Name: נטיעת קרום חלון עגול של שרקן גינאה ללימודי Ex Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: למדו שיטה לבידוד קרום החלון העגול משממית גינאה לחקר מנגנוני מעבר תרופות באוזן הפנימית. הפרוטוקול שומר על שלמות הרקמה ומאפשר מחקרים ממוקדים של אספקת תרופות ex vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIDCD מס' 1K08DC020780 ו- 5T32DC000027-33, וקרן רובינשטיין לחקר השמיעה.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (GP18M226). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשרקנים לבקנים של הארטלי (זכר ונקבה כאחד, במשקל 500-700 גרם).
1. הגדרת הנוהל והכנתו
<ol><li>לעקר את כל המכשירים עם אתילן אוקסיד לפני תחילת הניסוי.</li>
	<li>יש להרדים את בעלי החיים בהתאם לפרוטוקול המאושר על ידי הממסד. הערה: במחקר הנוכחי, תא שאינו טעון מראש שימש לשחרור 100% פחמן דו חמצני (CO2) מגליל מסחרי. נעשה שימוש במגביל מוטבע כדי לווסת את זרימת הגז, ולשמור עליה בטווח של 30% עד 70% מנפח התא לדקה בהתאם להנחיות AVMA11 לשנת 2020.</li>
	<li>הכניסו את בעל החיים לתא ושחררו פחמן דו-חמצני למשך 5 דקות. זרימת CO2 נשמרת למשך דקה אחת לאחר דום נשימה.</li>
	<li>בצע עריפת ראש לאחר דום נשימה כדי להבטיח המתת חסד.</li>
</ol>2. גישה כירורגית ו explantation
<ol><li>לחלץ את העצם הטמפורלית מגולגולת השרקן בצורה הרגילה12. הסר את הרקמה הרכה העודפת עם רונגור. זהו את הבשר האקוסטי החיצוני, את הבולה הרקתית ואת תעלת הפנים13 (איור 1).</li>
	<li>קדח את ההיבטים הגחונים של הבולה הרקתית עם ביט יהלום 6 מ"מ (ראה טבלת חומרים), וחשף את חלל האוזן התיכונה ואת תעלת השמע החיצונית באופן היקפי.</li>
	<li>באמצעות rongeurs, בעדינות להסיר את תעלת השמיעה החיצונית ואת טבעת tympanic, בו זמנית מפריד את המפרק incudomalleolar. זהו את האינקוס, המפרק האינקודוסטפדיאלי, השבלול, התעלה האופקית החצי עגולה ותעלת הפנים13 (איור 2A).</li>
	<li>מפרידים את המפרק incudostapedial ולהסיר את האינקוס באמצעות מלקחיים. זהה את הגומחה הגרמית של החלון העגול.</li>
	<li>השתמש בסיבית יהלום 6 מ"מ כדי לקדוח את הלמינה הגרמית המחברת את השבלול עם הקיר המדיאלי של חלל הטימפאני לכיוון תעלת טימפאני טנזור. שחרר בזהירות את הלחץ הגרמי של הטימפאני הטנזור והסר את שריר הטימפאני הטנזור באמצעות מחט 28 גרם. הערה: הקיר המדיאלי של טנזור טימפאני פוסה מתחבר ישירות עם עצם השבלול סביב RWM, ויש להקפיד לא לגרום לשברים שיכולים להימשך עד החלון העגול.</li>
	<li>קדחו את הלמינה הגרמית שחיברה את השבלול לדופן התחתונה של חלל הטימפאני עד שנותר 1 מ"מ של מדף גרמי הניגש לשבלול (איור 2B).</li>
	<li>בעזרת ביט יהלום בקוטר 2 מ"מ (ראו טבלת חומרים), יוצרים שבלול בסיבוב הבסיסי של השבלול, ומשאירים כ-2 מ"מ עצם לחלון העגול. ממשיכים את השבלול בצורה נחותה במישור מקביל לקרום החלון העגול כדי להפריד את הבסיס מהקודקוד של השבלול.</li>
	<li>האריכו את חתך השבלול דרך בסיס הגולגולת, שהוא הרבה יותר צפוף, וכתוצאה מכך מבט חתך רוחב של סיבוב הבסיס של השבלול. הערה: כיוון המקדח לכיוון הבשר של תעלת השמע הפנימית מביא למסלול שממקסם את הסרת העצם תוך הימנעות מחציית קרוב מדי לחלון העגול.</li>
	<li>בדוק את הדגימה מצד בסיס הגולגולת, ואם עדיין לא נעשה, זהה את תעלת השמע הפנימית וקדח לצמצם השבלול. הסר את עצב השבלול עם מחט 28 גרם.</li>
	<li>בדוק את הדגימה מהצד התוך-שבלול. זהה והסר את למינה ספירלית osseous בסיבוב הבסיס ואת modiolus הנותרים עם מלקחיים או מחט 28 גרם.</li>
	<li>השקו את חלל scala tympani-scala vestibuli המאוחד בשפע כדי להסיר פסולת. החלון העגול צריך להיראות בבירור מכריתת השבלול ללא פסולת מעליה (איור 2C).</li>
	<li>לאחר מכן, בדוק את הדגימה מצד האוזן התיכונה. קדח את התעלה החצי עגולה הצידית ואת תעלת הפנים עד לגובה החלון הסגלגל. הסר בעדינות את הרצועות באמצעות מלקחיים, חושף את נישת החלון הסגלגל. יש לציין כי קיים גשר גרמי בין הקרורה של הסטייפים המכונה crista stapedis.</li>
	<li>באמצעות מקדח יהלום בקוטר 1 מ"מ (ראו טבלת חומרים), פתחו את הפרוזדור עוד יותר על-ידי הארכת החלון הסגלגל לאורך פני החלון העגול, תוך הקפדה על 1-2 מ"מ של עצם שבלול הניגשת לגומחת החלון העגול (איור 2D).</li>
	<li>השלימו את חתכי העצם הרקתיים על ידי חיבור חתכי החלון הסגלגל עם חתכי השבלול בכל צד של החלון העגול. הערה: בשל שבריריותה של עצם השבלול, שימור הטנזור טימפאני פוסה בדגימה והימנעות מחתכים דרכו יסייעו במניעת שברים בעצם השבלול המגיעים עד לשבלול האוזן ופוגעים בשלמותו.</li>
	<li>בצעו את החיבורים הסופיים לעצם הצפופה של בסיס הגולגולת הסמוך לתעלת השמע הפנימית וגלחו בעדינות עד לקבלת דגימת RWM שנכרתה (איור 3A).</li>
</ol>

