Name: ציטומטריית זרימה של הדמיה לחקר צבירה עצמית מיקרוביאלית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: חקור צבירה עצמית מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימה של הדמיה בחקר Lactobacillaceae. השיטה מאפשרת ניתוח רב-עוצמה של תגובת החיידקים לפחמימות תזונתיות ומאפשרת הבנה מעמיקה של דינמיקה מיקרוביאלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (מענק 119/16) ומענק IMoh (3-15656) ל-IKG. ר.ש. נתמך על ידי מלגת קרייטמן.

קובץ ה- .ast, עם התבנית עבור Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) כדוגמה, מסופק בקובץ קידוד משלים 1.
1. הכנת מדיה
<ol><li>הכינו ציר Lactobacilli MRS בהתאם להוראות היצרן (55 גרם ב-1 ליטר מים נטולי יונים) וצלחות אגר Lactobacilli MRS עם אגר 1.5% (w/v) אגר (ראו טבלת חומרים). לאחר עיקור autoclave, המדיום מוכן לשימוש ישירות או ניתן לאחסן ב 4 °C.</li>
	<li>הכינו 50% (15 גרם ב-1 ליטר מים נטולי יונים) ציר סויה טריפטי (TSB) (ראו טבלת חומרים), TSB בתוספת 1% (w/v) D-(+)-גלוקוז ו-1% (w/v) D-(+)-raffinose, ואז אוטוקלאבה כדי לעקר את המדיום. עדיף לאחסן אותו ב 4 °C כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>עבור מדיום חוצץ עם גלוקוז, להכין TSB בתוספת 1% (w/v) D-(+)-גלוקוז, 5 mM של אשלגן פוספט monobasic יחד עם אשלגן dibasic, ו 100 mM MOPS (3-(N-morpholino) פרופאן חומצה סולפונית, ראה טבלה של חומרים) pH 7. ואז autoclave כדי לעקר את המדיום.</li>
</ol>2. הכנת דגימות
הערה: שלב זה כולל הערכה של צבירה תאית בתגובה לסוכר מותסס או לא מותסס מהתזונה שלנו. ייצוג סכמטי של תהליך הכנת הדגימה מתואר באיור 1.
<ol><li>פזרו את זן Lactobacillaceae מציר גליצרול קפוא (50% גליצרול) על צלחת מרק Lactobacilli MRS (1.5% אגר). הערה: בניסוי לדוגמה שהוצג כאן, נעשה שימוש בזנים פרוביוטיים Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356), Lacticaseibacillus casei (ATCC 393), Lacticaseibacillus casei subsp. paracasei (ATCC BAA-52), Lactiplantibacillus plantarum (ATCC 8014) ו-Lacticaseibacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG). כדי להרחיב מתודולוגיה זו לחברים פרוביוטיים נוספים של phylum firmicutes, Bacillus coagulans (ATCC 10545) נבחר.</li>
	<li>גדל את התאים בן לילה ב 37 ° C בתנאים סטטיים.</li>
	<li>לחסן 5 מ"ל של מרק Lactobacilli MRS עם מושבה אחת ולגדל אותו ב 37 ° C בתנאים סטטיים במשך הלילה.</li>
	<li>לדלל את תרבית התאים מן השלב הקודם (1:100) ב 3 מ"ל של 50% מרק סויה טריפטי (TSB), TSB בתוספת 1% (w / v) D-(+)-גלוקוז, או TSB בתוספת 1% (w / v) D-(+)-raffinose.</li>
	<li>יש לדגור למשך הלילה ב-37°C בתנאים סטטיים.</li>
