Name: חקר התחלת מוות תאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: חקור את קצב התחלת מוות תאי בתפוחי אדמה באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. פרוטוקול זה מאפשר תיעוד רציף של היווצרות פצעונים ומספק כלי יעיל לחקר מנגנוני ההגנה הצמחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לברברה יקליץ' על הסיוע הטכני. מחקר זה נתמך כספית על ידי סוכנות המחקר והחדשנות הסלובנית (מימון ליבת מחקר מס' P4-0165 ופרויקט Z4-3217: פענוח קישוריות איתות הקשורה לחמצון-חיזור בעמידות תפוחי אדמה נגד וירוסים).

הערה: סעיפים 1 ו-2 מתארים פרוטוקול שונה להכנת חומר צמחי בהתבסס על השיטות שתוארו על ידי Lukan et al.7. באופן ספציפי, נעשו כמה שינויים בתנאים סביבתיים מבוקרים והכנת חיסונים.
1. גידול צמחי תפוחי אדמה
<ol><li>לגדל קורות חיים בריאים של תפוחי אדמה. צמחי ריוול בתרבית רקמת צומת גזע8.</li>
	<li>לאחר 6-8 שבועות, חותכים עשרה חצילים באורך 1 ס"מ המכילים צמתים מצמחי תפוחי אדמה על נייר סטרילי בתנאים סטריליים באמצעות פינצטה סטרילית וסכין אזמל.</li>
	<li>העבירו אותם לקופסאות פלסטיק עם מדיום Murashige ו-Skoog (MS30) (איור 1A) וגידלו אותם בתנאים סביבתיים מבוקרים (22°C באור ו-19°C בחושך עם קרינה של 250 μE או μmol/m/m 2/s ופוטופריוד של 16 שעות, בלחות יחסיתשל 55% ±-5%).</li>
	<li>מעבירים אותם לאדמה שבועיים לאחר מיקרו-ריבוי.<ol><li>ממלאים את העציצים (r = 10 ס"מ) באדמה. בעזרת אצבע יוצרים חור באדמה בעומק 3-4 ס"מ באמצע עציץ, ממלאים את החור במים ומחכים שהוא ייספג.</li>
		<li>הכניסו צמח אחד לכל עציץ לתוך החור, והשאירו את העלים מעל פני השטח. כסו בעדינות את השורשים באדמה (איור 1B). הערה: ייתכן שצמחים מסוימים לא יפתחו שורשים. להוציא צמחים אלה מן הניתוח.</li>
	</ol></li>
	<li>לגדל את הצמחים באדמה בתא גידול בתנאים סביבתיים מבוקרים (22°C באור ו-19°C בחושך, בלחות יחסית של 55% ±-5%, עם קרינה של 250 μmol/m2/s ו-16 שעות).</li>
	<li>לאחר 3-4 שבועות, הצמחים מוכנים. השתמשו בצמחים אלה כדי להתחסן. הערה: לצמחים צריכים להיות לפחות 3-4 עלים מפותחים לחלוטין עם עלעלים גלויים (איור 1C). הם צריכים להיראות בריאים, ללא תסמינים נראים לעין (עלים צהובים או חומים), אשר יכול להיות בטעות נגעים הנגרמים על ידי PVY. כדי להשיג תוצאות דומות, צמחים צריכים להיות מחוסנים באותו זמן (למשל, בשעה 9 בבוקר) בכל הניסויים כדי למנוע השפעות אפשריות של שעון ביולוגי על התגובה החיסונית של הצמח והיווצרות נגעים 9,10,11.</li>
</ol>2. הכנת אינוקולום וחיסון תפוחי אדמה
<ol><li>יש לחסן את הצמח בזן PVY N-Wilga (PVYN-Wi; מס' הצטרפות. EF558545) חיסון כאמור להלן. הערה: ניתן לחסן יותר צמחים במקביל אם קיים יותר ממיקרוסקופ דיגיטלי אחד. לצמחים צריכים להיות לפחות שלושה עלים מפותחים לחלוטין לפני החיסון (איור 1C). PVYN-Wi מוכפל ומתוחזק בקורות חיים של תפוחי אדמה.<ol><li>הכן מאגר פוספט, בתוספת נתרן diethyldithiocarbamate (DIECA), לחיסון: לערבב 1.3 מ"ל של 0.2 M NaH 2 PO 4, 8.7 מ"ל של0.2 M Na2HPO4, ו 0.225 גרם של DIECA. לפצות את עוצמת הקול ל 100 מ"ל באמצעות ddH20. התאם את ה- pH ל- 7.6 על ידי הוספת תמיסת 1 M NaOH או 1 M HCl.</li>
		<li>קציר 6-8 שבועות PVYN-Wi נגוע תפוח אדמה CV. צמחי פנטלנד מתרבית רקמה בשקיות מיצוי עם רשת פילטר (0.5 גרם ל-6 צמחים) ומוסיפים חיץ פוספט בתוספת DIECA (מסה פי 4 של חומר צמחי, מסה: יחס נפח). השתמש הומוגנייזר יד במשך 1-2 דקות כדי לקבל פתרון הומוגני.</li>
		<li>אבק קלות את שלושת העלים הראשונים המפותחים במלואם של צמחי תפוחי אדמה בני 3-4 שבועות (משלב 1.6) עם אבקת קרבורונדום. הערה: התאם את כמות אבקת קרבורונדום. יותר מדי עלול לגרום נזק, בעוד מעט מדי עלול לגרום לזיהום לא יעיל. באופן אופטימלי, 0.1 מ"ג / ס"מ של אבקת carborundum משמש, שהם כ 1.5 מ"ג של אבקה לכל עלה בגודל ממוצע (כ 15 ס"מ2).</li>
