Name: בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 49 s
Description: למד שיטה אופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידול מוצק טריות וקפואות לריצוף מולטיומי. פרוטוקול זה משפר את איכות הנתונים ומאפשר ניתוח מיקרו-סביבתי מדויק של הגידול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות למתקן הגנומיקה הפונקציונלית של סטנפורד (SFGF), במיוחד לדהננג'אי וואג וג'ון קולר, ול-10x Genomics על עזרתם במיטוב הניסויים שלנו. ברצוננו גם להודות לד"ר ג'ורג' פולטסיידס, מוניקה דואה, ברנדן ויסר ובירן לי על עזרתם בהשגת דגימות מטופלים. ברצוננו להודות לארט ולאיליין טיילור, קרן רנץ, וורן וג'ודי קפלן על תמיכתם הנדיבה במאמצי המחקר שלנו. מקורות המימון כוללים מענקי NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), קרן גולדמן זאקס (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), הקרן לחקר הסרטן ע"ש דיימון ראניון (D.D., M.T.L.), קרן גאן/אוליבייה, המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה, קרן סטיינהרט/ריד ומעבדת הייגי לרפואה רגנרטיבית בילדים. הריצוף הושג באמצעות מכונות שנרכשו בקרנות NIH (S10OD025212, S10OD018220 ו- 1S10OD01058001A1).

דגימות סרטן הלבלב האנושי (אדנוקרצינומה של צינור הלבלב) נרכשו על פי פרוטוקול שאושר על ידי IRB במעבדה שלנו. התקבלה הסכמה מדעת של המטופלים לאיסוף רקמות. הרקמה הועברה מחדר הניתוח למעבדה ולאחר מכן טופלה באופן הבא.
1. דיסוציאציה רקמות (עיכול)
<ol><li>הכן את מאגר Digest (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>השג את הרקמה המעניינת בהקדם האפשרי לאחר כריתת הגידול והעביר את הדגימה במאגר מרווה (DMEM F-12 עם ~ 5% נסיוב בקר עוברי) או 1x PBS על קרח.</li>
	<li>טחנו את הרקמה באמצעות מלקחיים נקיים ומספריים ב-3-5 מ"ל של חיץ Digest בצלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ (איור 2A).</li>
	<li>מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור חרוטי של 50 מ"ל ומנתקים ב~10 מ"ל של חיץ Digest למשך 30 דקות ב-37°C באמצעות אמבט מים עם פונקציית רעד או תסיסה יבשה.</li>
	<li>הסר מן התסיסה להרוות עם ~ 20 מ"ל של מדיום מרווה. סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי.</li>
	<li>אספו את כל הרקמה המוצקה שנותרה מהמסננת (טחנו מחדש את חתיכות הרקמה הנותרות במידת הצורך), והניחו ב~10 מ"ל של חיץ Digest טרי למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 37°C עם תסיסה. חזור על הפעולה עד שכל רקמת הגידול מנותקת.</li>
	<li>תרחיף תאי הבריכה מתעלים ומסננים דרך 70 מיקרומטר ואחריו מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant supernatant.</li>
</ol>2. שימור בהקפאה
<ol><li>לשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הגלולה ב 1 מ"ל של 1x PBS.</li>
	<li>העבר את תרחיף התא (~ 1-10 מיליון תאים / צינור להקפאה אופטימלית) לקריביאל של 1.5 מ"ל על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant supernatant.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים ב-1 מ"ל של תמיסת במבנקר, העבר לקריביאל של 1.5 או 2 מ"ל (איור 2B), והקפיא באמצעות מיכל הקפאה בקצב קירור של -1°C/min (המכיל 100% אלכוהול איזופרופיל) ב-80°C-, או העבירו לחנקן נוזלי אם צפוי אחסון ארוך טווח של הדגימה.</li>
</ol>3. בידוד גרעינים
<ol><li>הפשירו במהירות את ההקפאה של תרחיף התאים והניחו אותו על קרח רטוב.</li>
	<li>העבירו את מתלה התאים המופשר לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל ומלאו את הבקבוקון לתמיסת 2 מ"ל ב-1x PBS כדי לשטוף את התאים.</li>
	<li>השיגו ספירת תאים ידנית באמצעות המוציטומטר כדי להעריך הן את כמות התאים והן את איכותם (איור 2C).</li>
	<li>צנטריפוגה לתאי גלולה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן בעדינות decarant supernatant באמצעות קצות פיפטה קטנים יותר ויותר כדי להשאיר מאחור גלולה יבשה ולשמור אותו על קרח.<ol><li>השתמש ברוטור דלי נדנדה עבור כל שלבי הצנטריפוגה. לתפוקת תאים מרבית, הניחו את הצינורות בצנטריפוגה כשהציר פונה החוצה ולאחר מכן דקאנט כשקצה הפיפטה מכוון לצד הנגדי של הצינור (איור 2D). הערה: כדי לנטרל את הסופרנטנט, השתמש בקצוות פיפטה קטנים יותר ויותר כדי להסיר נוזל כדי להגביל את ההפרעה של הגלולה תוך הגדלת נפח הנוזל decanted. אסטרטגיה זו מועילה במיוחד בהמשך הפרוטוקול לאחר מיצוי גרעינים מכיוון שכדורית הגרעינים בדרך כלל אינה נראית לעין.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו 1x מאגר ליזה של תאים, מאגר דילול ליזה של תאים ומאגר שטיפה (איור 3A) בהתאם לפרוטוקול שפורסם עם השינויים הבאים (ראו טבלה 1, טבלת חומרים): הערה: הניחו את הדיגיטונין על גוש חימום בטמפרטורה של 65°C לפני השימוש כדי להמיס את המשקע (איור 3B). פעולה זו נמשכת בדרך כלל כ-10 דקות.</li>
	<li>הכינו את מאגר הליזה של התאים 0.1x על ידי שילוב של 100 μL של 1x Cell Lysis Buffer ו-900 μL של Cell Lysis Dilution Buffer, פיפטה עדינה לערבוב והניחו אותה על קרח.</li>
	<li>יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-100 μL של חיץ ליזיס תאי 0.1x מקורר ולערבב פיפטה עדינה פי 5.</li>
	<li>דגרו על קרח במשך 3 דקות (איור 3C).</li>
	<li>הוסיפו 1 מ"ל של Wash Buffer צונן ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב בעדינות פי 5.</li>
	<li>צנטריפוגה כדי להניע את הגרעינים ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, בעדינות decant supernatant לגלולה יבשה, ולשמור על קרח. הערה: אם מספר התא ההתחלתי נמוך (100,000-200,000 תאים), בצע את שלבי הליזה והשטיפה של התא בצינור PCR של 200 מיקרוליטר במקום בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל כדי להקטין את שטח הפנים של הצינור ולמזער הפסדים. במקרה זה, כוונן את עוצמת הקול של מאגר הכביסה כלפי מטה כדי להתאים לנפח הצינור הקטן יותר.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.9-3.10 2x עבור שלוש כביסות בסך הכל.</li>
	<li>ספור ידנית את הגרעינים באמצעות שקופית המוציטומטר מתחת למיקרוסקופ. השתמש בצבע כחול טריפאן אם תרצה כדי לספק ניגודיות לצפייה בגרעינים וכדי לעזור להבחין בין גרעינים לתאים שלא עברו ניתוח.</li>
	<li>הכינו את מאגר הגרעינים 1x לפי הפרוטוקול שפורסם: מלאי מאגר גרעינים 20x, 1 mM DTT, 1 U/μL RNase Inhibitor במים נטולי נוקלאז ושמרו על קרח (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>השהה מחדש את כדורית הגרעינים במאגר גרעינים 1x בהתבסס על שחזור גרעינים ממוקד מטרה. הערה: אם הריכוז גבוה מספיק, יש לשאוף להתאוששות ממוקדת של 10,000 או מעט גבוה יותר בשלב זה (3,230-8,060 גרעינים/μL) בעת קביעת נפח התרחיף ההתחלתי, בהתחשב באובדן הנפח הצפוי של 25 μL והירידה של 20% בריכוז עם סינון (שלב 3.15).</li>
	<li>העבירו בעדינות את נפח הגרעינים המרחפים מחדש דרך מסננת פיפטה של 40 מיקרומטר והניחו את הגרעינים על קרח (איור 3D).</li>
	<li>ספרו מחדש את הגרעינים (איור 4A-C). דללו את הפתרון הסופי עוד יותר עם Nuclei Buffer במידת הצורך.</li>
	<li>העבירו את הגרעינים על קרח והמשיכו מיד בלכידת גרעינים לפי פרוטוקולים שפורסמו.</li>
</ol>