שרקן גינאה חלון עגול קרום Explantation

<ol><li>Duan, M. I., Zhi-qiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+round+window+membrane+and+its+role+for+drug+delivery%3A+our+own+findings+and+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Otol%22%5BJournal%5D)">Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review.</a> J Otol. 4 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Kelso, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microperforations+significantly+enhance+diffusion+across+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microperforations significantly enhance diffusion across round window membrane.</a> Otol Neurotol. 36 (4), 694-700 (2015).</li>
<li>Salt, A. N., Plontke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+principles+in+the+inner+ear%3A+Influence+of+drug+properties+on+intratympanic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic principles in the inner ear: Influence of drug properties on intratympanic applications.</a> Hear Res. 368, 28-40 (2018).</li>
<li>Szeto, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+ear+delivery%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope+Investig+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Inner ear delivery: Challenges and opportunities.</a> Laryngoscope Investig Otolaryngol. 5 (1), 122-131 (2020).</li>
<li>Carpenter, A. M., Muchow, D., Goycoolea, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+the+human+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of the human round window membrane.</a> Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 115 (5), 585-590 (1989).</li>
<li>Forouzandeh, F., Borkholder, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtechnologies+for+inner+ear+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Microtechnologies for inner ear drug delivery.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 28 (5), 323-328 (2020).</li>
<li>Leong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+facilitate+small-volume+intracochlear+delivery+without+physiologic+injury+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Microneedles facilitate small-volume intracochlear delivery without physiologic injury in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 44 (5), 513-519 (2023).</li>
<li>Singh, R., Birru, B., Veit, J. G. S., Arrigali, E. M., Serban, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+in+vitro+round+window+membrane+model+for+drug+permeability+evaluations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an in vitro round window membrane model for drug permeability evaluations.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1105(2022).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+targeted+delivery+of+dexamethasone+acetate+across+the+round+window+membrane+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Otol+Neurotol%22%5BJournal%5D)">Magnetic targeted delivery of dexamethasone acetate across the round window membrane in guinea pigs.</a> Otol Neurotol. 34 (1), 41-47 (2013).</li>
<li>Kopke, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanoparticles%3A+inner+ear+targeted+molecule+delivery+and+middle+ear+implant%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanoparticles: inner ear targeted molecule delivery and middle ear implant.</a> Audiol Neurootol. 11 (2), 123-133 (2006).</li>
<li>AVMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%3A+2020+Edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition.</a> AVMA. , (2020).</li>
<li>Goksu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Ann Otolaryngol. 101 (8), 699-704 (1992).</li>
<li>Wysocki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+anatomy+of+the+guinea+pig+temporal+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Topographical anatomy of the guinea pig temporal bone.</a> Hear Res. 199 (1), 103-110 (2005).</li>
<li>Veit, J. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+drug+permeability+properties+of+human+cadaveric+in+situ+tympanic+and+round+window+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the drug permeability properties of human cadaveric in situ tympanic and round window membranes.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (9), 1037(2022).</li>
<li>Kansara, V., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+ex+vivo+model+implication+for+carrier-mediated+retinal+drug+delivery%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an ex vivo model implication for carrier-mediated retinal drug delivery).</a> Curr Eye Res. 31 (5), 415-426 (2006).</li>
<li>Lundman, L., Bagger-Sjöbäck, D., Holmquist, L., Juhn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+window+membrane+permeability.+An+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Round window membrane permeability. An in vitro model.</a> Acta Otolaryngol Suppl. 457, 73-77 (1989).</li>
<li>Moatti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug+permeability+through+an+ex+vivo+porcine+round+window+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug permeability through an ex vivo porcine round window membrane model.</a> iScience. 26 (6), 106789(2023).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+microbubble-facilitated+inner+ear+delivery+of+gold+nanoparticles+involves+transient+disruption+of+the+tight+junction+barrier+in+the+round+window+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound microbubble-facilitated inner ear delivery of gold nanoparticles involves transient disruption of the tight junction barrier in the round window membrane.</a> Front Pharmacol. 12, 689032(2021).</li>
<li>Jeong, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+modulation+of+round+window+membrane+enhances+dexamethasone+uptake+into+the+inner+ear+and+recovery+after+NIHL%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Junctional modulation of round window membrane enhances dexamethasone uptake into the inner ear and recovery after NIHL.</a> Int J Mol Sci. 22 (18), 10061(2021).</li>
</ol>