		<li>שפשפו בעדינות את העלים עם האינקולום (~ 100 מיקרוליטר לעלה). לאחר 10 דקות, לשטוף היטב את העלים עם מי ברז.<ol><li>היזהרו לא לפגוע בעלים. אין לחרוג מזמן הדגירה. יש להתאים את כמות החיסון בהתאם לגודל העלה - 6.5 מיקרוליטר/ס"מ, שהם כ-100 מיקרוליטר לעלה בגודל ממוצע (כ-15 ס"מ2).</li>
		</ol></li>
		<li>מעבירים את הצמחים לתא גידול ומגדלים אותם בתנאים סביבתיים מבוקרים (28°C באור ו-28°C בחושך בלחות יחסית של 55% ±-5%, עם קרינה של 250 μmol/m2/s ו-16 שעות פוטו-תקופה) למשך 3 ימים.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת הצמח ושימוש במיקרוסקופ דיגיטלי לרישום התפתחות נגעים
<ol><li>העבר את הצמחים המחוסנים מתא הגידול הנשמר ב 28 ° C לתא גידול ב 22 ° C 3 ימים לאחר החיסון, עם תנאים אחרים כמתואר בשלב 1.5.</li>
	<li>בחר צמח לתצפית. יש לשתק את העלה המחוסן השני באמצעות סרט הדבקה (איור 1D). ודאו שהעלה הרצוי משותק לחלוטין לפני תחילת ההדמיה (איור 1D).</li>
	<li>התקן יישום תוכנה ללכידת תמונה במחשב הנייד. חבר את המיקרוסקופ הדיגיטלי למחשב. פתח את התוכנה. הערה: ודא שהמפעל, המיקרוסקופ הדיגיטלי והמחשב הנייד ממוקמים על המדף ליד השקע כדי לחבר את המחשב. ההחלטה על בחירת העלים לניטור עשויה להיות תלויה בשאלה הביולוגית הנחקרת, למשל, סוג התהליך המוביל להיווצרות מוות תאי מתוכנת מוגבל.</li>
	<li>כוונן את המיקרוסקופ מעל העלה המשותק. התמקדו באמצעות החוגה במיקרוסקופ הדיגיטלי (מוצג באיור 1E).<ol><li>ודא כי קו הראייה רחב ככל האפשר כדי להגדיל את הסיכויים ללכוד את היווצרות הנגע אך עדיין מוגדל מספיק כדי לזהות את המראה של הנגע (בדרך כלל, הגדלה פי 25 משמש).</li>
	</ol></li>
	<li>הגדר את הגדרות המצלמה. לחצו על כפתור ההגדרות בפינה השמאלית העליונה של התמונה (איור 2A, חלק 1 בעיגול) וכווננו את הגדרות המצלמה: בהירות (60-70), ניגודיות (10-15), גוון (0), איזון לבן, רוויה (45-50), חדות (0), גמא (5) (איור 2B). ההגדרות ששימשו במחקר זה היו כדלקמן: בהירות (64), ניגודיות (14), גוון (0), רוויה (47), חדות (0), גמא (5). הערה: יש לכוונן את הגדרות המצלמה לאור חיצוני כדי להבטיח את איכות התמונה הטובה ביותר. ניתן להתאים את ההגדרות בהתאם לתנאי המשתמש בתא הגידול.</li>
	<li>קבעו את הגדרות לכידת התמונה על-ידי לחיצה על הסמל של Image Capture (איור 2C, בעיגול חלק 2). לחצו על כפתור הווידאו בהילוך מהיר והגדירו לכידת תמונה כל 15 דקות למשך 24 שעות (איור 2C). הערה: המרווח בין התמונות שצולמו לבין משך ההדמיה גמיש לחלוטין וניתן להתאים אותו בהתאם לצרכי הניסוי. בזמן שבין לכידת התמונה, נורית ה-LED כבויה. נורית ה-LED נדלקת באופן אוטומטי במהלך צילום תמונה.</li>
	<li>התחל ללכוד תמונות על-ידי לחיצה על לחצן התחל (איור 2C). הערה: לאחר העברתם מ 28 ° C ל 22 ° C, צמחים צריכים להתחיל לפתח נגעים בתוך 24 שעות. אם לא, זה יכול להיות סימן לחיסון לא יעיל. התאימו את כמות אבקת הקרבורונדום, ודאו שזמן הדגירה של החיסון על העלים היה נכון, וקבעו את שפע הנגיף בחיסון על ידי qPCR.</li>
	<li>לשמירת תמונות, בחרו בכל התמונות ולחצו על סמל השמירה (איור 2B, בעיגול חלק 3). הגדר אפשרויות ייצוא. הגדר DPI לכל היותר (300) (איור 2D). לאחר השמירה, מחק את כל התמונות בתוכנית.</li>
	<li>עבור ניתוח תמונה, כל תוכנית לצפייה/עריכה של תמונות מספיקה. השימוש בתוכנה חופשית לעריכת תמונות, ImageJ, מוסבר להלן.<ol><li>ייבא את רצף הזמן של תמונות משדה ראייה יחיד (בפינה השמאלית העליונה, לחץ על קובץ, בחר ייבוא ולאחר מכן רצף תמונות). הדבק את הנתיב של ספריית התמונות שנשמרו ולחץ על בסדר כפתור כדי להתחיל את ההמרה.</li>
		<li>לאחר ההמרה, התוכנה פותחת באופן אוטומטי נגן וידאו פנימי המציג את הווידאו הסופי. ייצא את קובץ הווידאו על ידי לחיצה על קובץ > שמור כ אפשרות ובחירה בפורמט AVI. חלון קטן נפתח. הגדר את קצב מסגרות כ- 0.3 fps ולחץ על אישור כדי לשמור את הווידאו כקובץ וידאו AVI. הערה: ניתן לקבוע את זמן התפתחות הנגע גם על ידי בדיקה ידנית של כל התמונות ומציאת תמונה שבה הנגע מופיע.</li>
	</ol></li>
</ol>

