Name: מעקב אחר שחרור miRNA לתוך שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות ציטומטריית זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: חקור את מנגנון שחרור microRNA לתוך שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות ציטומטריית זרימה בקווי תאים של Calu-6. פרוטוקול זה מאפשר לעקוב אחרי תהליך האריזה הדינמי ולחקור את דרכי הריקון של microRNA בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים בתמיכה ובייעוץ מד"ר ג'יל האצ'קרופט, מנהלת מתקן הליבה של Flow Cytometry באוניברסיטת Purdue. עבודה זו נתמכה על ידי R01CA226259 ו- R01CA205420 ל- A.L.K., פרס חדשנות של איגוד הריאות האמריקאי (ANALA2023) IA-1059916 ל- A.L.K., מענק מתקן משאבים משותפים של Purdue P30CA023168, ומלגת דגל פולברייט לדוקטורט שהוענקה על ידי מחלקת המדינה, ארה"ב ל- H.H.

פרוטוקול ציטומטריית זרימה להבנת מנגנוני ייצוא

<ol><li>Kasinski, A. L., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+en+route+to+the+clinic%3A+Progress+in+validating+and+targeting+microRNAs+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).</li>
<li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+microRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).</li>
<li>Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FolamiRs%3A+Ligand-targeted%2C+vehicle-free+delivery+of+microRNAs+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer.</a> Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327(2017).</li>
<li>Orellana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+microRNA+activity+through+increased+endosomal+release+mediated+by+nigericin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin.</a> Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).</li>
<li>Abdelaal, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+first-in-class+fully+modified+version+of+miR-34a+with+outstanding+stability%2C+activity%2C+and+anti-tumor+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy.</a> Oncogene. , (2023).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles%3A+Apoptotic+bodies%2C+microvesicles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Hasan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+released+by+non-small+cell+lung+cancer+cells+drive+invasion+and+permeability+in+non-tumorigenic+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 972(2022).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Villarroya-Beltri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylated+hnRNPA2B1+controls+the+sorting+of+miRNAs+into+exosomes+through+binding+to+specific+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs.</a> Nature Communications. 4, 2980(2013).</li>
<li>Cha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAS-dependent+sorting+of+miRNA+to+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes.</a> elife. 4, e07197(2015).</li>
<li>Gandham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+and+standardization+in+research+on+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Technologies and standardization in research on extracellular vesicles.</a> Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Sork, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+interplay+of+the+extracellular+vesicle+small+RNA+transcriptome+and+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10813(2018).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nature Communications. 2, 282(2011).</li>
<li>Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+export+into+extracellular+vesicles+and+function+of+tRNA+fragments+during+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation.</a> Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).</li>
<li>Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-125b-5p+impacts+extracellular+vesicle+biogenesis%2C+trafficking%2C+and+EV+subpopulation+release+in+the+porcine+trophoblast+by+regulating+ESCRT-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway.</a> The FASEB Journal. 37 (8), e23054(2023).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול החדש שהוקם מאפשר לכידת קינטיקה של שחרור miRNA לרכבים חשמליים לאחר טרנספקציה של EV-miRNAs. הגישה מאפשרת ניתוח סימולטני של מספר רב של EV-miRNA ו-cell-miRNAs, בכפוף ליכולות הציטומטר. יתר על כן, בעוד ניתוח ציטומטריית זרימה יכול לספק תובנות חשובות על ביולוגיה miRNA EV, זה לא בלי מגבלות. אם כי ניתן להתגבר על חלק מהמגבלות כאשר משתמשים בהן בשילוב עם טכניקות אחרות להבנה מקיפה יותר. 
תחום מתפתח של עניין בביולוגיה של כלי רכב חשמליים הוא הבנת הייצוא הסלקטיבי של miRNA לרכבים חשמליים<sup class="xr...