למחברים אין גילויים לעשות.

באספקת תרופות מקומית לאוזן, RWM הוא נתיב המעבר העיקרי של טיפולים להגיע לאוזן הפנימית. יש צורך במודל מדויק ואמין כדי להבין טוב יותר את מנגנוני ההובלה והחדירות בין רכבי משלוח חדשניים ולפיתוח תרופות. במחקר זה, אנו מראים כי מטע RWM של שרקנים הוא הליך אפשרי ואמין המאפשר חקירות שיטתיות של אינטראקציות בין תרופות לממברנה. לונדמן ואחרים וקלסו ואחרים תיארו בעבר שימוש במודל חדירות RWM דומה 2,16; עם זאת, השלבים הספציפיים של החילוץ הכירורגי לא פורטו עד כה, והשבריריות של עצם השבלול והאנטומיה המורכבת הציבו אתגר לקציר העקבי של RWMs שלמים.
השרקן RWM ממוקם בקצה הסקלה טימפאני של השבלול ומוקף בשכבה דקה של עצם השבלול. שבר של מבנה גלוסקמה זה במהלך תהליך המטע יכול לגרום לדגימה בלתי שמישה, מכיוון שה-RWM נוטה להיקרע אם עצם השבלול שמסביב אינה נשארת שלמה. הקבוצה שלנו ציינה כי שברים התרחשו לרוב בעת קידוח בסמוך לצומת שבין עצם בסיס הגולגולת הצפופה מאוד לבין השבלול השביר, שכן המעבר בצפיפות העצם הגדיל את הסבירות להתפשטות שבר דרך החלון העגול. מסיבה זו, מוצע כי שמירה על העצם הצפופה יותר של פוסה טנזור טימפני, המחוברת לשבלול בסמיכות ל- RW, תגדיל את יבול קציר הדגימות, במיוחד בבעלי חיים מבוגרים. הפרעה של העצם יכולה להתרחש גם במהלך הסרת תוכן השבלול; יש להקפיד להסיר בעדינות את הלמינה הספירלית עם מניפולציה מינימלית של עצם השבלול שמסביב.
פרט חשוב שיש לקחת בחשבון עם מודל זה הוא הכדאיות של RWM לאחר explantation. קבוצות קודמות הציעו כי RWM יונקים נשאר בר קיימא במשך 24-48 שעות לאחר מיצוי17. המחקר הנוכחי שיקף ממצאים אלה; מחקרי הובלה עקביים וניתוחים היסטולוגיים המדגימים מבני תאים שלמים (איור 2A) תמכו שניהם בכדאיות של RWM השרקן בזמן הניסויים. כדי לשמור על הבריאות הכללית של הדגימה שחולצה, RWM מופק ומוטבע בתוך 3 שעות של המתת חסד.
במחקר של פרמקוקינטיקה תרופתית ברחבי RWM in vivo, נותר קושי טכני ניכר בביצוע מדידות של התפלגות פרילימפטית וריכוז1. שינויים בשיטות ההולכה התוך-טימפנית ובכמות היישום הביאו לתוצאות טיפוליות מגוונות. קשיים אלה מתווספים על ידי דינמיקת הנוזלים המורכבת בתוך המבוך, כמו גם יציאה לא סדירה של חומר מוזרק דרך צינור האוסטכיאן. השיטה המתוארת של explantation מאפשר מחקר מבודד של RWM וגורמים המשפיעים על חדירות שלה כמודל ex vivo . יתר על כן, האקספלנט מאפשר גם חקירה ישירה והדמיה של שיטות שונות המשמשות כיום להגברת חדירות RWM, כגון מיקרו-בועות אולטרסאונד18 ואפנון צומתהמושרה כימית 19. מחקרים עתידיים על מנגנוני אנדוציטוזה ספציפיים המעורבים במתן תרופות יפיקו גם הם תועלת ממודל זה.

