Name: יישום צביעת מיטוכונדריה חיה במיון תאים לטיהור הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: למד שיטת מיון תאים חדשנית לטיהור הפטוציטים מבלי לשנות גנטית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. השיטה משיגה טוהר של 97% ומגבירה את שרידות התאים ליישומים ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה מספר מענק [23390072].

במחקר זה נעשה שימוש בתאי iPS אנושיים שהושגו באופן מסחרי (זן 253G1) (ראו טבלת חומרים).
1. תחזוקה של תאי iPS אנושיים
<ol><li>שמור על תאי iPS אנושיים בתנאים נטולי הזנה בתווך AK02 על צלחות תרבית מצופות 0.25 מיקרוגרם/ס"מ2 iMatrix-511 (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>2. התמיינות בכבד של תאי iPS אנושיים בתרביות דו-ממדיות
הערה: עיין באיור 1A עבור לוח הזמנים היומי של התמיינות הכבד. לאורך כל התהליך השתמשו בצלחות תרבית של 6 בארות והוסיפו 2 מ"ל של מדיום השטיפה או התרבית הייעודי לכל באר. שמור על מצב תרבית התאים ב 100% לחות, 5% CO2, ו 20% O2 ב 37 ° C.
<ol><li>מצפים כל באר של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של מטריצת קרום מרתף (מדולל 1/25 PBS (-)), ודגרים ב 37 ° C במשך 1 שעה.</li>
	<li>מעבר תאי iPS אנושיים לצלחת המצופה בצפיפות של 20,000-30,000 תאים לסמ"ר באמצעות מדיום AK02N בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר (Y-27632) (ראה טבלת חומרים). החליפו את המדיום ללא Y-27632 למחרת ואת התרבית למשך יומיים נוספים.</li>
	<li>לשטוף את התאים פעם אחת עם RPMI-1640 בינוני. התחל התמיינות אנדודרם על ידי החלפת המדיום עם RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% B27 אינסולין + 1% דיפפטיד L-Alanyl-L-גלוטמין) בתוספת 3-6 מיקרומטר CHIR-99021 ו 100 ng / mL Activin A במשך 24 שעות (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>החלף את המדיום עם RPMI-B27-Glu בתוספת 50 ng/mL Activin A למשך 24 שעות.</li>
	<li>כדי לגרום להבדיל אב כבד, להחליף את המדיום עם RPMI-B27-Glu בתוספת 1% dimethyl sulfoxide (DMSO) במשך 5 ימים.</li>
	<li>כדי לקדם את הבשלת הכבד, עבור למדיום הבשלת הפטוציטים: מדיום L-15 של לייבוביץ' המכיל 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-המיסוקצינאט, 8.3% מרק טריפטוז פוספט, 100 ננומטר דקסמתזון (DEX), 50 מיקרוגרם/מ"ל נתרן-L-אסקורבט, 0.58% אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS), 8.3% סרום בקר עוברי (FBS), 2 מילימטר דיפפטיד L-Alanyl-L-גלוטמין, ו-100 ננומטר N-הקסנואית-נסה-איל-איל-(6)-אמינו הקסנואית אמיד (Dihexa) (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>שנה את המדיום כל יומיים במשך 20 יום. מיין את התאים כ -27 ימים לאחר תחילת ההתמיינות.</li>
</ol>3. הכנת תאים לטיהור הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים
<ol><li>לשטוף תאים ממוינים בכבד עם 2 מ"ל PBS (-) לכל באר.</li>
	<li>הוסף תמיסת אנזים 1 מ"ל לכל באר, הכוללת 0.1% collagenase, 0.083% טריפסין, 10 μM מעכב ROCK (Y-27632), 20 ננומטר ciclosporin A ו- 50 μg/mL נתרן-L-אסקורבט במאגר המודעות (116 mM NaCl, 12.5 mM NaH2PO4, 20 mM HEPES, 5.4 mM KCl, 5.6 mM גלוקוז ו- 0.8 mM MgSO4; pH 7.35) (ראה טבלת חומרים). נתק תאים מהלוחות על ידי סיבוב אופקי ב 37 ° C במשך כ 2 שעות.</li>
	<li>לאחר אישור כי התאים מנותקים ומעוגלים תחת מיקרוסקופ, לפזר אותם לתאים בודדים על ידי pipetting עדין, ולאסוף אותם בצינור 50 מ"ל.</li>
	<li>תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 18 ° C כדי pellet אותם. הסר את supernatant באמצעות אספירטור.</li>
	<li>לצבוע את המיטוכונדריה של התאים על ידי פיזורם ב 5 מ"ל של מדיום הבשלת הפטוציטים המכיל 100 ננומטר TMRM (tetramethylrhodamine, אסטר מתל) (ראה טבלת חומרים). יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C תוך הגנה מפני אור על ידי עטיפה ברדיד אלומיניום.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 18 ° C כדי pellet אותם. הסר את supernatant.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים עם 1-5 מ"ל של מאגר מודעות קר המכיל 2% FBS.</li>
	<li>ספור את מספר התא באמצעות תמיסה כחולה טריפאן 0.4% ולוח ספירת תאים.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי pellet אותם. הסר את supernatant.</li>