	<li>הכינו את הדגימה על ידי ערבוב התאים באופן אחיד בתווך, וערברו בעדינות את צינור תרבית התאים משלב 2.5. הופכים בעדינות את המבחנה עד לערבוב מלא. מעבירים 200-300 μL לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הערה: חיוני לא לסניק את הדגימה כדי למנוע שבירת האגרגטים. במהלך איסוף הנתונים משלבים 3.4 עד 3.10, ייתכנו מקרים שבהם הדגימות מרוכזות מדי. אם נצפה כי הדגימה פועלת לאט מאוד או לא פועלת כלל, ניתן לדלל את הדגימה עם המדיום הטרי המתאים.</li>
</ol>3. רכישת נתונים
<ol><li>הגדר את ציטומטר זרימת ההדמיה בהתאם להוראות שסופקו על-ידי היצרן (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הגדר את הלייזר של 785 ננומטר ל- 5 mW למדידת שדה כהה (שווה ערך לפיזור צד בציטומטריית זרימה קונבנציונלית, מקוצר כ- SSC). השתמש בעדשת 60x עם מפתח צמצם מספרי (N.A) של 0.9, בחר רגישות גבוהה והגדר את המהירות לנמוכה.</li>
	<li>לפני איסוף נתונים כלשהם, ודא את יציבות זרימת חרוזי הכיול בערוץ SSC. לחץ על כפתור ההפעלה בתיבה "fluidics" ובחן את איכות תמונות החרוזים. תמונות החרוזים צריכות להיראות חדות וחדות.</li>
	<li>לחץ על כפתור הטעינה והנח צינור עם דגימה (משלב 2.6) לתוך המחזיק.</li>
	<li>צור תרשים פיזור חדש בתיבה "סביבת עבודה". לחצו על New scatterplot ובחרו באזור בערוץ הבהיר המתאים לעוצמת ערוץ SSC. אל תכלול את חרוזי הכיול הפועלים במכשיר יחד עם הדגימה. הערה: ניתן להחריג חרוזים על ידי טעינת דגימה עם מאגר בלבד וזיהוי החרוזים באזור לעומת . עלילת SSC. לאחר מכן צייר שער סביב אוכלוסיית החרוזים באמצעות הלחצן צור אזור מצולע .</li>
	<li>בתיבה "הגדרות רכישה", הזן את שם המדגם, ציין את המיקום עבור אחסון הנתונים, בחר את האוכלוסייה (כל התאים ללא חרוזים) להקלטה והגדר את מספר האירועים שייאספו. בדרך כלל, 10,000-20,000 אירועים מספיקים.</li>
	<li>לחץ על כפתור הקלט הממוקם בתיבה "רכישה", ותהליך הרכישה יסתיים אוטומטית ברגע שתגיע למספר האירועים שצוין.</li>
	<li>לחץ על הלחצן Return כדי לפרוק את הצינור, והסר את הצינור מהמחזיק כאשר תתבקש לעשות זאת בחלון קטן.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.5-3.9 עבור כל דגימה.</li>
	<li>שמור את התבנית כדי לשמור על אחידות רכישת הנתונים עבור החזרות הבאות.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>למדוד את אחוז (%) הצבירה האוטומטית מהאוכלוסייה.<ol><li>נתח את הנתונים המתקבלים בציטומטר זרימת ההדמיה באמצעות תוכנת IDEAS (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>צור קובץ ניתוח נתונים ( .daf) מהקובץ הגולמי ( .rif) על-ידי טעינת הקובץ ( .rif) בתוכנת הניתוח. לחץ על קובץ כפתור ופתח את הקובץ הנדרש ( .rif). בחלון הפתוח, לחץ על ניתוח רכישת שימוש ולאחר מכן לחץ על אישור.</li>
		<li>צור היסטוגרמה של RMS הדרגתי (מדידת ניגודיות תמונה ומיקוד) בערוץ שדה בהיר כדי לזהות אירועים ממוקדים. באזור הניתוח, לחץ על הלחצן היסטוגרמה חדשה . בחלון "היסטוגרמה חדשה", בחר את האוכלוסייה מהרכישה כדי לנתח, ובתכונה "ציר x", בחר RMS הדרגתי של ערוץ brightfield.<ol><li>מקמו שער בלחיצה על הלחצן 'צור אזור קו ' באזור הניתוח כדי לא לכלול אירועים לא ממוקדים (איור 2A). הערה: בדרך כלל, אזור הקו "ממוקד" צריך לכלול 80%-90% מהאירועים עם ציון RMS בעל השיפוע הגבוה ביותר, אך יש לקבוע ערכי סף ספציפיים עבור תאים "ממוקדים" עבור כל מערך ניסוי.</li>