כימות התחלת מוות תאי באמצעות הדמיה רציפה

<ol><li>Karasev, A. V., Gray, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+emerging+challenges+of+potato+virus+y+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Continuous and emerging challenges of potato virus y in potato.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 571-586 (2013).</li>
<li>Quenouille, J., Vassilakos, N., Moury, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+Y%3A+A+major+crop+pathogen+that+has+provided+major+insights+into+the+evolution+of+viral+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Potato virus Y: A major crop pathogen that has provided major insights into the evolution of viral pathogenicity.</a> Molecular Plant Pathology. 14 (5), 439-452 (2013).</li>
<li>Szajko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+gene+Ny-1+on+potato+chromosome+IX+confers+hypersensitive+resistance+to+Potato+virus+Y+and+is+an+alternative+to+Ry+genes+in+potato+breeding+for+PVY+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">The novel gene Ny-1 on potato chromosome IX confers hypersensitive resistance to Potato virus Y and is an alternative to Ry genes in potato breeding for PVY resistance.</a> Theoretical and Applied Genetics. 116 (2), 297-303 (2008).</li>
<li>Szajko, K., Strzelczyk-Żyta, D., Marczewski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ny-1+and+Ny-2+genes+conferring+hypersensitive+response+to+potato+virus+Y+%28PVY%29+in+cultivated+potatoes%3A+Mapping+and+marker-assisted+selection+validation+for+PVY+resistance+in+potato+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">Ny-1 and Ny-2 genes conferring hypersensitive response to potato virus Y (PVY) in cultivated potatoes: Mapping and marker-assisted selection validation for PVY resistance in potato breeding.</a> Molecular Breeding. 34 (1), 267-271 (2014).</li>
<li>Lukan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+is+not+sufficient+for+the+restriction+of+potato+virus+Y+spread+in+hypersensitive+response-conferred+resistance+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Cell death is not sufficient for the restriction of potato virus Y spread in hypersensitive response-conferred resistance in potato.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 168(2018).</li>
<li>Baebler, Š, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+is+an+indispensable+component+of+the+Ny-1+resistance-gene-mediated+response+against+Potato+virus+y+infection+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid is an indispensable component of the Ny-1 resistance-gene-mediated response against Potato virus y infection in potato.</a> Journal of Experimental Botany. 65 (4), 1095-1109 (2014).</li>
<li>Lukan, T., Coll, A., Baebler, Š, Gruden, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virus+spread+around+the+cell+death+zone+at+spatiotemporal+resolution+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virus spread around the cell death zone at spatiotemporal resolution using confocal microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 2447, 261-270 (2022).</li>
<li>Vinterhalter, D., Dragiüeviü, I., Vinterhalter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+in+vitro+culture+techniques+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Fruit%2C+Vegetable+and+Cereal+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potato in vitro culture techniques and biotechnology.</a> Fruit, Vegetable and Cereal Science and Biotechnology. 2, Special Issue 16-45 (2008).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+plant+immune+responses+by+a+central+circadian+regulator%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Timing of plant immune responses by a central circadian regulator).</a> Nature. 470, 110-115 (2011).</li>
<li>Roden, L. C., Ingle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lights%2C+rhythms%2C+infection%3A+The+role+of+light+and+the+circadian+clock+in+determining+the+outcome+of+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lights, rhythms, infection: The role of light and the circadian clock in determining the outcome of plant-pathogen interactions.</a> Plant Cell. 21 (9), 2546-2552 (2009).</li>