	<li>לדלל נוגדן anti-ALCAM (נוגדן ראשוני, ראה טבלת חומרים) ביחס של 1:50 במאגר מודעות, ולהוסיף 100 μL של הנוגדן המדולל לכל 106 תאים. מכתימים את התאים למשך 50 דקות על קרח. הכינו תאים שאינם מוכתמים בנוגדן הראשוני כבקרה שלילית.</li>
	<li>שטפו את התאים עם מאגר מודעות קר המכיל 2% FBS פעמיים.</li>
	<li>יש לדלל חמור מסוג Alexa Fluor 488 Anti-Goat IgG (נוגדן משני, ראה טבלת חומרים) ביחס של 1:100 במאגר מודעות, ולהוסיף 100 μL של הנוגדן המדולל לכל 106 תאים. מכתימים את התאים למשך 30 דקות על קרח. תאי צביעה שלא הוכתמו בנוגדן הראשוני באמצעות הנוגדן המשני.</li>
	<li>שטפו את התאים עם מאגר מודעות קר המכיל 2% FBS פעמיים.</li>
	<li>השעה מחדש את התאים במאגר המודעות וסנן אותם דרך מסננת תאי מכסה הצמדה (רשת שינוי של 35 מיקרומטר) ממש לפני מיון לפי FACS כדי להסיר גושי תאים גדולים ולכלוך.</li>
</ol>4. ניתוח FACS ומיון של תאי iPS אנושיים שמקורם בהפטוציטים
<ol><li>הגדר את התקן FACS למיון תאים בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). הערה: השתמש בגודל זרבובית של 85 מיקרומטר או 100 מיקרומטר ובמסנן ND של 2.0 עבור הפטוציטים. השתמש בערוץ FITC לזיהוי קמח אלקסה 488 עבור ALCAM ובערוץ PE לזיהוי פלואורסצנטיות TMRM עבור מיטוכונדריה.</li>
	<li>כוונן את מתחי FSC (פיזור קדימה) ו- SSC (פיזור צד) כדי להמחיש כראוי את אוכלוסיית התא.</li>
	<li>התאם את המתחים של התעלות הפלואורסצנטיות FITC ו- PE. התחל עם תאים ללא תווית ומרכז את אוכלוסיית התאים בתחתית כל תרשים ערוץ. ודא שהתאים המסומנים מסומנים ממוקמים כראוי בתוך התווייה.</li>
	<li>השתמש באסטרטגיית gating נפוצה כדי למנוע כפילויות: שער FSC-A העיקרי לעומת אוכלוסיית SSC-A (איור 2A), ואחריה אוכלוסיית FSC-H לעומת -W, ולאחר מכן SSC-H לעומת . -W (איור 2B,C).</li>
	<li>שער את אוכלוסיית TMRMhi ו-ALCAM+ (P2 באיור 2E) כדי למיין הפטוציטים. שער את אוכלוסיית TMRMhi ו- ALCAM (P1 באיור 2E) כדי למיין שאינם הפטוציטים. לאסוף hepatocytes ממוין non-hepatocytes ב 15 מ"ל צינורות איסוף המכילים hepatocyte התבגרות בינוני.</li>
	<li>צנטריפוגה צינור האיסוף המכיל את התאים ממוינים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 18 ° C.</li>
	<li>הסר את supernatant ו resuspend את התאים במדיום התבגרות hepatocyte.</li>
	<li>זרעו את התאים על פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) שטופלו במיטומיצין C או מטריצת קרום מרתף דמוית ג'ל עם מדיום הבשלת הפטוציטים בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 ו-20 ננומטר ציקלוספורין A. תרבית את התאים באינקובטור CO2 של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.</li>
</ol>5. אימונוציטוכימיה לאיתור הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים
<ol><li>לשטוף את התאים בתרבית במשך 5 ימים לאחר מיון עם PBS (-).</li>
	<li>תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שטפו את התאים עם חיץ TBS-T (1x TBS עם 1% Tween 20) פעמיים כדי להסיר את הפרפורמלדהיד.</li>
	<li>יש לדגור על התאים עם חיץ TBS-T מדולל של 0.1% Triton X-100 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שטפו את התאים עם חיץ TBS-T פעמיים כדי להסיר את Triton X-100.</li>
	<li>הוסף פתרון חסימה זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) לתאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הוסף נוגדנים ראשוניים נגד אלבומין (סמן הפטוציטים) ואנטיגן גרעיני אנושי (hNA, ראה טבלת חומרים), מדולל 1:50 בתמיסת חסימה.</li>
	<li>לדגור על התאים ב 4 ° C במשך הלילה. שטפו את התאים עם מאגר TBS-T פעמיים.</li>
	<li>הוסף נוגדנים משניים: Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב IgG ו- Alexa Fluor 546 חמור נגד עכבר IgG, מדולל 1:100 בתמיסת חסימה (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>דוגרים על התאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו את התאים עם מאגר TBS-T פעמיים.</li>
	<li>הערך את טוהר הכבד על ידי ספירת תאים חיוביים לאלבומין ו- hNA חיוביים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חשב את אחוז התאים החיוביים לאלבומין לכל תא חיובי ל-hNA עבור אוכלוסיות P1 ו-P2.</li>
</ol>