סוגים חדשים של טיפולים התפתחו לטיפול בליקוי שמיעה תחושתי-עצבי. תרגומם של טיפולים אלה לאוכלוסיות קליניות מוגבל על ידי נתיבי הובלה בטוחים ויעילים לאוזן הפנימית. השיטות הנוכחיות של העברת in vivo במחקרים בבעלי חיים מסתמכות על fenestration לתוך האוזן הפנימית או דיפוזיה דרך קרום החלון העגול (RWM), מחסום non-osseous המפריד בין חלל האוזן התיכונה לבין השבלול1.
פנסטרציה כירורגית ומיקרו-הזרקה לאוזן הפנימית הן פולשניות ועלולות להוות סיכון לתפקוד השיורי של האוזן הפנימית2. לכן, RWM הוא נתיב חשוב לאספקת תרופות מקומית, ושרקנים הם המודל הפרה-קליני העיקרי של בעלי חיים המשמש לחקר פרמקוקינטיקה של תרופות מקומיות ברחבי RWM ובאוזן הפנימית לפיתוח תרופות 3,4. למרות שהוא דק יותר מה-RWM האנושי, השרקן RWM חולק מבנה תלת-שכבתי זהה. קוטרו כ-1 מ"מ, עוביו 15-25 מיקרומטר, והוא מורכב משתי שכבות תאי אפיתל המרכיבות שכבת רקמת חיבור5. שכבת האפיתל הפונה לאוזן התיכונה צפופה ומחוברת באמצעות צמתים הדוקים, בעוד שהשכבה הפונה לאוזן הפנימית ולסקלה טימפאני היא בעלת ארכיטקטורה רופפת יותר ואין לה הידבקויות בין-תאיות משמעותיות.
מחקרים פרה-קליניים עכשוויים החוקרים חדירות תרופות בשרקן RWM מסתמכים על זריקות in vivo באוזן התיכונה ולאחר מכן דגימה של נוזל הפרילימפה בתוך האוזן הפנימית, מה שאינו מאפשר את המחקר הספציפי של הובלת RWM 6,7. שברי צמחי RWM שימשו במחקרים פרה-קליניים, אך בשל שבריריותם וגודלם הקטן, הם אינם מתאימים לחקירות שיטתיות ומיקרופלואידיות של הובלת תרופות וכלי רכב הדורשים אטם אטום למים על פני RWM2. קבוצות אחרות השתמשו במודלים במבחנה עם תאי אפיתל אנושיים בתרבית כדי להעריך בקירוב את RWM 8,9,10. עם זאת, רוב המבנים הללו מתמקדים אך ורק בשכבת האפיתל החיצונית ואינם לוכדים את המורכבות של ארכיטקטורת רקמות טבעית. להבנה מפורטת יותר של מנגנוני הובלה ברחבי RWM, נדרשים מחקרים ממוקדים, ex vivo.
במחקר זה, אנו מדגימים את הנטיעה של RWM שרקן עם תמיכה גרמית מסביב כדי לשמור על שלמות הממברנה וממחישים את השימוש בהם בפרדיגמה ניסיונית המיועדת למחקר ספציפי של הובלת RWM של כלי משלוח סמים.