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הוא אחת מתת-הקבוצות המאופיינות ביותר של רנ"א קטן שאינו מקודד, הידועות בתפקידן הקריטי בוויסות גנים לאחר שעתוק. הביטוי והביוגנזה של רוב ה-miRNAs עוקבים אחר סדרה מתואמת של אירועים שמתחילה בשעתוק של ה-miRNA הראשוני (pri-miRNAs) בגרעין. לאחר עיבוד גרעיני על ידי קומפלקס המיקרו-מעבדים לתוך precursor-miRNA (pre-miRNAs), pre-miRNAs מיוצאים לציטופלסמה, שם הם עוברים עיבוד נוסף על ידי אנדונוקלאז RNase III, dicer לתוך 21-23 נוקלאוטיד בוגר miRNA דופלקסים1. אחד הגדילים של ה-miRNA הבוגר המעובד נקשר ל-mRNA שליח המטרה (mRNAs), מה שמוביל לפירוק או לדיכוי תרגומי של המטרות2. בהתבסס על התפקיד הפליוטרופי של miRNAs בוויסות סימולטני של מספר mRNA מטרות מגוונות, אין זה מפתיע שביטוי miRNA מווסת היטב3. אכן, ביטוי לא הולם תורם למצבי מחלה שונים, במיוחד בסרטן. הביטוי החריג של miRNAs לא רק מייצג חתימה ספציפית למחלה, אלא גם התגלה כיעד לפוטנציאל פרוגנוסטי וטיפולי 4,5,6. בנוסף לתפקידים התוך-תאיים שלהם, ל-miRNA יש גם תפקידים לא אוטונומיים. לדוגמה, miRNA יכול להיות ארוז באופן סלקטיבי לתוך EVs על ידי תאים תורמים ולייצא לאתרים מושתלים, שם הם מעוררים תגובות פנוטיפיות מגוונות בפיזיולוגיה נורמלית ומחלות 7,8,9.
למרות ראיות ברורות לכך ש-miRNA הקשור לרכב חשמלי הוא ביומולקולות פונקציונליות, לא לגמרי מובן כיצד תת-קבוצות ספציפיות של miRNA אינן מווסתות במצבי מחלה כגון סרטן, וכיצד מנגנון תאי בוחר וממיין miRNA ל-Evs10,11. בהתחשב בתפקיד הפוטנציאלי של EV-miRNA בוויסות המיקרו-סביבה, חיוני לזהות את המנגנונים המעורבים בייצוא miRNA נבחרים כדי להבהיר באופן מלא את תפקידם של כלי רכב חשמליים בתקשורת בין-תאית ובפתוגנזה של מחלות. הבנת תהליך שחרור miRNA לרכבים חשמליים לא רק תדגיש מתווכים חשובים של ייצוא miRNA, אלא גם יכולה לספק תובנות לגבי טיפולים פוטנציאליים. כדי להשיג רמה זו של ידע, יש להתאים כלים כדי לענות נאמנה על שאלות ניסוייות חדשות אלה. ואכן, מחקרים המעריכים כלי רכב חשמליים גדלים באופן אקספוננציאלי עקב הכנסת טכניקות ובקרות חדשות12,13. ביחס להערכת השפע של miRNA מיוצא לכלי רכב חשמליים, ריצוף הדור הבא ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (qRT-PCR) היו הכלים הסטנדרטיים הנוכחיים. בעוד שכלים אלה שימושיים להערכת שפע ה-miRNA ברכבים חשמליים, יש מגבלות לרגישות ולספציפיות שלהם, והשימוש בגישות סטטיות אלה להערכת דינמיקה אינו מספיק. הגדרת הדינמיקה של ייצוא miRNA לרכבים חשמליים דורשת שילוב של כלים מיוחדים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף באמצעות miRNA מצומד פלואורסצנטית, כדי לנתח את הדינמיקה של שחרור miRNA מתאי תורם ושילוב לתוך EVs. כמו כן, אנו דנים ביתרונות ובמגבלות השיטה ומספקים המלצות לשימוש מיטבי. השיטה הרב-תכליתית המוצגת במאמר זה תהיה שימושית לחוקרים המעוניינים לחקור שחרור miRNA לרכבים חשמליים ואת תפקידם הפוטנציאלי בתקשורת תאית ובמחלות.