		</ol></li>
		<li>צור תרשים פיזור של השטח (מיקרומטר2) לעומת יחס הרוחב-גובה (רוחב חלקי אורך האליפסה המתאימה ביותר) של ערוץ שדה בהיר. לחץ על הלחצן New Scatterplot באזור הניתוח. בחלון "New Scatterplot", בחר את האוכלוסייה הממוקדת משלב 4.1.3.<ol><li>בחרו 'אזור בערוץ brightfield' לתכונה 'ציר x' ו'יחס גובה-רוחב ' של ערוץ brightfield לתכונה 'ציר y'. תרשים פיזור זה מאפשר לאוכלוסייה הממוקדת להבחין בין סינגלים ואירועי צבירה קטנים לבין אגרגטים ושרשראות מיקרוביאליות גדולות יותר.</li>
		</ol></li>
		<li>בתרשים פיזור זה, ציירו שער באמצעות הלחצן 'צור אזור מלבן ' (או 'צור אזור מצולע') בהתבסס על ערך השטח עבור אוכלוסיית אירועי הצבירה, ושער נוסף עבור אוכלוסיית הסינגלטים והצברים הקטנים (איור 2B). הערה: ברקעים מסוימים, הפרדת אגרגטים קטנים מסינגלים עשויה להיות מאתגרת, כך שניתן לשלב אותם באותו שער. הדבר נכון גם לגבי אגרגטים ושרשראות גדולים יותר (איור 3).</li>
		<li>סקור והערך באופן ידני תמונות של אירועים בתוך כל שער כדי לאמת את אמינות אסטרטגיית הגאט. במידת הצורך, התאם את ערך האזור לשער. בצע זאת על ידי בחירת האוכלוסייה הנסקרת מהתפריט הנפתח "אוכלוסיות". הערה: לגאטינג אין ערך שטח ספציפי, מכיוון שהוא יכול להשתנות בהתאם למאפייני החיידקים המנותחים.</li>
		<li>שמור את ניתוח הנתונים כתבנית. לחץ על הכרטיסיה קובץ , בחר שמור בשם Template.ast ופתח את הקובץ הבא לדוגמה ( .rif) תחת אותה תבנית כדי ליצור את קובץ ניתוח הנתונים ( .daf) (תמיכה בקובץ .ast כדוגמה עבור LGG).</li>
		<li>צור טבלת סטטיסטיקה כדי למנות אירועי מפתח לניתוח נוסף. לחץ על הכרטיסייה דוחות ולאחר מכן לחץ על הגדר דוח סטטיסטיקה.</li>
		<li>בחלון החדש, לחץ על הוסף עמודות. הוסף את ספירת הסינגלים/צברים ואת הנתונים הסטטיסטיים של % מגודרים. תחת "סטטיסטיקה", בחר %gated/count, ותחת האוכלוסייה שנבחרה, בחר singlets/aggregates. לחץ על הוסף סטטיסטיקה כדי להוסיף את הסטטיסטיקה לרשימה ולשמור אותה כתבנית.</li>
		<li>לחץ על צור דוח סטטיסטי ובחר את תבנית הסטטיסטיקה ואת הקבצים ( .daf) לניתוח.</li>
	</ol></li>
	<li>מדוד את התפלגות הגודל של האגרגטים.<ol><li>כדי לנתח את הגודל הממוצע של אירועי הצבירה, שרטט היסטוגרמה של השטח (מיקרומטר2) של אוכלוסיית אירועי הצבירה משלב 4.1.5 (איור 2C).</li>
		<li>שמור את ניתוח הנתונים כתבנית. לחץ על הכרטיסייה קובץ , בחר שמור כתבנית, ופתח את הקובץ הבא לדוגמה ( .rif) תחת אותה תבנית עבור קובץ ניתוח הנתונים ( .daf).</li>
		<li>חזור על שלבים 4.1.7-4.19. עבור גודל המצרפים, בחר ממוצע תחת סטטיסטיקה ובחר אגרגטים תחת האוכלוסייה שנבחרה. תחת תכונות, בחר אזור של ערוץ brightfield. לחץ על הוסף סטטיסטיקה כדי להוסיף את הסטטיסטיקה לרשימה ולשמור אותה כתבנית.</li>
		<li>חזור על שלב 4.1.9 כדי ליצור דוח סטטיסטי.</li>
	</ol></li>
</ol>

