</td><td>Falcon, Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>2 יחידות</td></tr><tr><td>אזמל סטרילי (אופציונלי)</td><td>לא ישים</td><td></td><td>1 יחידה</td></tr><tr><td>חנקת כסף</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>85228</td><td></td></tr><tr><td>נתרן תיוסולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה כירורגית (15 ס"מ)</td><td>לא ישים</td><td></td> 3 יחידות עכברים זכרים <td>שוויצריים סטריליים</td></tr><tr><td>(6&ndash; 8 שבועות)</td> <td>ביוטריום, אוניברסיטת סנטה קרוז סטייט</td><td>מזרק 021/22</td><td></td></tr><tr><td>(1 מ"ל)</td><td>לא ישים</td><td></td><td>יחידה אחת</td></tr><tr><td>טריפן צבע כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>T8154</td><td>0.4%, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים</td></tr><tr><td>טריפסין/EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>PHR3263</td><td></td></tr><tr><td>&בטא;-גליצרופוספט מלח דיסודיום הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ', סן לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>G9422</td><td>BioUltra, מתאים לתרבית תאים, מתאים לתרבית תאים צמחיים, &ge; 99% (טיטרציה)</td></tr></tbody></table>

בידוד, הרחבה חוץ גופית ואפיון תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן אפידידימלית של עכבר

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) נחקרו בהרחבה כגישה טיפולית חדשה, בעיקר כדי לעצור דלקת מחמירה בשל הפוטנציאל שלהם לווסת את התגובה החיסונית. MSCs הם תאים בעלי זכויות חיסון המסוגלים לשרוד במושתלים אלוגניים שאינם תואמים אימונולוגית בהתבסס על ביטוי נמוך של מולקולות מורכבות היסטותאימות עיקריות מסוג I (MHC) ובשימוש בטיפול תאי להשתלה אלוגנית. תאים אלה יכולים להיות מבודדים ממספר רקמות, כאשר הנפוץ ביותר הוא מח העצם ורקמות השומן. אנו מספקים פרוטוקול קל לבידוד, תרבית ואפיון MSCs מרקמת שומן אפידידימלית של עכברים. רקמת השומן האפידידימלית נכרתת בניתוח, מקוטעת פיזית ומתעכלת בתמיסת 0.15% קולגן מסוג II. לאחר מכן, תאי גזע ראשוניים שמקורם ברקמת שומן (ADSCs) מתורבתים ומורחבים במבחנה, והאפיון הפנוטיפי מתבצע על ידי ציטומטריית זרימה. אנו מספקים גם את השלבים להתמיין ADSCs לתאים אוסטאוגניים, אדיפוגניים וכונדרוגניים, ולאחר מכן אפיון פונקציונלי של כל שושלת תאים. הפרוטוקול המסופק כאן יכול לשמש לניסויים in vivo ו - ex vivo , וכחלופה, תאי גזע שמקורם בשומן יכולים לשמש ליצירת תאים אימורטליים דמויי MSCs.

תאים שחולצו מרקמת השומן על פי הפרוטוקול המוצג כאן הראו מורפולוגיה התואמת את הקריטריונים המינימליים עבור MSCs המוצעים על ידי ISCT. סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1. באופן פנוטיפי, ADSCs הראו היצמדות למורפולוגיה פלסטית ודמוית פיברובלסטים בימים הראשונים של תרבית תאים (איור 2A). בנוסף, הם גדלו הומוגנית ויצרו מושבות. יתר על כן, ADSCs הראו ביטוי נמוך של CD34 (2.12%) ו- CD45 (1.81%), הן סמנים המטופויאטיים, והן ביטוי גבוה של CD71 (42.6%), CD29 (74.2%) ו- CD90 (55.1%), כל סמני התאים המזנכימליים (איור 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65722/65722fig02.jpg"> איור 2: אפיון פנוטיפי של תאים שמקורם ברקמת שומן. (A) מורפולוגיית ADSCs משתנה מסבב לדמוי פיברובלסט בימים 2, 4 ו-8 של התרבית; סרגל קנה מידה = 22.22 מיקרומטר. (B) היסטוגרמות לסמנים המבוטאים (CD71, CD29 ו- CD90) או לא (CD34 ו- CD45) על ידי ASC. נתון זה שוחזר באישור מירנדה ואחרים 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65722/65722fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מבחינה פונקציונלית, ADSCs הראו רב-עוצמה להתמיין לאוסטאובלסט, אדיפובלסט וכונדרובלסט כאשר תורבתו במדיה מותנית עבור כל שושלת במשך 14 או 21 יום (איור 3). צביעת פון קוסה חשפה גושים מינרליים במטריצה החוץ תאית, האופייניים לתהליך האוסטאוגנזה (איור 3). צביעת O בצבע אדום-שמן העידה על ואקואולות שומנים בציטופלסמה של ADSCs, והצביעה הכחולה של Alcian אישרה את נוכחותו של גליקוזאמינוגליקן במטריצה החוץ תאית (איור 3). יחד, מאפיינים פנוטיפיים ופונקציונליים אישרו את אוכלוסיית התאים שהופקו מרקמת שומן אפידידימלית כ- MSCs.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65722/65722fig03.jpg"> איור 3: אפיון פונקציונלי של תאים שמקורם ברקמת שומן. פוטנציאל רב-שושלות אוסטאוגני, אדיפוגני וכונדרוגני של ADSC לאחר 14 ו-21 יום בתרבית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (פנל עליון), 100 מיקרומטר (פנלים אמצעיים ותחתונים). נתון זה שוחזר באישור מירנדה ואחרים 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65722/65722fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

רקמת השומן היא מקור מצוין לתאי גזע מזנכימליים. כאן, אנו מביאים את המיצוי, הטיפוח והאפיון שלב אחר שלב של תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ADSCs) מרקמת שומן אפידידימלית של עכברים שוויצרים.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been extensively studied as a new therapeutic approach, mainly to stop exacerbated inflammation due to their potential ...