<table><tbody><tr><td>1 מ"מ מקדח כדור יהלום</td><td>Anspach</td><td>1SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"מ מקדח כדור יהלום</td><td>Anspach</td><td>2SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>6 מ"מ מקדח כדור יהלום</td><td>Anspach</td><td>6D-G1</td><td></td></tr><tr><td>ANSPACH EMAX 2 Plus מערכת</td><td>Anspach</td><td>EMAX2PLUS</td><td>כל מערכת קידוח חיתוך עצם תעבוד</td></tr><tr><td>BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 אינץ' עם מזרק BD Luer-Lok ניתן להסרה 1 מ"ל</td><td>בקטון, דיקינסון ושות'&nbsp;</td><td>382903057894</td><td>כל 27-28 גרם מחט</td></tr><tr><td>גורילה אפוקסי</td><td>גורילה</td><td>4200101</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-CAST</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr></tbody></table>

נטיעת קרום חלון עגול של שרקן גינאה ללימודי ex vivo

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

מתן יעיל וזעיר פולשני של תרופות לאוזן הפנימית הוא אתגר משמעותי. קרום החלון העגול (RWM), בהיותו אחת מנקודות הכניסה הבודדות לאוזן הפנימית, הפך למוקד חקירה חיוני. עם זאת, בשל המורכבות של בידוד RWM, ההבנה שלנו של הפרמקוקינטיקה שלה נותרה מוגבלת. ה-RWM מורכב משלוש שכבות נפרדות: האפיתל החיצוני, שכבת רקמת החיבור האמצעית ושכבת האפיתל הפנימית, שכל אחת מהן בעלת תכונות העברה ייחודיות.
המודלים הנוכחיים לחקר התחבורה ברחבי RWM משתמשים במודלים של בעלי חיים in vivo או מודלים של RWM ex vivo המסתמכים על תרביות תאים או שברי ממברנה. שרקנים משמשים כמודל פרה-קליני מתוקף לחקר פרמקוקינטיקה של תרופות בתוך האוזן הפנימית והם מודל חייתי חשוב לפיתוח תרגומי של רכבי משלוח לשבלול. במחקר זה, אנו מתארים גישה לנטיעת RWM של שרקן עם עצם השבלול שמסביב לניסויים בהעברת תרופות. שיטה זו מאפשרת שימור של ארכיטקטורת RWM מקורית ועשויה לספק ייצוג מציאותי יותר של חסמי תחבורה מאשר דגמי הספסלים הנוכחיים.