ניתוח כמותי של אוטואגרגציה מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימה של הדמיה

<ol><li>Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+autoaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial autoaggregation.</a> AIMS Microbiology. 4 (1), 140-164 (2018).</li>
<li>Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtaA%2C+a+new+member+of+the+trimeric+autotransporter+adhesins+from+Acinetobacter+sp.+Tol+5+mediating+high+adhesiveness+to+various+abiotic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces.</a> PLoS One. 7, e48830(2012).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+low-molecular-weight+component+protein%2C+Flp%2C+in+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+fimbriae%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae.</a> Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).</li>
<li>Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-regulated+microcolony+formation+by+Burkholderia+pseudomallei+requires+pilA+and+enhances+association+with+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells.</a> Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+differences+in+the+functional+responses+of+Lactobacillaceae+strains+to+fermentable+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 949932(2022).</li>
<li>Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistable+auto-aggregation+phenotype+in+Lactiplantibacillus+plantarum+emerges+after+cultivation+in+in+vitro+colonic+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota.</a> BMC Microbiology. 21, 268(2021).</li>
<li>Kos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+aggregation+ability+of+probiotic+strain+Lactobacillus+acidophilus+M92%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.</a> Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).</li>
<li>Zommiti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+the+probiotic+properties+and+bacteriocinogenic+potential+of+Pediococcus+pentosaceus+MZF16+isolated+from+artisanal+tunisian+meat+%26%2334%3BDried+Ossban%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat &#34;Dried Ossban&#34;.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2607(2018).</li>
<li>Suissa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+rewiring+of+the+probiotic+bacterium+rhamnosus%3C%2Fem%3E+GG+contributes+to+cell-wall+remodeling+and+antimicrobials+production%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+quorum+sensing+in+3D-printed+bacterial+aggregates+using+scanning+electrochemical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).</li>
<li>Misawa, N., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+autoagglutination+activity+by+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).</li>
<li>Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+roles+for+the+AIDA+adhesin+from+diarrheagenic+Escherichia+coli%3A+cell+aggregation+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation.</a> Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry.</a> Nature Reviews Methods Primers. 2, 87(2022).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+characteristics+of+lactic+acid+bacteria+and+the+expanding+applications+in+food+industry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285(2021).</li>
<li>Turroni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dialogue+between+the+human+gut+microbiota+and+the+host%3A+a+Lactobacillus+and+Bifidobacterium+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).</li>
<li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W. Jr, Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageStream+System%3A+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochemica+et+Cytobiologica%22%5BJournal%5D)">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).</li>
<li>Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+for+phytoplankton+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis.</a> Methods. 112, 188-200 (2017).</li>
<li>Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+colonization+of+arabidopsis+thaliana+roots+induces+multiple+biosynthetic+clusters+for+antibiotic+production%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778(2021).</li>
<li>Maan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+reveals+a+dual+role+for+exopolysaccharides+in+biofilms%3A+To+promote+self-adhesion+while+repelling+non-self-community+members%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).</li>
<li>Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+to+study+biofilm-associated+microbial+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates.</a> Molecules. 26 (23), 7096(2021).</li>
<li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178(2016).</li>
</ol>

ציטומטריית זרימה היא שיטה נפוצה לכימות עוצמות פלואורסצנטיות בתאים איקריוטים, אך היא עשויה שלא לספק מדידות מדויקות עבור תאי חיידקים בשל גודלם הגדול יותר או אגרגטים קטנים. גורמים אלה יכולים להשפיע באופן משמעותי על הכימות המדויק של אוטואגרגציה ועל הרמה הבסיסית של היווצרות אגרגטים בתנאים שונים. כדי לטפל בכך, נעשה שימוש בציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) כדי להשיג רזולוציה טובה יותר של האופן שבו פחמימות משפיעות על הצטברות של חיידקים פרוביוטיים5. IFC משלב את המובהקות הסטטיסטית של דגימות גדולות בציטומטריית זר...