המחקר שלי מתמקד בתאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן כגישה חדשה, טיפול הקשור או לא קשור לטיפולים אחרים לשיפור הדלקת ממספר מחלות. הראינו כי שימוש בתאי גזע מזנכימליים שומניים בשילוב עם Praziquantel שלט באופן משמעותי בתגובה הגרנולומטית בזיהום Schistosoma mansoni, והדגיש את היתרונות של גישת טיפול משולבת זו. הפרוטוקול שלנו מתייחס לפער המחקרי באיסוף הקפדני של רקמת שומן אפידידימלית תחת התוויות אספטיות, שהעיבוד הפיזי כרוך בטלטול נמרץ, ומזהה את הזמן האופטימלי לניצול תאי גזע שמקורם בשומן.הפרוטוקול שלנו מציע יתרונות משמעותיים, בעיקר הזמינות השופעת והחוזק הפוטנציאלי לבידוד תאי גזע מזנכימליים. בנוסף, לתאי גזע מזנכימליים תכונות טיפוליות חזקות, כולל יכולות אנטי דלקתיות והתחדשות רקמות.

isolation-vitro-expansion-characterization-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) המסומנים באופן פלואורסצנטי מרקמת השומן של קשת פריאורטית. לאחר הבידוד, NCADSCs מזוהים, ממוינים באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ולאחר מכן תרבית על צלחת, קידום התפשטות תאים.

בידוד תאי גזע שמקורם בשומן מרקמת שומן פריאורטית מורין

אנו מציגים פרוטוקול לבודד שברי כלי דם ברקמה שומני נגזרות המייצגים יחידות כלי דם הבטיח. הם יכולים להיות מבודדים במהירות, אינו דורש עיבוד במבחנה, ובכך, ניתן להשתמש prevascularization צעד אחד בתחומים שונים של הנדסת רקמות.

בידוד של נגזרות רקמה שומנית Murine כלי דם שבר כיחידות כלי דם של הנדסת רקמות

פרוטוקול זה מספק שיטה נטולת אנזימים לבידוד תאי גזע mesenchymal מ מתיחת בטן ודגימות ליפוף באמצעות שיטת החקור. העדר אנזימים קשים או צעדים צנטריפוגה מספק תאי גזע רלוונטיים קלינית שניתן להשתמש בהם למחקרים בתוך מבחנה או להעביר חזרה למרפאה.

שיטה נטולת אנזימים לבידוד והתרחבות של אדיפוז האנושית-תאי גזע נגזרים

פרוטוקול זה מתאר את הגישה הטכנית לבידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני רקמת שומן לבן תוך בטני (WAT) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או הפרדת חרוזים אימונומגנטית.

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד תאי אב שומן קיימא מאוד מרפידות שומן אפידיליות עכבר באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות.

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת השומן (Ad-MSCs) יכולים להיות מקור פוטנציאלי של MSCs המתמיינים לתאים המייצרים אינסולין (IPCs). בפרוטוקול זה, אנו מספקים שלבים מפורטים לבידוד ואפיון של Ad-MSCs אפידידימליים של חולדות, ולאחר מכן פרוטוקול פשוט וקצר ליצירת IPCs מאותם Ad-MSCs של חולדה.

בידוד של תאי גזע מזנכימליים של רקמת שומן חולדה לצורך התמיינות לתאים המייצרים אינסולין

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לבידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים (MSC) שמקורם ברקמת שומן מחולדות Sprague Dawley.

בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

האנדותל להרכיב המושבה ובתאים (ECFCs) הם כלי מבטיח ללמוד הומאוסטזיס לתקן כלי הדם.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והרחבת הבאות של תאים סטרומה mesenchymal ותאי האנדותל המושבה להרכיב ללא שימוש בבעלי חיים בסרום ליצור זוגות עצמיים למטרות השתלה ניסיונית.

בידוד בעלי חיים הרחבת חינם סרום של טבורי האדם נגזר תאים סטרומה mesenchymal (MSCs) ו האנדותל יצירת המושבה ובתאים (ECFCs)

במאמר זה אנו מדגימים את הבידוד של Murine ריאות תושב בתאי גזע mesenchymal (ריאות MSC), הרחבה שלהם, אפיון וניתוח של מאפייני המערכת החיסונית.

בידוד &amp; אפיון Hoechst נמוך CD45 שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

למדו בידוד ואפיון תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן אפידידימלית של עכבר. הפרוטוקול מדגים פוטנציאל טיפולי בדלקת ובמחלות זיהומיות כגון Schistosoma mansoni.

בידוד, הרחבה חוץ גופית ואפיון תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן אפידידימלית של עכבר

גלה סרטונים נוספים