<li>Srivastava, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+circadian+rhythm+in+plant+system%3A+An+update+from+development+to+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Role of circadian rhythm in plant system: An update from development to stress response.</a> Environmental and Experimental Botany. 162, 256-271 (2019).</li>
<li>Mulaosmanovic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+detection+and+quantification+of+lesions+on+leaf+scale+based+on+trypan+blue+staining+and+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for detection and quantification of lesions on leaf scale based on trypan blue staining and digital image analysis.</a> Plant Methods. 16, 62(2020).</li>
<li>Martinelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+of+plant+disease+detection.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+for+Sustainable+Development%22%5BJournal%5D)">Advanced methods of plant disease detection. A review.</a> Agronomy for Sustainable Development. 35, 1-25 (2015).</li>
<li>Ali, M., Bachik, N., Muhadi, N. A., Tuan Yusof, T. N., Gomes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-destructive+techniques+of+detecting+plant+diseases%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Non-destructive techniques of detecting plant diseases: A review.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 108, 101426(2019).</li>
<li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Computers+and+Electronics+in+Agriculture%22%5BJournal%5D)">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Computers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>Rowarth, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+analysis+reveals+potential+regulators+of+programmed+cell+death+and+leaf+remodelling+in+lace+plant+%28Aponogeton+madagascariensis%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq analysis reveals potential regulators of programmed cell death and leaf remodelling in lace plant (Aponogeton madagascariensis).</a> BMC Plant Biology. 21 (1), 375(2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

הפרוטוקול שהודגם מאפשר למשתמש לקבוע במדויק את קצב התחלת המוות התאי על ידי הדמיה רציפה של עלים מחוסנים בזמן שבין התחלת המוות התא לבין הופעת המוות התאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. למרות שישנן דרכים רבות לניטור התרחשות נגעים ומחלות צמחים12,13,14,15, פרוטוקול זה מציג את היתרון של מדידה שאינה תלויה באור מבלי להפריע לשעון הביולוגי של הצמח, מכיוון שהאור כבוי בין מדידות.
לאחר החיסון, צמחים צריכים לגדול ב 28 °C (78 °F) במשך 3 ימים. גן עמידות Ny-1 , המשרה תגובה רגישה, תלוי טמפרטורה, ובצמחים הגדלים בטמפרטורות גבוהות יותר, מוביל להפלה של עמידות, המתבטאת בחוסר היווצרות נגעים והתפשטות וירוס מערכתית3. לאחר העברת צמחים ל -22 מעלות צלזיוס, מוות תאי מתחיל, ולכן לקבלת תוצאות מדויקות, תצפית במיקרוסקופ דיגיטלי צריכה להתחיל בהקדם האפשרי לאחר העברה זו. שלב מכריע נוסף בהכנת הצמח לדימות הוא אימוביליזציה של העלה (איור 1D), מאחר שהצמח ימשיך לגדול במהלך ההדמיה, מה שעלול להוציא את העלה הנצפה ממיקוד, או שמיקום כזה לא ייתן את התוצאות הרצויות.
אם הפרוטוקול המתואר משמש על צמחים טרנסגניים עם מרכיבים שונים של עניין, משוער להיות מעורב בהתחלת מוות תאי, הפרוטוקול מאפשר למשתמש לקבוע אם הרמה הנמוכה של רכיב נחקר משפיעה על קצב התחלת מוות תאי. על ידי כך, ניתן לזהות רכיבים המעורבים בהתחלת מוות תאי בפתו-מערכות, שבהן מתרחש מוות תאי מתוכנת, באמצעות פרוטוקול זה. שיטות אחרות לזיהוי רכיבים אלה הן, למשל, ניתוח שעתוק כגון RNA-seq או צורות שונות של מיקרוסקופיה, אשר יכול להיות יקר זמןרב 16. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת זיהוי קל וזול של רכיבים המעורבים בהתחלת מוות תאי על ידי התבוננות בהבדלים בשיעורי התחלת מוות תאי בין צמחים טרנסגניים לצמחי ביקורת. באופן אופטימלי, במערך כזה, יש להשתמש בשתי מצלמות דיגיטליות, שכן יש לנתח צמח מהונדס במקביל למפעל בקרה באותו ניסוי.
בפרוטוקול זה נעשה שימוש בזן PVY N-Wilga; עם זאת, זנים אחרים של וירוס זה, למשל, GFP מתויג PVY (PVY-N605(123)-GFP)7, יכול לשמש גם. יתר על כן, פתו-מערכות אחרות, הגורמות להתפתחות מוות תאי מתוכנת, יכולות להיחקר באמצעות פרוטוקול זה עם שינויים קלים.