צבירה עצמית של חיידקים נחשבת לשלב ראשוני בהיווצרות ביופילם. בתהליך זה (המכונה לעתים גם autoagglutination או flocculation), חיידקים מאותו סוג יוצרים גושים רב-תאיים שבסופו של דבר מתיישבים בתחתית צינורות התרבית או נצמדים לרקמת המטרה או לפני השטח שלהם1.
אוטואגרגציה היא תופעה נפוצה והוכחה עד כה בפתוגנים גראם-שליליים כגון הפתוגן האופורטוניסטי Acinetobacter baumannii2, הפתוגן הדנטלי Aggregobacter actinomycetemcomitans3, והפתוגן המתהווה Burkholderia pseudomallei4. צבירה עצמית תוארה גם במספר זנים פרוביוטיים גראם-חיוביים 5,6,7,8. בלקטובצילוס (L.) אצידופילוס, אוטואגרגציה תווכה חלקית על ידי חלבונים בשכבת S ובקורלציה עם היצמדות לקסילן7. באופן דומה, מצאנו מתאם בין צבירה עצמית תלוית גלוקוז לבין השראת תכונות הדבק (כפי שנמדדו על ידי הידבקות למוצין) של הזנים הפרוביוטיים Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Lacticaseibacillus casei, L. acidophilus, Lacticaseibacillus paracasei ו-Lactiplantibacillus plantarum5. הצבירה העצמית המוגברת שיקפה ככל הנראה שינויים בביטוי של דבקים תאיים בתגובה לגלוקוז ולקטוליטים שלו9. בעוד שהמנגנונים המולקולריים של צבירה עצמית עדיין לא נקבעו, הוכח כי תהליך זה משנה את הפנוטיפ של החיידקים המצטברים ומעניק להם עמידות משופרת לגורמי עקה סביבתיים1, כמו גם רגישות מוגברת למולקולות חישת מניין10.
מספר גישות שימשו למדידת אוטואגרגציה; גישה ניסיונית אחת היא לתת לתרבויות לעמוד באופן סטטי בצינורות תרבות צרים למשך זמן נתון. תרביות בקרה נשארות עכורות, בעוד שתרביות אוטואגרגציה ישקעו בתחתית הצינור. גישה כמותית יותר מודדת צבירה עצמית על ידי שיקוע או שיקוע11.
ציטומטריית זרימה משמשת יותר ויותר בשנים האחרונות לחקר אוטואגרגציה חיידקית. שיטה זו מתאימה לניתוח חלקיקים בגודל של בין 0.5 ל -1000 מיקרומטר בקירוב. החיידק הבודד או האגרגטים שנוצרו מרחפים בנוזל, מוזנים לזרם, וניתן לזהותם בזה אחר זה11. הקלטת אור מפוזר קדימה מאפשרת למדוד את הגודל היחסי של התא או הצבירה. הוא מהיר ופשוט יחסית, אך אינו יכול לזהות מספר פרמטרים, כגון גודל צבירה או מספר התאים הממוצע בצברים. לכן, גישה זו יכולה להיות משלימה מיקרוסקופית, המאפשר פרמטרים נוספים להיבדק12. עם זאת, מיקרוסקופיה מסורתית גוזלת זמן ולכן מגבילה את מספר הדגימות שנבדקו ואת הכוח הסטטיסטי של הניתוח. באופן כללי, ציטומטריית זרימה של הדמיה מספקת מספר תכונות בהשוואה לציטומטריית זרימה מסורתית, כגון ניתוח סימולטני של מורפולוגיה ופנוטיפ של התא, ביצוע ניתוח מבוסס תמונה, איתור אירועים נדירים ואימות נתוני ציטומטריית זרימה13. יתרונות אלה משפרים את היכולות של ציטומטריית זרימה ומאפשרים בחינה מפורטת יותר של אוכלוסיות תאים.
מחקר זה מספק פרוטוקול רב ערך עבור ציטומטריית זרימת הדמיה לניטור אוטואגרגציה בחיידקי חומצה לקטית (LAB). מוטות גראם-חיוביים אלה הם אנארובים פקולטטיביים ושייכים לקבוצת LAB. מתסיסי גלוקוז יעילים אלה מייצרים חומצה לקטית כתוצר הסופי העיקרי של חילוף החומרים של פחמימות14. חיידקים אלה הם חברי ליבה מועילים של המיקרוביום והם נמצאים באופן טבעי במערכת העיכול (GIT) של בני אדם ובעלי חיים, כמו גם במערכת השתן של נקבות15. לכן, האפיון המדויק של תכונות הצבירה העצמית שלהם הוא בעל עניין ביוטכנולוגי וקליני גבוה.
הממצאים הקודמים שלנו הצביעו על כך שהרמה הבסיסית של צבירה עצמית שונה בין זנים פרוביוטיים שונים. הטרוגניות זו מושפעת מהפחמימות השונות המשמשות כמקור פחמן5. כדי להתגבר על תכונה בסיסית זו של חיידקים פרוביוטיים, ההשפעות של פחמימות מהתזונה נוטרו על צבירה אוטומטית ברמת התא היחיד באמצעות IFC. גישה מבוססת IFC זו משלבת את העוצמה והמהירות של ציטומטרים מסורתיים של זרימה עם הרזולוציה של המיקרוסקופ. לכן, הוא מאפשר מדידות מורפומטריות מורכבות בקצב גבוה באופן מוגדר פנוטיפית16,17. גישה זו יכולה להיות מורחבת לחיידקים פרוביוטיים ופתוגניים אחרים, בשילוב עם כתבים פלואורסצנטיים כדי לנטר ביטוי גנים, וזנים מסומנים פלואורסצנטית כדי לפקח על נוכחות ושפע של מיני חיידקים ספציפיים באגרגטים הטרוגניים.

