אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה
13 באוקטובר 2023
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.
לאחרונה, גנים רבים המועמדים לאפילפסיה נמצאו בבדיקות גנטיות ולאחר מכן בקלות בניסויים בבעלי חיים. אנו מספקים סדרה של טכניקות לחקר הפעילות העצבית הקשורה לאפילפסיה, כולל הקלטה של תאים שלמים, הקלטת EPSP מעוררת והחדשה שנציג כאן, הדמיית סידן ex vivo. מכיוון שלא ניתן לשכפל את שלמות המוח והרשתות העצביות שלו במלואן בתרבית תאים או בפרוסות מוח, היתרון העיקרי של הניסוי הנוכחי הוא קבלת רקמת מוח שלמה תוך הגנה על רשתות עצביות מפני נזק.
ביססנו טכניקת דימות סידן ex vivo יחד עם בדיקת התנהגות דמוית התקף רגישה לפלסטר לסינון יעיל של הגנים הקשורים לאפילפסיה וחקירת המנגנונים הבסיסיים של אפילפסיה ברמה התאית. יישמנו רקמות מוח דרוזופילה מבודדות ושלמות להדמיית סידן, שיכולות להימנע מטכניקות הניתוח המורכבות שלהן ולשמר את שלמות הרשתות העצביות. וגישת ex vivo יכולה גם להניב יחס אות לרעש מעולה בהשוואה לטכניקות הדמיה in vivo.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לדימוי סידן ex vivo בבוגרי Drosophila המבטאים GCaMP6, במטרה לחקור פעילויות אפילפטופורמיות. השיטה שואפת לנטר אירועים איקטליים ב-Drosophila, ובכך לספק תובנות לגבי המנגנונים התאיים העומדים בבסיס האפילפסיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- מחקר אפילפסיה
- דימוי סידן
רקע
- גנים מועמדים לאפילפסיה דורשים תיקוף באמצעות מודלים של בעלי חיים.
- טכניקות ex vivo שומרות על רשתות עצביות שלמות, דבר שהוא קריטי לחקר אפילפסיה.
- דימוי סידן (Calcium imaging) מציע איכות אות מעולה בהשוואה לגישות in vivo.
- Drosophila משמשת כארגון מודל רלוונטי למחקרי פעילות עצבית.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקות לדימות סידן ex vivo ב-Drosophila.
- סריקת גנים הקשורים לאפילפסיה ובחינת המנגנונים העצביים שבבסיסם.
- מדידה כמותית של התנהגויות דמויות פרכוסים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה העיקרית שבה נעשה שימוש היא דימוי סידן ex vivo של רקמות מוח שלמות של Drosophila.
- המודל הביולוגי מורכב מזבובי Drosophila בוגרים המבטאים GCaMP6.
- מסופקים פרוטוקולים מפורטים לדיסקציית המוח, להגדרת מערך הדימוי ולניתוח הנתונים.
- נעשה שימוש במבחנים התנהגותיים להערכת פעילות דמוית פרכוסים.
- מדדים כמותיים, כגון עצימויות פלואורסצנציה, נותחו באמצעות ImageJ.
תוצאות עיקריות
- אותות סידן נצפו בנוירונים של גוף הפטרייה (mushroom body), תוך התמקדות בהבדלים בין זבובים עם knockdown לבין זבובים מסוג wild-type.
- זבובים עם Cac knockdown הפגינו פעילות דמוית פרכוסים מוגברת באופן משמעותי וזמני התאוששות שונים.
- נתוני פלואורסצנציה מעידים על עלייה בשיאים (spikes) גדולים בקבוצת ה-knockdown, מה שמספק תובנות מכניסטיות לגבי אפילפסיה.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים ללמוד על מנגנוני פרכוסים ב-Drosophila, ובכך מקל על תיקוף גנים במחקר על אפילפסיה.
- הבנת דפוסי איתות הסידן מספקת תובנות לגבי עירור נוירונלי ומטרות טיפוליות פוטנציאליות.
- הממצאים מרחיבים את הידע על מנגנוני אפילפסיה באמצעות גישת דימוי חזקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי סידן ex vivo ב-Drosophila המבטאת GCaMP6 מאפשר חקירה תפקודית ישירה של גנים הקשורים לאפילפסיה בתוך רשתות עצביות שלמות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי קישור בין הפרעות גנטיות לבין פעילות עצבית מדידה והתנהגויות דמויות פרכוסים. השיטה תומכת בקבלת החלטות בשלבים מוקדמים של תיקי פיתוח על ידי אספקת תובנות מכניסטיות לגבי מסלולים רלוונטיים למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של גנים מועמדים לאפילפסיה במודל שניתן לניפולציה גנטית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור בין השתקה גנטית (knockdown) לשינויים בפעילות העצבית.
- מסייע בהבהרת מסלולים ביולוגיים באמצעות דימוג כמותי של מעגלים עצביים שלמים.
- מספק ביטחון חיזוי לקידום מטרות גנטיות בהפרעות נוירולוגיות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מקימה פלטפורמה ניתנת לשחזור לסריקת השפעות של גנים פתוגניים על פעילות עצבית.
- מספק פלטים כמותיים, כגון תדירות פריקה (spike frequency) ועוצמת פלואורסצנציה, לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך תהליכי עבודה של סריקת תרכובות או סריקה גנטית בהמשך.
- מאפשר השוואה מהימנה בין פנוטיפים של סוג בר (wild-type) לבין פנוטיפים מוטנטיים בסביבת ex vivo מבוקרת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה דפוסי פעילות עצבית הרלוונטיים למחלה לפנוטיפים התנהגותיים לצורך רציפות תרגומית.
- תומך בקידום מותאם-סיכון באמצעות יצירת מתאם בין מנגנונים תאיים לבין התנהגויות פרכוס ניתנות לצפייה.
- מספק גשר בין גילוי גנטי לבין תיקוף של מודלים פרה-קליניים במחקר על אפילפסיה.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
פרוטוקול דימות ex vivo זה משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד למחקרים מכניסטיים פרה-קליניים, ותומך הן בבדיקת השערות והן בפנוטיפיקה כמותית.
- ביולוגיה של תגליות: מאפשרת בחינה מבוססת היפותזה של תפקוד גנים במעגלים עצביים הרלוונטיים לאפילפסיה.
- סריקה: מספקת מדדים כמותיים וסטנדרטיים להשוואת התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות.
- אנליטיקה: מספקת פלטים מדידים, כגון סיווג ספייקים (spike classification) ועוצמת פלואורסצנציה, לצורך ניתוח סטטיסטי חסון.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שינויים בפעילות תאית לבין פנוטיפים התנהגותיים של פרכוסים, ובכך תומך בהתאמה של סממנים ביולוגיים (biomarkers).
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור גנומיקה תפקודית וסריקת פעילות עצבית במגוון מטרות גנטיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות פעילות עצבית לצורך הדירות ויכולת הרחבה בשלבי הגילוי המוקדמים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go באמצעות קישור הפרעות גנטיות לתוצאות עצביות כמותיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מטרות גנטיות לאפילפסיה לצורך פיתוח נוסף.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגנטיקה של Drosophila ובטכניקות של דימיג קונפוקאלי.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה קונפוקאלית ולכלים לניתוח תמונות כמותי.
- נחוץ סטנדרטיזציה בין-צוותית של סיווג spikes ומבחנים התנהגותיים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול לשמירה על שלמות הרקמה ולפרמטרי דימיג.
- הפרשנות מוגבלת למעגלים עצביים ולהתנהגויות המודלים ב-Drosophila כפי שנתמך על ידי הפרוטוקול.