תפוח אדמה הוא אחד מגידולי המזון הנפוצים ביותר בעולם, מקום רביעי אחרי אורז, חיטה ותירס. עם זאת, ייצור תפוחי אדמה יכול להיות מושפע קשות על ידי וירוס תפוחי אדמה Y (PVY), אשר נחשב כיום פתוגן הנגיף החשוב ביותר שלה 1,2. בצמחי תפוחי אדמה cv. Rywal, מספר זנים של PVY (כולל זן PVY N-Wilga) מעוררים תגובה רגישה (HR) - התנגדות המוענקת, כאשר הגבלת הפתוגן לאתר הזיהום מתבטאת בנגעים נמקיים על עלים מחוסנים3. בפתומערכת זו, HR מתווך על ידי גן עמידות Ny-1, שהוא תלוי טמפרטורה, שכן צמחים הגדלים בטמפרטורות נמוכות יותר מפתחים ביעילות נגעים נמקיים, ואילו בצמחים הגדלים באופן קונסטיטוטיבי בטמפרטורה גבוהה (28 מעלות צלזיוס), הפלה של עמידות מודגמת כחוסר היווצרות נגעים והתפשטות וירוס מערכתית 3,4. כאשר הצמחים מועברים לטמפרטורה נמוכה יותר (22 מעלות צלזיוס), מתחיל מוות תאי, אשר יכול להיות מנוצל כדי לעקוב אחר קצב התחלת המוות התא על ידי הדמיה של עלים מחוסנים בזמן שבין התחלת המוות התא לבין הופעת המוות התאי.
פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה לקביעת קצב התחלת מוות תאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. על ידי הדמיה של העלים המחוסנים לאחר העברת הצמח מ-28 מעלות צלזיוס ל-22 מעלות צלזיוס, מיקרוסקופ דיגיטלי מאפשר תצפית רציפה על העלה בפרקי זמן רצויים. בניגוד לשימוש בשיטות אחרות (למשל, מיקרוסקופ קונפוקלי או תצפית על היווצרות נגעים בעין בלתי), הדבר מאפשר לקבוע את הזמן המדויק של היווצרות הנגע ולכן קצב התחלת המוות התאי עד דקות בדיוק, בניגוד לשעות בשיטות הנ"ל 5,6. גם השימוש במיקרוסקופ דיגיטלי אינו תלוי באור ולכן ניתן להשתמש בו ביום ובלילה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לזיהוי רכיבים המעורבים בהתחלת מוות תאי או כדי לקבוע את ההשפעות של רכיבים שונים על קצב התחלת מוות תאי אם צמחים משומשים הם טרנסגניים ויש להם רמות שונות של רכיבים מעניינים.