כפי שמודגם באיור 3A, שיטה זו מאפשרת לנטוע את קרום החלון העגול של השרקן השלם עם טבעת מקיפה של עצם קשיחה. RWM צריך להיות מחובר באופן מלא לטבעת הגרמית באופן היקפי. אין להעריך שברים בעצם השבלול. בהשוואה לדגימות חלון עגול אנושי, לשרקן RWM אין פסאודוממברנה מעל. בנוסף, בניגוד לבני אדם, קיים גשר גרמי בין הקרורה של סטפס השרקן, הדורש שבירה והסרה לפני חילוץ מבנה העל של השרקנים. ניתוח היסטולוגי (איור 3B) של RWM המייצג מראה מבנה אפיתל תלת-שכבתי ברור עם נישת חלון עגולה סמוכה ושלמה.
מנקודת מבט טכנית, ישנם שני שלבים קריטיים. ראשית, בעת ביצוע כריתת השבלול בשלב 2.7, חשוב להשתמש בקו המשווה של המקדח, ולא בקצה, כדי לבצע את החתך, שכן ריצוד בקצה הבור יכול להוביל לשברים טראומטיים בעצם השבלול שעלולים להתרחב עד קרום החלון העגול. שנית, חשוב לקדוח באופן מלא את תעלת השמע הפנימית, שכן הדבר מאפשר הסרה מלאה של עצב השבלול ודיסקציה קלה יותר של הלמינה הספירלית הגלוסקמאית, וכתוצאה מכך נוצר חלל אחיד בצד התוך-שבלול לצורך דגימה ניסיונית (איור 2C).
לאחר שה-RWM חולץ בהצלחה, הקבוצה שלנו השתמשה בתא שימוש שונה כדי להעריך את התכונות הפרמקוקינטיות של הממברנה. תא השימוש המתוקן אומת על ידי קבוצות אחרות בקרומי החלון הטימפאני והעגול, כמו גם ברקמת הרשתית כדי להעריך את תכונות ההובלה של קרומי אפיתל14,15. התקן מודפס תלת-ממדי זה נבנה באמצעות Poly-Jet Vero והוא מורכב משני חלקי בסיס משולשים, כל אחד עם תא נוזל של 400 μL (איור 3). השפה הגרמית של ה-RWM מוצמדת לבסיס באמצעות אפוקסי בעל 2 חלקים (גורילה, ראו טבלת חומרים), ואחריו חומר איטום סיליקון (ראו טבלת חומרים) כדי להבטיח אטימה אטומה למים (איור 4). יש להקפיד להימנע מכל מגע של אפוקסי או חומר איטום עם הממברנה. כאשר ה-RWM דחוק במקומו, שני הבסיסים מודבקים יחד עם אפוקסי. במהלך ניסויי הובלה, ההעמסה (הפונה לאוזן התיכונה) מלאה במי מלח חוצצי פוספט (PBS) המכילים את רכב ההובלה (או כל מולקולה מעניינת), ותא הדגימה (הפונה לסקלה טימפאני) מלא ב-PBS בלבד. במרווחי זמן קבועים, נוזל מתא הדגימה נשאף לחלוטין ומוחלף ב- PBS טרי.
במהלך כל ניסוי ננקטים אמצעי בקרת איכות כדי להבטיח שיש גם אטם אטום למים סביב הדגימה בתוך המנגנון, כמו גם קרום שלם לחלוטין ללא מיקרו-נקבים. תוצאות מייצגות עם תמיסת ננו-חלקיקי ליבת ברזל חומה מוצגות להלן. אימות כמותי של אטם אטום למים מתבצע על ידי שאיפת הנפח המלא של תא הדגימה במהלך כל מרווח דגימה; דליפת נוזל מתא הדגימה תגרום לפחות מנפח השאיפה המלא. בסיום כל ניסוי, נפח הנוזל בתא הטעינה צריך להישאר זהה. בנוסף, מכיוון שנוזל המטרה שלנו הוא בצבע חום, הוא נראה בקלות גם במקרה של דליפה.
כדי לוודא שאין דליפה בתוך הממברנה, ננקטו מספר גישות. ראשית, דגימות RWM ששימשו במחקר הזה מופקות כולן מיד, ותמונות אור, קונפוקליות ומיקרוסקופ אלקטרונים מאשרות מבנים שלמים של תאים וממברנות ללא מיקרו-נקבים (איור 3A,B). שנית, מיקרו-נקבים נוצרו במכוון בתת-קבוצה של דגימות RWM כדי להשוות את ההשפעה על העברת ננו-חלקיקים. בדיקה חזותית של תא הדגימה ותא ההעמסה משמשת אישור נוסף לשלמות הדגימה ולהתקשרות אטומה למים. ב-RWM עם נקבים קיים שיווי משקל מהיר של תא ההעמסה והדגימה, שניתן לצפות בו באמצעות שינוי צבע מובהק (איור משלים 1). נוסף על כך, נמצא כי ההובלה ב-RWMs מיקרו-מחוררים הייתה גבוהה מהשונות המרבית שנצפתה בקרומים שלמים (איור משלים 2). יחד, אלה משמשים כמנגנוני בקרת איכות לשלמות האטם האטום למים המקיף את הדגימה, כמו גם RWM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig01.jpg"> איור 1: תמונה טרום ניתוחית של עצם הרקתית של השרקן. הבולה הטימפנית, תעלת השמע החיצונית ותעלת הפנים (*) מוצגות בתמונה זו לפני הניתוח של עצם הרקתית של השרקן. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig02.jpg"> איור 2: תמונות תוך ניתוחיות. תמונות תוך ניתוחיות המדגימות את הקשר בין קרום החלון העגול לבין האינקוסים (*), השבלול (**), סטייפים (†) ותעלת השמע הפנימית הדחוסה (‡). אזורים מוצללים מציינים חלקים מהדגימה שיוסרו. (A) חלל האוזן התיכונה של חזיר גינאה לאחר הסרת קרום הטימפאני ועצב הפנים (שלב 2.3). (B) חלל האוזן התיכונה לאחר הפחתת לחץ של תעלת הטימפאני הטנזורית (שלב 2.6). (C) תצוגה בסיסית של RWM לאחר שבלול והסרת תוכן האוזן הפנימית (שלב 2.11). (ד) מבט על RWM לאחר הסרת הסטייפים וזיהוי הפרוזדור (שלב 2.13). סרגל קנה מידה = A,B (1 ס"מ); C,D (5 מ"מ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig03.jpg"> איור 3: דגימת RWM סופית והיסטולוגיה. (A) חזיר גינאה RWM ברוטו דגימה עם טבעת גרמית. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (B) היסטולוגיה של קרום החלון העגול של השרקן הנטוע מדגימה מבנה תלת שכבתי שלם. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig04.jpg"> איור 4: התקן מיקרופלואידי לניסויי הובלה טרנסממברנלית. (A) דיאגרמה של המכשיר המיקרופלואידי המשמש לניסויי הובלה טרנסממברנלית. (ב,ג) מכשיר מיקרופלואידי מודפס לניסויים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: העמסה ודגימה של תכולת תא במהלך ניסוי העברת ננו-חלקיקי ליבת ברזל של 5 שעות. (A) תא העמסה של RWM שלם מראה ירידה הדרגתית בעוצמת הצבע ככל שריכוז הננו-חלקיקים יורד. (B) תא דגימה של RWM שלם מראה צבע יציב לאורך זמן, עקבי עם רמות נמוכות של העברת ננו-חלקיקים. (C) תא טעינה של RWM מחורר מדגים ירידה מהירה בעוצמת הצבע ככל שהתכולה מתאזנת עם תא הדגימה. (D) תא דגימה של RWM מחורר מראה עלייה הדרגתית בצבע לאורך זמן, בהתאם לרמות גבוהות של העברת ננו-חלקיקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
תרשים משלים 2: תוצאות הובלה מייצגות למסירת ננו-חלקיקים. תוצאות הובלה מייצגות להעברת ננו-חלקיקים (Fe3O4 core עם ציפוי פוליאתילן גליקול, רדיוס ממוצע של 77 ננומטר) על פני RWM של שרקנים, הן שלמים והן עם נקבים (ממוצע ± SD, n ≥ 3 ניסויי RWM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר שיטה להוצאת קרום החלון העגול מעצמות הרקתיות של שרקן, ומספק משאב רב ערך למחקרי ex vivo .