<table><tbody><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>פישר</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פלקון 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>352097</td><td></td></tr> 6 <tr><td>בארות משטח תחתון שטוח מטופל צלחות תרבית רקמות</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>ApogeeMix 25 מ"ל, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 ננומטר)&nbsp;</td><td>Apogee Flow Systems</td><td>1527</td><td>להגדרת שער ופרמטרים לזיהוי חלקיקים&nbsp;</td></tr><tr><td>Attune Nxt Flow Cytometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>לניתוח פלואורסצנטי ב-EVs</td></tr><tr><td>BD Fortessa Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>לניתוח פלואורסצנטי בתאים&nbsp;</td></tr><tr><td>אינקובטור תרבית תאים</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>שמירה על טמפרטורה של 37&nbsp; &deg; C ו-5% CO2</td></tr> <tr><td>מדיום תרבית תאים</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>ספציפי לקו התא המעניין</td></tr><tr><td>קו התא המעניין&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>כל קו תאים שנבדק והוערך עבור EV ושפע סלולרי של miRNAs לפי עניין.</td></tr><tr>גילוי <td>Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)</td><td>גילוי אופק</td><td>CP-004500-01-05</td><td>miRNAs שנקבעו מראש להישמר על ידי קו התאים המעניין ולא מיוצאים באופן סלקטיבי לתוך EVs EVs EV-miRNA</td></tr><tr><td>(Fluorophore conjugated miRNAs)</td> <td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>miRNAs שנקבעו מראש למיון סלקטיבי ל-EVs&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>N/A N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM סרום מופחת בינוני</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>31-985-070</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 1x PBS (לתרבית תאים)</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAimax</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-778-150</td><td></td></tr><tr><td>miRCURY LNA Reverse Transcriptase</td><td>Qiagen</td><td>339340</td><td></td></tr><tr><td>miRCURY LNA SYBR Green PCR</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>339347</tr><tr><td>mirVana RNA בידוד</td><td>Qiagen</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>4387936</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד, 4% ב-PBS</td><td>פישר</td><td>AAJ61899AK</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ריאגנט לא סטרילי</td><td>VWR</td><td>89094-684</td><td></td></tr><tr><td>Thermo ABI QuantiStudio DX בזמן אמת PCR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין 0.25%</td><td>פישר&nbsp;</td><td></td><td></td>SH3004201</tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

מעקב אחר שחרור mirna לתוך שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות ציטומטריית זרימה

Tracking miRNA Release into Extracellular Vesicles using Flow Cytometry

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מתווכות חשובות של תקשורת תאית המופרשות על-ידי מגוון תאים שונים. כלי רכב חשמליים אלה מעבירים מולקולות ביו-אקטיביות, כולל חלבונים, שומנים וחומצות גרעין (דנ"א, mRNAs, מיקרו-רנ"א ורנ"א לא מקודד אחר), מתא אחד למשנהו, מה שמוביל לתוצאות פנוטיפיות בתאים המקבלים. מכל מטעני הרכב החשמליים השונים, מיקרו-רנ"א (miRNAs) זכו לתשומת לב רבה בשל תפקידם בעיצוב המיקרו-סביבה ובחינוך התאים המקבלים בשל חוסר הוויסות הברור שלהם והשפע שלהם ברכב חשמלי. נתונים נוספים מצביעים על כך שהרבה miRNA נטענים באופן פעיל לתוך כלי רכב חשמליים. למרות ראיות ברורות אלה, המחקר על הדינמיקה של הייצוא ומנגנוני מיון miRNA מוגבל. כאן, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה של EV-miRNA שניתן להשתמש בו כדי להבין את הדינמיקה של טעינת EV-miRNA ולזהות את המכונות המעורבות בייצוא miRNA. בפרוטוקול זה, miRNA שנקבע מראש כי הוא מועשר ברכבים חשמליים ומדולדל מתאי התורם מצומד לפלואורופור ומוזרם לתאי התורם. לאחר מכן, ה-miRNA המתויגים באופן פלואורסצנטי מאומתים לטעינה לרכבים חשמליים ולהתרוקנות מתאים באמצעות qRT-PCR. הן כבקרת טרנספקציה והן ככלי לנטרול אוכלוסיית התאים הנגועים, נכלל רנ"א תאי עם תווית פלואורסצנטית (תאים שמורים ומרוקנים מ-EV). תאים הנגועים הן ב-EV-miRNA והן ב-miRNA שנשמר בתאים מוערכים לאותות פלואורסצנטיים במהלך 72 שעות. עוצמת האות הפלואורסצנטי הספציפית ל-EV-miRNA פוחתת במהירות בהשוואה ל-miRNA השמור בתאים. באמצעות פרוטוקול פשוט זה, ניתן כעת להעריך את הדינמיקה של טעינת miRNA ולזהות גורמים שונים האחראים לטעינת miRNA לתוך כלי רכב חשמליים.

