פיתוח מבחני RT-qPCR בזמן אמת לזיהוי SARS-CoV-2, שפעת A/B ו-MERS-CoV
10 בנובמבר 2023
אנו מציגים שתי ערכות RT-qPCR חד-שלביות מבוססות בדיקה עבור וירוסים נשימתיים נפוצים. הבדיקה הראשונה היא עבור SARS-CoV-2 (N), שפעת A (H1N1 ו- H3N2) ושפעת B. השני הוא עבור SARS-Cov-2 (N) ו- MERS (UpE ו- ORF1a). בדיקות אלה ניתן ליישם בהצלחה בכל מעבדה מיוחדת.
המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לנהל גישה מרובה לזיהוי בו זמנית של וירוסים נשימתיים נפוצים במחזור כגון SARS-CoV-2, MERS, שפעת A ושפעת B. הטכנולוגיות הרווחות המניעות את ההתקדמות בתחומנו כוללות CRISPR, מבחני אמינו זרימה רוחבית, חיישנים ביומולקולריים מבוססי נייר, בדיקת שרלוק בסיר אחד, אפטמרים DNA ומולטיפלקס RT-qPCR משולב עם הגברה איזותרמית בתיווך לולאה, מנורה. עם זאת, מולטיפלקס RT-qPCR הוא הרגיש ביותר, הנפוץ ביותר והוא תקן הזהב לאבחון וירוסים שונים. האתגר הניסויי הנוכחי הוא להקים פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לזהות עותקי RNA נמוכים עד 10 עותקים.
השתמשנו בערכת RT-qPCR פנימית לבדיקה, וזה חסכוני בזמן ובעלות. כדי להתחיל, הכן את המאגר 2x עבור RT-qPCR במים נטולי DNA/RNA אחסן את המאגר במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לאחר מכן, מערבבים את הפריימרים והבדיקות בצינור של 1.5 מיליליטר.
הרכיבו את הנפח בעזרת מאגר פליטה, ואז אחסנו את הצינור במינוס 20 מעלות צלזיוס. הכינו תערובת אנזימים עם טאק פולימראז ו-MMLV-RT בשפופרת של 1.5 מיליליטר על קרח. הרכיב את הנפח עם מאגר אחסון taq פולימראז.
כעת השעו מחדש את ה-RNA הסינתטי הנגיפי בצינורות נפרדים עם 100 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA כדי ליצור מלאי של 10 עד שישי עותקי RNA למיקרוליטר. כדי לערבב את מלאי הנגיף, הוסף חמישה מיקרוליטר כל אחד של SARS-CoV-2, שפעת A ו-B ל-50 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA. באופן דומה מערבבים SARS-CoV-2 ו-MERS-CoV לקבלת תערובת ויראלית שנייה.
מדללים את שתי התערובות פי עשרה כדי לקבל דילול סופי של 10 עותקי RNA למיקרוליטר. לכל באר של צלחת 96 בארות, פיפטה 2x מאגר, פריימר, אנזים, מים נטולי DNA/RNA ותערובות ה-RNA המתאימות. אטום את הצלחת עם חותם צלחת דבק.
ואז צנטריפוגה את הצלחת למשך דקה אחת כדי לאסוף את הנוזל בתחתית הבאר. לאחר מכן תכנת את מכונת ה-PCR לקבל את סוג בלוק הבאר המהיר 96 עם סוג הניסוי המוגדר לעקומה סטנדרטית. הגדר את הריאגנטים לריאגנטים של TaqMan ובחר מאפייני הפעלה רגילים.
הגדר את מטרות הגן ואת צבע המדווח. לאחר מכן הגדר את שמות הדגימות עבור כל תגובה שתיבדק והקצה מטרות ודגימות לפריסת הצלחת. כעת הזן את תוכנית המחזור למכשיר.
העבר את הצלחת למכונת QPCR בזמן אמת בכיוון הנכון ולחץ על הפעלה כדי להתחיל את המחזור. בחר את מיקום הקובץ לשמירת נתוני הניסוי. לאחר מכן בחן את חלקות ההגברה המסופקות על ידי תוכנית QPCR.
שתי הערכות שפותחו הצליחו להגביר בהצלחה את כל שלושת גני המטרה בו זמנית, עם עד 10 עותקי RNA לכל תגובה. יעילות ההגברה עבור כל הטיטרציות הוויראליות הייתה מעל 99%
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פיתוח של שני ערכות RT-qPCR חד-שלביות מבוססות גששים, שתוכננו לזיהוי סימולטני של נגיפי נשימה נפוצים, כולל SARS-CoV-2, MERS וזנים שונים של Influenza. ערכות אלו משפרות את יכולות האבחון של מעבדות מתמחות באמצעות גישה חסכונית ביעילותה הכספית וזמנית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- זיהוי נגיפי נשימה
- טכניקת RT-qPCR
- פיתוח בדיקות Multiplex
רקע
- הצורך באבחון מהיר ורגיש של נגיפי נשמה.