נטיעת קרום חלון עגול של שרקן גינאה ללימודי Ex Vivo

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

הקבוצה שלנו חוקרת תרופות וכלי משלוח תרופות לטיפול במחלות אוזן פנימית כגון ליקוי שמיעה. קרום החלון העגול הוא המחסום הקריטי שמונע מתרופות מקומיות להיכנס לשבלול, וכעת אנו עובדים כדי להבין כיצד ניתן להנדס כלי רכב להובלת ננו-חלקיקים כך שיעברו דרך מחסום זה. הבנת אופן הפעולה של קרום החלון העגול במונחים של הובלת תרופות חיונית לפיתוח אסטרטגיות יעילות להעברת תרופות לאוזן.שרקן גינאה הוא מודל פרה-קליני חשוב של בעלי חיים לחקר העברת תרופות לאוזן. עם זאת, בידוד קרום שברירי זה, שעוביו 17 מיקרון בלבד, לצורך מחקרי הובלת תרופות נותר אתגר משמעותי. כאן, אנו מתארים שיטה לחילוץ קרום החלון העגול של השרקן המאפשר מחקרי הובלת תרופות יעילים על גבי ספסל.החקירות הנוכחיות של העברת תרופות לשנה הפנימית מסתמכות בעיקר על מודלים ניסיוניים in vivo ואחריו דגימת פרילימפה, שאינם מאפשרים מחקר ספציפי וממוקד של מנגנוני הובלת קרום החלון העגול. במחקר זה אנו מדגימים מיצוי של קרום החלון העגול של השרקן עם תמיכה גרמית מסביב. שיטה זו שומרת על שלמות ארכיטקטורת הרקמה הטבעית ומאפשרת מחקרים מדויקים וממוקדים של העברת תרופות על פני קרום החלון העגול.

guinea-pig-round-window-membrane-explantation-for-ex-vivo-studies

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרט הווידאו הזה מראה כיצד בניתוח לחסום צינור endolymphatic החזיר של ניסיונות לייצר hydrops endolymphatic.

אינדוקציה כירורגי של Hydrops Endolymphatic על ידי מחיקה של צינור Endolymphatic

בסרטון זה אנו מתארים טכניקה לבידוד תאי אפיתל קשתית ופיגמנט רשתית מעיני חזירים כדי להשיג את התרביות הראשוניות שלהם למחקרי in vivo ו- ex vivo. תאי פיגמנט אלה יכולים להיות מהונדסים גנטית כדי לחקור גישות רגנרטיביות לטיפול בהפרעות עיניים.