טיהור הפטוציטים שמקורם ב-iPSC בבני אדם על ידי מיון מיטוכונדריאלי-ALCAM

<ol><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+pluripotent+stem+cells+correlates+to+the+level+of+CHD7%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7.</a> Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).</li>
<li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3%CE%B2+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li>
<li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+serendipity+and+reproducibility%3A+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li>
<li>Chen, C. X. -Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quality+control+workflow+to+evaluate+the+reproducibility+and+differentiation+potential+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+originating+from+induced+pluripotent+stem+cells+and+methods+for+their+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).</li>
<li>Nori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+issues+of+iPSC-based+cell+therapy+in+a+spinal+cord+injury+model%3A+oncogenic+transformation+with+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).</li>
<li>Hentze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Hidaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber-specific+differentiation+of+Nkx2.5-positive+cardiac+precursor+cells+from+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells.</a> The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).</li>
<li>Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+induces+differentiation+of+ANP-EGFP+expressing+embryonic+stem+cells+towards+a+pacemaker+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype.</a> The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).</li>
<li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li>
<li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+high-functioning+human+iPS+cell-derived+hepatocyte-like+cells+for+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research.</a> Biomaterials. 161, 24-32 (2018).</li>
<li>Hattori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature methods. 7, 61-66 (2009).</li>
<li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22JMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+mitochondrial+activity+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis.</a> Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).</li>
<li>Swart, G. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule+%28CD166%2FALCAM%29%3A+Developmental+and+mechanistic+aspects+of+cell+clustering+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration.</a> European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1475-1481 (2016).</li>
<li>Kamiya, A., Inagaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell+systems+in+liver+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration.</a> Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).</li>
<li>Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+vitro+expansion+system+for+generation+of+human+ips+cell-derived+hepatic+progenitor-like+cells+exhibiting+a+bipotent+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential.</a> PLOS One. 8 (7), e67541(2013).</li>
<li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+a+surface+marker+for+early+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes.</a> Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בשל תפקודם במטבוליזם של חומרי מזון וניקוי רעלים, לפטוציטים יש מספר גדול יחסית של מיטוכונדריה בהשוואה לסוגי תאים אחרים15. ALCAM הוא חבר במשפחת האימונוגלובולינים וממלא תפקיד בהידבקות תאים ובנדידה. הוא מתבטא בסוגי תאים שונים, כולל כבד, אפיתל, לימפוציטים, מיאלואידים, פיברובלסטים ותאי עצב16. על ידי שימוש בשילוב של השיטה המבוססת על מיטוכונדריה ונוגדן ALCAM, זוהו בהצלחה הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים.
בעוד שהבדיקות לאפיון תפקוד ההפרשה או פעילות האנזי...