<table><tbody><tr><td>צינורות תרבית 14 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352051</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Baeton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Typtic Soy Broth</td><td>Baeton, Dickinson and Company</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>Difco Lactobacilli MRS מרק</td><td>Baeton, Dickinson and Company</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>EASY-LOCK MICROPR. 1.5 מ"ל (Eppendorf)</td><td>FL רפואי</td><td>23053</td><td></td></tr><tr><td>IDEAS תוכנה</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>&nbsp; פרטים זמינים בכתובת: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1</td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>&nbsp; פרטים זמינים בכתובת: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>MOPS, 3-(N-morpholino) חומצה פרופנסולפונית</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>פישר סיינטיפיק, 174.18 גרם/מול</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא, 136.09 גרם/מול</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

ציטומטריית זרימה של הדמיה לחקר צבירה עצמית מיקרוביאלית

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

חיידקים מועילים ופרוביוטיים ממלאים תפקידים חיוניים בפונדקאים שלהם, ומספקים יתרונות בריאותיים שונים, כולל חסינות למחלות זיהומיות. משפחת Lactobacillaceae מורכבת מחיידקים גראם-חיוביים עם תכונות פרוביוטיות מוכחות. מחקר זה משתמש בזני Lactobacillaceae כמודל להדגמת היעילות של ניתוח תפוקה גבוהה של תא בודד בחקר צבירה תאית. ההתמקדות היא בניתוח התגובה של מינים מועילים אלה לפחמימות פשוטות מהתזונה.
המחקר מראה כיצד ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) יכולה להתגבר על ההבדלים הבסיסיים בהרכבה של חיידקים פרוביוטיים בנוכחות והיעדר פחמימות. IFC משלב את העוצמה והמהירות של ציטומטריית זרימה קונבנציונלית עם הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיה, ומאפשר מדידות מורפומטריות מורכבות בקצב גבוה באופן מוגדר פנוטיפית על פני ספרייה של זנים ותנאים מועילים של חיידקים. פרוטוקול זה מספק תובנות לגבי הצבירה העצמית של מיני Lactobacillaceae ושופך אור על התגובה שלהם לפחמימות תזונתיות, מה שתורם להבנת המנגנונים מאחורי ההשפעות המועילות של חיידקים פרוביוטיים אלה.

התוצאות מראות כי שיטה זו יכולה למדוד בקלות את ההבדלים באוטאגרגציה בתגובה לסוכרים תזונתיים בחיידקי LAB. על ידי הפרדת פרטים מאגרגטים, השיטה מאפשרת לחשב את אחוז האוכלוסייה של אירועי הצבירה מתוך כל האירועים בתגובה לסוכרים מותססים או לא מותססים מהתזונה. בנוסף, ניתן היה למדוד אם יש הבדלים בגודל הממוצע של אוכלוסיית המצרף בין הטיפולים.
התמונות המייצגות באיור 3 מדגימות את אסטרטגיית ה-gating עבור כל חיידק LAB. ב-LGG וב-L. paracasei זוהו תאים בודדים, אגרגטים קטנים, ...

פרוטוקול זה מתאר גישה כמותית למדידת צבירה עצמית מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה.

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...