<table><tbody><tr><td>מבער אלכוהול</td><td>Mikro+Polo</td><td>SH-234002455</td><td>לפינצטה ועיקור אזמל</td></tr><tr><td>Autoclave A-21 CAV</td><td>Kambi<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65824/65824eq01.jpg" style="margin: auto; "></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>אבקת קרבורונדום</td><td>VWR Chemicals</td><td>22505297</td><td></td></tr><tr><td>DinoCapture 2.0 </td><td>תוכנת Dino-Lite</td><td>גרסה 2.0</td><td>למיקרוסקופ</td></tr><tr><td>דיגיטלי Dino-Lite Edge AM7915MZTL מיקרוסקופ דיגיטלי</td><td>AnMo Electronics Corporation</td><td>AM7915MZTL</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, 70%</td> <td>Stella Tech</td><td>P94000</td><td>לפינצטה ועיקור אזמל</td></tr><tr><td>שקיות מיצוי</td><td>Bioreba</td><td>420100</td><td></td></tr><tr><td>תא צמיחה FS-WI</td><td>מערכות פוטון התקנות</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר ידני</td><td>Bioreba</td><td>400010</td><td></td></tr><tr><td>Hawita מצע מיוחד</td><td>HAWITA Gruppe</td><td>2000000071701</td><td>מצע מוכן לשימוש, עשוי באמצעות כבול (H4-H6 ו-H6-H8)</td></tr> <tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td> <td>Merck</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>סרט תווית</td><td>Sigma</td><td>L8144-5EA</td><td></td></tr><tr><td>מחשב נייד עם DinoCapture 2.0 </td><td>מחשב HP</td><td>Z2V77EA#BED</td><td>צריך להיות ניתן להעברה מכיוון שהניסוי לוקח חלק בתא גידול</td></tr><tr><td>Murashige ו-Skoog medium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M02220100</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Emsure</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Emsure</td><td>1064700250</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur פיפטה  0.5 מ"ל</td><td>מותג</td><td>21500209</td><td></td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML1601</td><td></td></tr><tr><td>קופסאות פלסטיק </td><td>Cvetlice Dornig</td><td>VCG10.5</td><td>רדיוס = 10.5 ס"מ</td></tr><tr><td>סירי פלסטיק </td><td>Lab Associates</td><td>DIS40003</td><td>רדיוס = 11.5 ס"מ (למעלה), רדיוס = 9.8 ס"מ (למטה)</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Kemika d.d.</td><td></td><td></td>1800408</tr><tr><td>נתרן דיאתילדיתיוקרבמט (DIECA)</td><td>Sigma-Aldeich</td><td>228680</td><td>נתרן דיאתילדיתיוקרבמט טריהידרט, מגיב ACS</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>להבים כירורגיים סטריליים</td><td></td> פינצטה <td>4511733633</td><td></td></tr><tr><td></td><td>בראון</td><td>BD033R</td><td></td></tr></tbody></table>

חקר התחלת מוות תאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי

Studying Cell Death Initiation Using a Digital Microscope

תגובת רגישות יתר (HR) היא תגובת הגנה יעילה שניתן לקבוע על ידי הגנים של עמידות N . HR מתבטא בהיווצרות אזורי מוות של תאים על עלים מחוסנים. כאן מוצג פרוטוקול לחקר קצב התחלת המוות התאי על ידי הדמיית עלים מחוסנים בזמן שבין התחלת המוות התאי לבין הופעת המוות התאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. המיקרוסקופ הדיגיטלי מאפשר תהליך הדמיה רציף בפרקי זמן רצויים, המאפשר קביעה מדויקת של קצב התחלת מוות תאי עד דקות בדיוק, בניגוד לשעות בשיטות מסורתיות. גם הדמיה במיקרוסקופ דיגיטלי אינה תלויה באור ולכן ניתן להשתמש בה ביום ובלילה מבלי להפריע לשעון הביולוגי של הצמח. ניתן לחקור פתו-מערכות שונות הגורמות להתפתחות מוות תאי מתוכנת באמצעות פרוטוקול זה עם שינויים קלים. בסך הכל, הפרוטוקול מאפשר זיהוי פשוט, מדויק וזול של שיעור התחלת מוות תאי.