תאי גזע עובריים ופלוריפוטנטיים מושרים (ES ו- iPS, בהתאמה) נחשבים למקורות תאים מבטיחים לטיפולים רגנרטיביים. עם זאת, היעילות של התמיינות תאים אלה לסוגי תאי יעד ספציפיים יכולה להשתנות, גם כאשר משתמשים באותו קו תאים, פרוטוקול ונסיין 1,2,3,4. ניתן לייחס שונות זו לרגישות הגבוהה של תאי ES/iPS אנושיים לסביבתם. לכן, כיום קשה להשיג באופן עקבי תאי מטרה טהורים. כדי להשיג רפואה רגנרטיבית בטוחה ביותר, חיוני לחסל תאים מתרבים ותאי גזע לא ממוינים בתאים טיפוליים, וטכנולוגיית טיהור מתקדמת לתאי מטרה חיונית 5,6,7.
ממיין תאים הוא מכשיר המנתח באופן מיידי תאים בודדים וממיין תאים חיים בעלי עניין בהתבסס על עוצמות האות הפלואורסצנטי, ומציע פתרון מבטיח. ניתן להשיג זאת באמצעות צביעת נוגדנים של סמנים ספציפיים לסוג התא או על ידי שימוש בביטויי גנים ספציפיים לסוג התא. באמצעות טכניקה זו, ישנם מספר דיווחים על שיטות לטיהור קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים 8,9,10 והפטוציטים11,12. Hattori et al. פיתחו שיטת טיהור מיטוכונדריאלית חדשנית באמצעות ממיין תאים13. תוך ניצול העובדה שלקרדיומיוציטים יש דרישות אנרגיה גבוהות באמצעות פעילות מיטוכונדריאלית, ניתן להשתמש בצביעת התאים בצבע המיטוכונדריה החי TMRM (טטרמתילרודאמין מתיל אסטר) כדי לתייג ולטהר מאוד קרדיומיוציטים על ידי FACS מגופי עוברים אנושיים שמקורם בתאי ES המכילים סוגי תאים שונים. היעדר הגידול אושר על ידי בדיקות היווצרות טרטומה עם קרדיומיוציטים מטוהרים. יתר על כן, ימאשיטה ועמיתיו גילו באופן בלתי צפוי שיטה לטיהור הפטוציטים מגופי עובר אנושיים שמקורם בתאי ES על ידי בידוד שברים בעלי פעילות מיטוכונדריאלית גבוהה וביטוי חיובי ALCAM14. הרציונל לשיטה זו הוא שלהפטוציטים יש גם מספר גבוה יחסית של מיטוכונדריה בשל הצריכה הגבוהה של ATP למטבוליזם תזונתי וניקוי רעלים15, והפטוציטים מבטאים ALCAM, חבר במשפחת האימונוגלובולינים, הממלא תפקיד בהידבקות תאים ונדידת16.
שיטות טיהור גבוהות קודמות עבור הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים דרשו שינויים גנטיים, ושיטות טיהור לא גנטיות היו בעלות יעילות נמוכה17. השיטה המיטוכונדריאלית הלא גנטית היא בעלת ערך להשגת טוהר גבוה. כאשר יש צורך בתאי אב בכבד, ניתן לבחור בשיטות מבוססות CD133 ו- CD13 או Dlk118,19. למרות שהדיוק של טכנולוגיית עריכת הגנום התקדם, לא ניתן לבטל לחלוטין את הסיכון הפוטנציאלי לשינויים גנומיים בלתי צפויים (למשל, קרצינוגנזה). שיטות המבוססות על פעילות מיטוכונדריאלית, ללא שינוי גנטי, יכולות להיות חופשיות מסיכונים כאלה.
כתוצאה מבדיקת אינדיקטורים מיטוכונדריאליים שונים בקרדיומיוציטים של חולדות יילודים, TMRM נצפה נעלם לחלוטין תוך 24 שעות, בעוד שצבעים אחרים נשארו לפחות 5 ימים13. יתר על כן, חשוב לציין כי TMRM ו- JC-1 לא השפיעו על כדאיות התא כאשר הוערכו עם בדיקת 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), בעוד שצבעים אחרים הדגימו השפעות שונות על כדאיות התא13. TMRM מדגים בטיחות גבוהה יותר.
עד כה, פותחו מספר שיטות התמיינות דו-ממדיות (דו-ממדיות) כגישות יעילות יותר לגרימת התמיינות בהשוואה ליצירת גוף עוברי תלת-ממדי (תלת-ממדי). הסיבה לכך היא שתרכובות או ציטוקינים הגורמים להתמיינות באופן הדרגתי יכולים להינתן באופן אחיד לתאים במישור דו-ממדי, ולא במרחב תלת-ממדי. במחקר זה, שיטה20 שדווחה בעבר שונתה כדי לגרום להתמיינות לתאי iPS אנושיים. כאן מתוארים פרטי ההליכים להתמיינות וטיהור דו-ממדיים עדכניים של הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים.