- המגבלות של טכנולוגיות הזיהוי הנוכחיות.
- חשיבותו של גישת מולטיפלקס (multiplex) לזיהוי בו-זמני.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ערכות RT-qPCR שפותחו במעבדה
- גילוי RNA ויראלי
- RT-qPCR מרובה (Multiplex) בשילוב עם גונו-פרובים (probes) ספציפיים
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של SARS-CoV-2 ו-MERS לצד Influenza A ו-B.
- השגת הגברה בריכוזי RNA נמוכים עד כדי 10 עותקים לתגובה.
- הדגמת יעילויי הגברה גבוהים מעל 99% עבור הגנים המטרה.
מסקנות
- ערכות ה-RT-qPCR שפותחו יעילות לזיהוי רב-נספחי (multiplex) של נגיפי נשימה.
- מחקר זה תורם לאסטרטגיות אבחון משופרות במחקר virology.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
בדיקות multiplex real-time RT-qPCR עבור SARS-CoV-2, Influenza A/B ו-MERS-CoV נותנות מענה לצורך הקריטי בזיהוי מהיר, רגיש וספציפי של נגיפי נשמה המסתובבים בו-זמנית, במסגרת מחקר גילוי ומחקר תרגומי. בדיקות אלו מאפשרות הבחנה ברמת ביטחון גבוהה בין יעדים ויראליים, ובכך הן תומכות בתיקוף יעדים חסון ומפחיתות עמימות בשלבים מוקדמים של פיתוח אבחנתי. שילובן משפר את הביטחון החזוי ואת היעילות התפעולית בתיקי פיתוח ומחקר (R&D) המתמקדים באיומי מחלות זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה מדויקת של מטרות ויראליות לצורך תיקוף תפקודי במודלים של מחלות דרכי נשימה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין פתוגנים ויראליים בעלי זיקה הדוקה בדגימות מורכבות.
- מסייע בביטחון תחזיתי בבחירת מטרות ותיעוד עבור תוכניות אבחון וטיפול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות בדיקה מולטיפלקס (multiplex) עמידות לצורך סריקה עוקבת של תרכובות אנטי-ויראליות או לאבחון.
- מספק תוצרים סטנדרטיים, הניתנים לשחזור וכמותיים לצורך ביסום (benchmarking) ואופטימיזציה של הבדיקה.
- מאפשר מוכנות לסריקה רחבה (high-throughput) וניתנת להרחבה לצורך הערכה מהירה של התערבויות מועמדות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים (translational biomarkers) על ידי מתן אפשרות לגילוי סימולטני של נגיפי נשימה מרובים.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות אספקת גילוי נגיפי כמותי ואמין.
- מפחית סיכונים בקידום מועמדים על ידי הבטחת זיהוי מדויק של הפתוגן במערכות הרלוונטיות למחלה.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
בדיקות Multiplex RT-qPCR משתלבות ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ותומכות בבדיקת השערות ראשונית, בפיתוח בדיקות ובמחקר תרגומי עבור פורטפוליו של מחלות זיהומיות.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת זיהוי ברגישות גבוהה עבור תיקוף יעדים ויראליים מונחה-השערה.
- סריקה: מציעה תוצרים כמותיים הניתנים לשחזור עבור סטנדרטיזציה של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליזה: מספקת נתוני הגברה חזקים ומדדי ספציפיות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מאפשרת התאמה של סמנים ביולוגיים והמשכיות בין שלבי המחקר.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר ולהתאמה לזיהוי ויראלי מרובה-מטרות (multiplex) בסביבות מו"פ מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בזיהוי נגיפי.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבת קנה המידה (scalability) של תהליכי עבודה אבחנתיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך ביצוע (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות להבחנה מוקדמת ומדויקת בין פתוגנים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות למחלות זיהומיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בווירולוגיה מולקולרית ובתכנון בדיקות qPCR כמותיות.
- נדרשת גישה למכשור PCR בזמן אמת (real-time PCR) ולתשתית תוכנה אנליטית.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית להגדרת הבדיקה, לפרשנות הנתונים ולבקרת איכות.
- עשוי לדרוש התאמה לסוגי דגימות שונים או לוריאנטים ויראליים חדשים.
- הביצועים תלויים בספציפיות של הפריימרים/פרובים ובאיכות ה-RNA, כפי שנתמך במקור.