בידוד תאי IPE ו-RPE: טכניקה להשגת תאי אפיתל פיגמנטיים מעין חזירית מבודדת

בסרטון זה, אנו מתארים הליך כירורגי לחילוץ רקמות ברונכיולריות מריאת חזיר שנקטף. הרקמה הסימפונית ex vivo יכולה לשמש לפיתוח מודלים של זיהומים לחקר דלקות ריאה כרוניות.

מיצוי רקמת ברונכיולרי חזיר: הליך לניתוח חלקי רקמת ברונכיולר מריאות חזיריות

כאן אנו מציגים פרוטוקול להצפנה אינדוקציה של שמאל cryoinjury חדרית ואחריו ההשתלה של תיקון שריר הלב, נגזר iPS-התא האנושי cardiomyocytes במודל של שפן.

השרשת נגזר hiPSC תיקונים שריר הלב לאחר פציעה שריר הלב במודל שפן

מאמר זה מדגים גישה extradural להשמיד את שק השפן גינאה endolymphatic ולפגוע צינור endolymphatic עם בוחר דק כדי לגרום הידרופס ניסיוני endolymphatic.

גישה כירורגית מתוקן כדי לגרום הידרופס הידרו בשפן גינאה

כאן מוצג פרוטוקול לבידוד וזיהוי תאי אפיתל ראשוניים של איריס ושל פיגמנט רשתית מיונקים שונים (עכברים, חולדות, ארנב, חזיר וחזירים). השיטה מתאימה באופן אידיאלי לחקר גישות ריפוי גנטי עיניות במגוון סטים עבור ניתוחי ex vivo ובמחקרי vivo הניתנים להעברה לבני אדם.

בידוד, תרבות והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנט ראשוני של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי

השתלה תת-רשתית של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE) היא אחת הגישות המבטיחות ביותר לטיפול במחלות רשתית ניווניות. עם זאת, הביצועים של מחקרים פרה-קליניים על מודלים של בעלי חיים בעלי עיניים גדולות נותרו מאתגרים. דו"ח זה מציג הנחיות להשתלה תת-רשתית של RPE על נשא תאים במיני-חזירים.

השתלה תת-רשתית של RPE על נשא במיני-חזירים: הנחיות להכנות טרום ניתוחיות, טכניקות כירורגיות וטיפול לאחר ניתוח

קצב סינון גלומרולרי (GFR) הוא הסמן האידיאלי להערכת תפקוד הכליות. עם זאת, שיטת המדידה הסטנדרטית באמצעות הזרקת אינולין עם ניתוח דם ושתן סדרתי אינה מעשית. מאמר זה מתאר שיטה מעשית למדידת GFR באופן טרנסדרמלי בחזירונים.

מדידה טרנסדרמלית של קצב סינון גלומרולרי בחזירונים מאווררים מכנית

אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה לבידוד תאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט. הליך זה מאפשר מעקב אחר מחקרי ביולוגיה מולקולרית על RPE המבודד, כולל ניתוח ביטוי גנים.

בידוד תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני חזיר גינאה

מחקר זה מציג שיטה ניתנת להרחבה, אמינה וניתנת לשחזור עבור הקלטות קליפת המוח הכרוניות החוזרות ונשנות במודל חזיר. לשיטה יישומים בתחומים שונים של מדעי המוח, כולל חקר כאב ואבחון מחלות נוירולוגיות.

טכניקת חלון גולגולת כרונית להקלטות חוזרות ונשנות בקליפת המוח במהלך הרדמה בחזירים

כאן, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת לבידוד הרשתית מעין העכבר לניסויים ממושכים ex vivo . פרוטוקול זה מדגיש את הנגשת הגישה התובענית מבחינה טכנית לחוקרים המעוניינים לנצל את דרכי המחקר הניתנות על ידי שמירה על גליה ברשתית באתרה ברקמה חיה.

מודל ex vivo explant לחקר אינטראקציות גליה ברשתית העכבר

למדו שיטה לבידוד קרום החלון העגול משממית גינאה לחקר מנגנוני מעבר תרופות באוזן הפנימית. הפרוטוקול שומר על שלמות הרקמה ומאפשר מחקרים ממוקדים של אספקת תרופות ex vivo.

נטיעת קרום חלון עגול של שרקן גינאה ללימודי Ex Vivo

גלה סרטונים נוספים