<table><tbody><tr><td>קו תאי iPS אנושי 253G1</td><td>מרכז המחקר RIKEN BioResource HPS0002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A Solution, אנושי, רקומביננטי</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>18585</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד גרעינים, שיבוט 235-1</td><td>Chemicon</td><td>MAB1281</td><td>נוגדן נגד אנטיגן גרעיני אנושי</td></tr><tr><td>B-27 תוסף (50x), ללא סרום</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td>ממיין תאים</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ciclosporin A</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>035-18961</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>034-22363</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>מטריצת קרום מרתף דמוית ג'ל</td></tr><tr><td>CultureSure Y-27632</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>036-24023</td><td>מעכב ROCK</td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-18863</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-29353</td><td></td></tr><tr><td>חמור נוגדן משני נגד עזים IgG (H+L) נספג צולב, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 מ"ל מבחנה מבחנה מפוליסטירן תחתון עגול, עם מסננת תאים Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>סרום</td> <td>בקר עובריBiowest</td><td>51820-500</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>35050061</td><td>דיפפטיד L-Alanyl-L-גלוטמין</td></tr><tr><td>אנושי/עכבר/חולדה/כלב/CD166 נוגדן</td><td>R& D Systems</td><td>AF1172</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון 21-המיסוקסינט מלח נתרן</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>H2270</td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 משי</td><td>Nippi</td><td>892021</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoBlock</td><td>KAC</td><td>תמיסת חסימת</td><td></td></tr><tr><td>CTKN001 תוסף ITS-G (וזמנים; 100)</td> <td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>090-06741</td><td></td></tr><tr><td>L-15 בינוני של לייבוביץ</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>128-06075</td><td></td></tr><tr><td>N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-אמיד הקסאנואי (Dihexa)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>H293745</td><td></td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי אנושי אלבומין</td><td>Dako</td><td>A0001</td><td></td></tr><tr><td>פוליאוקסיאתילן סורביטן מונולאורט (Tween 20)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28353-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>נתרן L-אסקורבט</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>03422-32</td><td></td></tr><tr><td>StemFit AK02N</td><td>REPROCELL</td><td>RCAK02N</td><td></td></tr><tr><td>TBS (10x)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>12748-31</td><td></td></tr><tr><td>טטרמתילרודמין, מתיל אסטר (TMRM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28229-25</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>20577-34</td><td></td></tr><tr><td>TRYPSIN 250</td><td>Difco</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מרק טריפטוז פוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8159</td><td></td></tr></tbody></table>