מחקר זה השתמש בזני לקטובצילוס כמודל כדי להדגים את היעילות של ניתוח ציטומטריה של זרימת הדמיה בחקר אוטואגרגציה מיקרוביאלית. ההתמקדות היא בניתוח התגובה של צבירה עצמית של מיני לקטובצילוס לפחמימות פשוטות מהתזונה. השיטות הנפוצות ביותר למדידת אוטואגרגציה הן פוטומטריה ספקטרלית, המודדת מתלים מיקרוביאליים, עכירות או צפיפות אופטית, וטכניקות מיקרוסקופיות מסורתיות, כגון שדה בהיר, ניגודיות פאזה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי.כאשר מדברים על הדמיה בתפוקה גבוהה, אחד האתגרים הניסיוניים העיקריים הוא פילוח אירוע בודד. בפרוטוקול זה, זהו צבר יחיד. ציטומטריית זרימת הדמיה מתמודדת עם אתגר זה באלגנטיות ומעניקה לחוקרים כלי רב עוצמה לחקר אוטואגרגציה.

imaging-flow-cytometry-to-study-microbial-autoaggregation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה, אנו מתארים את שיטת ניצול רב רפאים זרימת cytometry הדמיה לכמת את ההפנמה של חלקיקים polyanhydride או חיידקים של 264.7 תאים הגלם.

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

אנו מציגים שיטות כדי לחקור את ההשפעה של PSMs ורעלים אחרים המופרשים על...

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

שיטה זו מדגימה טכניקה להערכת תפקוד גרנולוציטים על ידי מדידה בו-זמנית של פגוציטוזיס של חיידקים והתפרצות חמצונית. ציטומטריית זרימה מבוססת תמונה אפשרה זיהוי של שלוש תת-קבוצות נפרדות של גרנולוציטים מופעלים שכולן נבדלות ביכולתן התפקודית היחסית.

טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte במבחנה

Cytometry זרימה בשילוב עם קיבוץ באשכולות חזותית מציע שיטה קלה לשימוש ומהיר עבור הלומדים biofilms הימית. זה יכול לשמש biofilm אפיון, זיהוי שינויים במבנה הקהילה biofilm, וזיהוי של חלקיקים והאביוטיים שמוטבע על biofilm.

אפיון Biofilms ימיים עם Cytometry זרימה

ניתוח תזרים cytometric הוכיח יקר עבור חוקרים תרבויות טהור וניטור dynamics הקהילה מיקרוביאלי. אנו מציגים שלוש זרימות עבודה מקיפה, מן הדגימה כדי ניתוח נתונים, עבור טהור תרבויות וקהילות מורכבים כמו גם ברורה בינוני כמו מטריצות מאתגר, בהתאמה.

אפיון Microbiome Dynamics – Cytometry זרימה מבוסס זרימות עבודה מתרבויות טהור לקהילות טבעי

עקומות פורצות דרך (BTCs) הן כלים יעילים לחקר הובלת חיידקים במדיה נקבובית. כאן אנו מציגים כלים המבוססים על התקנים נוזליים בשילוב עם מיקרוסקופיה וספירת ציטומטרית זרימה כדי להשיג BTCs.

שילוב התקנים נוזליים עם מיקרוסקופיה וציתום זרימה לחקר תחבורה מיקרוביאלית במדיה נקבובית על פני קשקשים מרחביים

המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת את הכריכה של הפתוגן איקריוטית האנושי הנגיף כדי חיידקים. לאחר ביצוע הראשונית וירוס חיידק הקובץ המצורף, הזרימה cy, לנסות לזהות חיידקים מאוגדים וירברית בתוך האוכלוסייה.

כימות האדם Norovirus וירוס כריכת כריכה של חיידקים קומנדסאל באמצעות זרימה Cy, לנסות

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

ניתן להשתמש במדיום כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) בשילוב עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות כדי לצפות באגרגטים חיידקיים ברזולוציה גבוהה. מאמר זה מפרט שיטות להערכת אוכלוסיות מצטברות במהלך טיפול מיקרוביאלי כפלטפורמה למחקרים עתידיים.

כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה

חקור צבירה עצמית מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימה של הדמיה בחקר Lactobacillaceae. השיטה מאפשרת ניתוח רב-עוצמה של תגובת החיידקים לפחמימות תזונתיות ומאפשרת הבנה מעמיקה של דינמיקה מיקרוביאלית.

ציטומטריית זרימה של הדמיה לחקר צבירה עצמית מיקרוביאלית

גלה סרטונים נוספים