כאן, אנו משתמשים בציטומטריית זרימה ככלי רב עוצמה לחקר שחרור miRNA מהתאים לרכבים חשמליים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתוח ציטומטריית זרימה של תאים הנגועים ב-cell-miRNA וב-EV-miRNA גילה ירידה רציפה של אות פלואורסצנטי המתאים ל-EV-miRNA, בעוד שהאות המתאים ל-miRNA התא נשמר בתאים. כדי להבטיח שהצמידות של הפלואורופורים לא תפריע לשחרור miRNA לרכבים חשמליים, miR-451a הוצמד לשני פלואורופורים נפרדים (כלומר, Alexa fluor 488 ו-Alexa fluor 750), ושימור התאים הוערך. התוצאות מצביעות על שונות מינימלית בין זיהוי אותות פלואורופור נפרדים לאחר טרנ...

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט המאפשר הערכה חוץ גופית של שפע המיקרו-רנ"א המסומן באופן פלואורסצנטי כדי לחקור את הדינמיקה של אריזות מיקרו-רנ"א ולייצא לשלפוחיות חוץ-תאיות (EV).

מעקב אחר שחרור miRNA לתוך שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות ציטומטריית זרימה

Extracellular vesicles (EVs) are important mediators of cellular communication that are secreted by a variety of different cells. These EVs shuttle ...

המעבדה שלי עובדת על חקר מיקרו-רנ"א, ואנחנו יודעים כבר עשרות שנים שמיקרו-רנ"א מתרוקן בסרטן. עם זאת, המנגנון לגבי האופן שבו מיקרו-רנ"א אלה הולכים לאיבוד לא הובן באופן פעיל. עבודתנו האחרונה על שלפוחיות חוץ-תאיות מצביעה על כך שמיקרו-רנ"א שהתרוקן בסרטן נטען באופן פעיל לתוך שלפוחיות חוץ-תאיות אלה.המטרה שלנו כעת היא באמת להגיע למנגנון לגבי האופן שבו רנ"א אלה נטענים באופן פעיל לתוך שלפוחיות חוץ-תאיות אלה בתהליך היווצרות הגידול. הפרוטוקול מסייע להבין וללכוד את התהליך הדינמי של שחרור מיקרו-רנ"א לבועיות חוץ-תאיות, שהוא אחד התחומים המאתגרים בחקר ביולוגיה של שלפוחיות חוץ-תאיות. הממצאים שלנו מספקים כלי לקידום המחקר של מסלולים המווסתים דלדול של מיקרו-רנ"א בסרטן.אנו מתכננים לזהות השלכות תפקודיות ופנוטיפיות של אובדן תת-קבוצות ספציפיות של מיקרו-רנ"א באמצעות בועיות חוץ-תאיות בסרטן. ברגע שאנו מזהים את הגורמים המעורבים בהעמסת מיקרו-רנ"א אלה לתוך שלפוחיות חוץ-תאיות, המטרה שלנו היא לווסת את הגורמים האלה כלפי מטה ולהעריך את התוצאה הפנוטיפית. יתר על כן, מכיוון שזיהינו מוטיב שנמצא ברנ"א הקטן הזה, אנחנו סקרנים לדעת אם המוטיב הזה הוא גם הכרחי וגם מספיק כדי לטעון את הרנ"א הזה לתוך השלפוחיות החוץ-תאיות.

tracking-mirna-release-into-extracellular-vesicles-using-flow

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים את הלכידה החיסונית של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות צימודים של ננו-חלקיקים מגנטיים עם תווית פלואורסצנטית. התהליך כולל היווצרות מורכבת, צביעה בנוגדני זיהוי מסומנים פלואורסצנטית, הפרדה מגנטית וניתוח ציטומטרי זרימה לאפיון אנטיגני.

לכידה חיסונית וציטומטריית זרימה של שלפוחיות חוץ-תאיות לאפיון אנטיגני

שיטות שונות רבות קיימות למדידה של שלפוחית ​​תאית (EVS) באמצעות cytometry זרימה (FCM). כמה היבטים יש לשקול בעת קביעת השיטה המתאימה ביותר לשימוש. שני פרוטוקולים לכלי רכב חשמליים מדידה מוצגים, או באמצעות זיהוי אדם או גישה מבוססת חרוז.