יישום צביעת מיטוכונדריה חיה במיון תאים לטיהור הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

לתאי גזע עובריים אנושיים (ES) ולתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS) יש יישומים פוטנציאליים ברפואה רגנרטיבית מבוססת תאים לטיפול באיברים חולים קשה בשל ההתרבות הבלתי מוגבלת שלהם ותכונותיהם הפלוריפוטנטיות. עם זאת, התמיינות תאי ES/iPS אנושיים לסוגי תאי מטרה טהורים ב-100% היא מאתגרת בשל רגישותם הגבוהה לסביבה. גידולים לאחר ההשתלה נגרמים על ידי תאים מזוהמים, מתרבים ובלתי ממוינים, מה שהופך את טכנולוגיית הטיהור הגבוהה לחיונית למימוש בטוח של רפואה רגנרטיבית. כדי להפחית את הסיכון לגידולים, פותחה טכנולוגיית טיהור גבוהה עבור הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים. השיטה משתמשת ב-FACS (מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות) באמצעות שילוב של תכולת מיטוכונדריה גבוהה וסמן פני התא ALCAM (מולקולת היצמדות תאי לויקוציטים פעילים) ללא שינוי גנטי. 97% ± 0.38% (n = 5) מהפטוציטים המטוהרים בשיטה זו הציגו ביטוי חלבון אלבומין. מאמר זה נועד לספק נהלים מפורטים עבור שיטה זו, כפי שהיא מיושמת בשיטת ההתמיינות הדו-ממדית העדכנית ביותר עבור תאי iPS אנושיים להפטוציטים.

ציר הזמן של התהליכים שגורמים לתאי iPS אנושיים להתמיין להפטוציטים באמצעות תרבית דו-ממדית (איור 1A) ותכונות תאים מייצגות (איור 1B) מוצגים. בערך ביום ההתמיינות ה-12 החלו התאים להציג צורות תאים מצולעים וגרעינים עגולים, האופייניים להפטוציטים. חלק מהפטוציטים הציגו גם ריבוי גרעינים.
ניתוח FACS בוצע באמצעות התאים ביום ההתמיינות 27. כדי לזהות את אוכלוסיית ALCAM+, תרשימים השוואתיים עם ובלי נוגדן האנטי-ALCAM הראשון מוצגים <strong clas...

ניתן לטהר הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות מיון תאים, באמצעות שילוב של צביעת מולקולת הידבקות תאי לויקוציטים מיטוכונדריאלית ופעילה (ALCAM, הידועה גם בשם CD166).

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...

היקף המחקר שלנו הוא לטהר הפטוציטים המושרים על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, תוך שימוש ללא שינוי גנטי. אנו שואפים לטפל בסוגיית הסיכון הגידולי הקשור לתאים הבלתי ממוינים, בקרב אלה שהתמיינו מתאי iPS אנושיים. אחד האתגרים הניסיוניים הנוכחיים הוא טוהר תאים נמוך, בשל האחסון המכני של המיון.אנו מפתחים שיטת טיהור חדשה, המנצלת את תכונות חילוף החומרים הייחודיות של הפטוציטים, לטיהור בקנה מידה גדול. שיטת מיון אחת שאינה תאית עבור תאי אב בכבד אינה יכולה להשיג הפטוציטים טהורים. עוד אחד עבור hepatocytes בוגר יכול לטפל רק חלק קטן של hepatocytes, בגלל ביטוי מוגבל של חלבון הסמן.לעומת זאת, הגישה שלנו יכולה להשיג הפטוציטים ברמות הבשלה שונות עם ערב גבוה יותר. הפטוציטים שמקורם בתאי iPS אנושיים הם מאוד לא בשלים, ומראים ביטוי מאקרו מופחת יותר של הפטוציטים לאחר טיהור. המטרה העתידית שלנו היא לשפר את אפנון הפטוציטים באמצעות טכנולוגיה אורגנואידית והתקדמות יומיומית לרפואה רגנרטיבית וגילוי תרופות.