מחקר זה מדגים פרוטוקול שלב אחר שלב לחקר התחלת מוות תאי באמצעות התרחשות נגעים בקורות חיים של תפוחי אדמה. ריוול, עם מיקרוסקופ דיגיטלי. זה מאפשר לקבוע את הזמן המדויק של התחלת מוות תאי מתוכנת.
צמחים שפיתחו שורשים הוכנסו לאדמה שבועיים לאחר קורות חיים של תפוחי אדמה. מיקרו-התפשטות של ריוול (איור 1A,B). לאחר 3-4 שבועות של צמיחה בתנאים המתוארים, צמחים עם לפחות 3-4 עלים מפותחים לחלוטין עם עלעלים נראים לעין שנראו בריאים, ללא סימני אבסציה, שימשו לניתוח נוסף (איור 1C). באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי כפי שמתואר בפרוטוקול זה, צפינו באותו אזור על העלה המחוסן במרווחים של 15 דקות וקבענו את התרחשות הנגע והתפשטותו בזמן (איור 3). הנגע התרחש לאחר 15 שעות ו-30 דקות (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig01.jpg"> איור 1: הכנת צמחים לניתוח באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי . (A) קופסת פלסטיק עם MS 30 בינוני ותפוח אדמה. צמחים Rywal צמחים המכילים צמתים. (ב) קורות חיים של תפוח אדמה. צמח Rywal באדמה (2 שבועות לאחר micropropagation). (ג) קורות חיים של תפוח אדמה. צמח Rywal, מוכן לחיסון (4 שבועות לאחר שהוכנס לאדמה), בעל לפחות שלושה עלים מפותחים. (D) עלה מחוסן שני (חץ) של קורות חיים של תפוח אדמה. מפעל ריוול מוצב ומשותק (חץ) בנייר דבק. (E) צמח הממוקם מתחת למיקרוסקופ הדיגיטלי כשהחץ מצביע על החוגה המשמשת להתמקדות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig02.jpg"> איור 2: הגדרת תוכנה דיגיטלית להקלטת התפתחות נגעים. (A) ממשק תוכנה - בעיגול אדום הן אפשרויות ללחצן עבור (1) הגדרות מצלמה, (2) הגדרות לכידת תמונה ו- (3) שמירת תמונות. (B) חלון עם הגדרות מצלמה, שנפתח בלחיצה על (1) בלוח A. יש לכוונן כראוי את הבהירות, הניגודיות, הרוויה, החדות והגמא. (C) חלון עם הגדרות לכידת תמונה, שנפתח בלחיצה על (2) המסומנת בלוח A. (D) חלון עם הגדרות שמירת תמונה, שנפתח בלחיצה על (3) המסומנת בלוח A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65824/65824fig03.jpg"> איור 3: היווצרות נגעים על העלה המחוסן שנצפתה במיקרוסקופ הדיגיטלי. תמונות של החלק המרכזי של עלה תפוח אדמה מחוסן PVY בהגדלה של פי 23.6 כפי שניתן לראות במיקרוסקופ הדיגיטלי, שצולמו במרווחים של 5 דקות. צמחים מחוסנים הונחו על 28 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים, וביום השלישי, התצפית עם מיקרוסקופ דיגיטלי ב 22 מעלות צלזיוס החלה בשעה 7:00. (A) בשעה 21:02 הנגע עדיין לא נראה לעין, (B) 90 דקות לאחר מכן, בשעה 22:32, הנגע גלוי. (C) התרחבות הנגע נצפתה בשעה 01:02 ו-(D) בשעה 07:32 למחרת בבוקר. הניסוי חזר על עצמו פעמיים, והנגעים התרחשו 8 שעות ו-15 דקות, ו-12 שעות לאחר תחילת המוות הסלולרי, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65824/65824fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקר קצב התחלת מוות תאי מתוכנת על ידי הדמיה רציפה של עלים מחוסנים לאחר השראת מוות תאי.

Hypersensitive response (HR)-conferred resistance is an effective defense response that can be determined by the N resistance genes. HR is manifested as ...

כדי להתחיל, להעביר את צמחי תפוחי אדמה נגועים וירוס לתא גידול נשמר על 22 מעלות צלזיוס. בחרו צמח להשגחה והשתמשו בסרט הדבקה כדי לשתק לחלוטין את העלה המחוסן השני. לאחר מכן, חבר את המיקרוסקופ הדיגיטלי למחשב והפעל את תוכנת לכידת התמונה.מניחים את העלה מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן השתמש בחוגה כדי להתמקד בפני השטח של העלה. כדי לכוונן את הגדרות המצלמה, לחץ על לחצן ההגדרות.כעת הגדר את הבהירות ל- 64, את הניגודיות ל- 14 ואת הגוון לאפס. לאחר מכן, התאם את האיזון הלבן, ולאחר מכן הגדר את הרוויה ל 47, חדות לאפס וגמא לחמש. לחץ על סמל לכידת התמונה ובחר אפשרות וידאו שחלף זמן.לאחר מכן, הגדר לכידת תמונה לכל 15 דקות למשך 24 שעות בסך הכל. לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל בלכידת התמונה. לשמירת התמונות שצולמו, בחרו בכל התמונות ולחצו על סמל השמירה.כעת בחר את אפשרויות הייצוא, ולאחר מכן הגדר נקודות לאינץ 'למקסימום. לאחר השמירה, מחק את כל התמונות מהתוכנית. כדי לערוך את התמונות, הפעל תוכנת עריכה כמו ImageJ.לחץ על קובץ, לאחר מכן בחר ייבוא, ובחר רצף תמונות כדי לייבא את רצפי הזמן של תמונות משדה ראייה יחיד. הדבק את הנתיב של ספריית התמונות השמורות ולחץ על אישור. לאחר השלמת ההמרה, ImageJ תפעיל באופן אוטומטי נגן וידאו פנימי המציג את הסרטון המוגמר.לחץ על קובץ ולאחר מכן שמור בשם ובחר את פורמט AVI לייצוא קובץ הווידאו. כאשר נפתח חלון קטן, הגדר את קצב המסגרות ל- 0.3 FPS ולאחר מכן לחץ בסדר כדי לשמור את הווידאו כקובץ AVI. צמחי תפוחי אדמה מחוסנים בני שלושה עד ארבעה שבועות עם לפחות שלושה עד ארבעה עלים מפותחים לחלוטין שימשו לניתוח מיקרוסקופי דיגיטלי.אותו אזור על העלה המחוסן נצפה במרווחים של 15 דקות כדי לקבוע את הופעת הנגע והתפשטותו לאורך זמן. לאחר 14 שעות של תצפית לא נראה נגע. כ-90 דקות לאחר מכן נרשם נגע גלוי.הנגע החל להתרחב כעבור שעתיים, והמשיך להתפשט בשמונה וחצי השעות הבאות.