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

וירוסים או שלפוחיות חוץ-תאיות נלכדו חיסונית עם ננו-חלקיקים מגנטיים של 15 ננומטר יחד עם נוגדנים המזהים אנטיגנים על פני השטח. הנגיפים או השלפוחיות שנתפסו סומנו בנוגדנים פלואורסצנטיים כנגד אנטיגנים אחרים על פני השטח. הקומפלקסים שהתקבלו הופרדו בשדה מגנטי גבוה ונותחו באמצעות ציטומטרים זרימה קונבנציונליים המופעלים על פלואורסצנטיות.

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

כאן, אנו מתארים את היישום של התאוששות מימדי תלת מימדי לאחר photobleaching (3D-FRAP) לניתוח של צומת הפער התלוי תלוי של מירנה. בניגוד לשיטות מיושמות בדרך כלל, 3D-FRAP מאפשר כימות של העברה בין תאית של RNAs קטנים בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה ספטיו- temporal.

ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את זרימת העבודה מלאה עבור בידוד מהיר של שלפוחית חוץ-תאי של דם אנושי ואפיון של סמני ספציפיים על-ידי ניתוח מעקב nanoparticle מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית. התוצאות שהוצגו להציג רמה גבוהה של הפארמצבטית, ניתן לכוונן תא תרבות supernatants.

אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

הפרוטוקול מתאר שיטה ישימה מיועד לשימוש עם תא תרבות supernatants לאתר epitopes משטח על שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EV). הוא מנצל immunoprecipitation EV ספציפי באמצעות חרוזים בשילוב עם נוגדנים מזהה אנטיגן פני שטח CD9, CD63, CD81. השיטה ממוטבים לניתוח cytometry במורד הזרם.

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

שלל חוץ-תאי (EVs) תורמים לביולוגיה תאית ולתקשורת בין-תאית. יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולתייג ספיגת EVs על ידי התאים. הפרוטוקול הנוכחי מציע את בדיקת ספיגת EV על ידי שימוש בהדמיית פלואורסצנטיות תלת ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל, לאחר בידוד EV על ידי מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון.

ספיגת ארסיה חוץ-תאית באמצעות ניתוח הדמיית מיקרוסקופ קונפוצלי

הדור האחרון של כלי אפיון EV מסוגלים לנתח EV יחיד על פני מספר פרמטרים בו זמנית. ציטומטריה של זרימה ננו מודדת את כל החלקיקים הביולוגיים הגדולים מ-45 ננומטר ללא התוויה ומזהה מאפיינים ספציפיים של תת-אוכלוסיות על ידי מגוון טכניקות תיוג פלואורסצנטיות.

אפיון חלבון טרנס-ממברנה חוץ-תאי יחיד על-ידי ציטומטריה של זרימה ננו

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של מיון שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) המשתחררות על ידי תאי סטרומה מזנכימליים. בפרט, הוא מתמקד בהגדרת המכשיר ובאופטימיזציה של תנאי המיון. המטרה היא למיין שלפוחיות חוץ-תאיות תוך שמירה על המאפיינים שלהן.

הגדרת מיון מוצלח לבידוד שלפוחית חוץ-תאית

כאן, אנו מקימים פרוטוקול המשתמש בכמויות מינימליות של מקטעי רקמת מוח קפואים טריים ושיטת צנטריפוגה נגישה במהירות גבוהה יחד עם כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל כדי להשיג שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות כמקורות לסמנים ביולוגיים של מיקרו-RNA (miRNA) להפרעות נוירולוגיות.

רתימת כוחם של מטעני מיקרו-רנ"א בשלפוחיות חוץ-תאיות קטנות המשתחררות מחלקי מוח אנושיים קפואים טריים 

חקור את מנגנון שחרור microRNA לתוך שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות ציטומטריית זרימה בקווי תאים של Calu-6. פרוטוקול זה מאפשר לעקוב אחרי תהליך האריזה הדינמי ולחקור את דרכי הריקון של microRNA בסרטן.

מעקב אחר שחרור miRNA לתוך שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות ציטומטריית זרימה

גלה סרטונים נוספים