application-live-mitochondria-staining-cell-sorting-to-purify

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מחקר זה מדגים את התכנות מחדש של תאים סומטיים לקראת פלוריפוטנטיות in vivo ללא יצירת טרטומות. השתמשנו בהזרקת וריד זנב הידרודינמית של DNA פלסמיד המקודד את גורמי Yamanka כדי לגרום לתכנות מחדש in vivo של הפטוציטים בוגרים לתאים בעלי פלוריפוטנטיות מוגברת.

בתכנות מחדש vivo של תאים סומטיים למבוגרים לpluripotency ידי ביטוי יתר של גורמי יאמאנאקה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול חזק לגזירת קרדיומיוציטים אנושיים המשלב התמיינות לבבית מווסתת מולקולות קטנות וטיהור קרדיומיוציטים בתיווך חסך גלוקוז, המאפשר ייצור של קרדיומיוציטים מטוהרים למטרות מודלים של מחלות לב וכלי דם וסינון תרופות.

גזירה של שריר לב נקי במיוחד מתאי גזע האנושי המושרה pluripotent באמצעות בידול מאופנן מולקולה קטן ולאחר גלוקוז רעב

מתוארת טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאי כבד לא פרנכימליים מאותו תורם. סוגי תאי הכבד השונים בונים את הבסיס למודלים תפקודיים של כבד והנדסת רקמות. שיטה חדשה זו שואפת לבודד תאי כבד בתפוקה גבוהה ובכדאיות.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג הכדאיות גבוהה, תשואה גבוהה של hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal של הכבד. זו מושגת על ידי פרפוזיה הכבד עם פתרון collagenase IV סוג דרך וריד שער הכבד, ואחריו דיפרנציאלית צנטריפוגה כדי להשיג hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal.

טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

פרוטוקול המובאת כאן מתאר פלטפורמה לזיהוי מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד. תיאור שלב אחר שלב מוצגת המפרט איך להבדיל iPSCs לתוך תאים בעלי מאפיינים hepatocyte ב 96-ובכן צלחות, כדי להשתמש בתאים על המסך עבור מולקולות קטנות עם פוטנציאל פעילות טיפולית.

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

פרוטוקול זה מתאר גישה אוטומטית למחצה כדי לייצר hepatocyte כמו תאים מתאי גזע pluripotent אנושי בתבנית 96 צלחת טוב. תהליך זה הוא מהירה וחסכונית, המאפשר שהייצור של איכות מובטחת אצוות של תאים hepatocyte דמוי למחקר אנושי בסיסי ויישומי.

יצור אוטומטי למחצה של Hepatocyte כמו תאים מתאי גזע Pluripotent

פרוטוקול זה מפרט מונאולייר, שיטה נטולת סרום להפקת ביעילות תאים של hepatocyte מתאי גזע בעלי עוצמה מרבית (hPSCs) בתוך 18 ימים. זה כרוך שישה שלבים כמו hPSCs ברציפות להבדיל לתוך תא ביניים-סוגים כגון הרצף הפרימיטיבי, אנדופעיים מוחלט, האחורי הקדמי ואת ניצן הכבד ושלתי לפני היווצרות תאים hepatocyte כמו.

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידול של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לתאים דמויי הפטוציטים תפקודיים (HLCs) על ידי השלמת Activin A ו- CHIR99021 באופן רציף במהלך בידול hESC לאנדודרם סופי (DE).

שיטה יעילה לאינדוקציה מכוונת של תאים דמויי הפטוציטים מתאי גזע עובריים אנושיים

מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ"א מיטוכונדריאלי.

ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

למד שיטת מיון תאים חדשנית לטיהור הפטוציטים מבלי לשנות גנטית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. השיטה משיגה טוהר של 97% ומגבירה את שרידות התאים ליישומים ברפואה רגנרטיבית.

יישום צביעת מיטוכונדריה חיה במיון תאים לטיהור הפטוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

גלה סרטונים נוספים