studying-cell-death-initiation-using-a-digital-microscope

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים פרוטוקול פשוט לדמיין אזורים של מות תאים מתוכן (PCD) בעוברי עכברים ומבדילים (ES) תרבויות תאי גזע עובריות באמצעות צבע מסיס מאוד בשם LysoTracker.

שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

כאן אנו מתארים שיטה יעילה ללימוד דינמיקה של פינוי תאים...

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

הפעילות ציטוטוקסית של phenanthridine PJ-34 בתאים סרטניים שעברו מיטוזה תועדה בזמן אמת על ידי ההדמיה confocal חי. סרטן PJ-34 להכחיד אנושי שד מד"א-MB-231 תאי מחסה Extra-centrosomes במיטוזה. בניגוד למיטוזה דו מוקדי רגילים, את centrosomes במיוחד לא התקבצו בשני קטבי הכישור בנוכחות של PJ-34.

מוות של תאים הקשורים מיטוזה חריגה נצפה על ידי ההדמיה Confocal בתאי סרטן חיים

המונח אנסטאזיס מתייחס לתופעה שבה תאים גוססים הופכים תהליך התאבדות של תאים בשלב מאוחר, מתקנים את עצמם ובסופו של דבר שורדים. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים לאיתור ומעקב אחר תאים שעוברים אנסטאזיס.

אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

מחקר על קרינה מייננת (IR)-מוות של תאים clonogenic המושרה חשוב להבנת השפעת IR על גידולים ממאירים ורקמות נורמלי. כאן, אנו מתארים וזמינותו של צעד אחד לשם הערכת המצבים העיקריים של מוות של תאים clonogenic IR-induced בהתבסס על המורפולוגיה של 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי)-צבעונית גרעינים דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.

פרוטוקול בשלב אחד עבור הערכת המצב של מוות של תאים Clonogenic קרינה הנגרמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

. מדווחים שיטות אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע necroptosis כולל מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי לחיות תאים הדמיה, סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, ואיגוד מבוסס-NMR השומנים.

אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לפקח על הישרדות על בסיס תא בודד ולזהות משתנים באופן משמעותי לחזות מוות של תאים.

ניטור הישרדות עצביים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות האורך

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית לחקור ולכמת מוות תאי באורגנואידים אנושיים של המעי הגס בתגובה להפרעות ציטוטוקסיות כגון ציטוקינים. הגישה משתמשת בצבע מוות פלואורסצנטי של תאים (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), במיקרוסקופ פלואורסצנטי חי ובתוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח כדי לכמת תגובות אורגנואיד יחיד לגירויים ציטוטוקסיים.

כימות מוות תאי הנגרם על ידי ציטוקינים באורגנואידים של המעי הגס האנושי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי

פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה של תאים חיים לניטור חדירות הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס, תוך שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות המזהות שינויים בשלמות הממברנה הליזוזומלית והחמצתה.

הדמיית תאים חיים של חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס

חקור את קצב התחלת מוות תאי בתפוחי אדמה באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. פרוטוקול זה מאפשר תיעוד רציף של היווצרות פצעונים ומספק כלי יעיל לחקר מנגנוני ההגנה הצמחיים.

חקר התחלת מוות תאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי

גלה סרטונים נוספים