בידוד גרעינים לריצוף מולטיומי בדגימת גידול מוצק

<ol><li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics+reveal+cancer-associated+fibroblasts+in+glioblastoma+with+protumoral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects.</a> J Clin Invest. 133 (5), e147087(2023).</li>
<li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).</li>
<li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiomic+analysis+reveals+conservation+of+cancer-associated+fibroblast+phenotypes+across+species+and+tissue+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).</li>
<li>Hasan, S., Buechler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+name%3F+An+emerging+framework+for+cancer-associated+fibroblasts%2C+myofibroblasts%2C+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).</li>
<li>Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).</li>
<li>Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).</li>
<li>Januszyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+diabetic+and+non-diabetic+foot+ulcers+using+single-cell+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing.</a> Micromachines (Basel). 11 (9), 815(2020).</li>
<li>Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+relationship+of+wound+healing+and+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">The evolving relationship of wound healing and tumor stroma.</a> JCI Insight. 3 (18), e99911(2018).</li>
<li>Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+of+multiple+brain+cell+types+for+omics+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).</li>
<li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+spatial+multiomics+reveals+fibroblast+fate+during+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).</li>
<li>Leiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+adult+mouse+kidney+for+single-nucleus+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing.</a> J Vis Exp. (175), (2021).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+fresh+frozen+brain+tumors+for+single-nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> J Vis Exp. (162), e61542(2020).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

התרת הסבך של אוכלוסיות התאים ההטרוגניות הקיימות במיקרו-סביבה של הגידול היא תחום פעיל של התמקדות בביולוגיה של סרטן. באופן דומה, רקמות מורכבות קיימות בפתולוגיות שפירות כגון ריפוי פצעים ופיברוזיס. ריצוף Multiome התגלה ככלי רב עוצמה המאפשר רכישה של נתוני scRNA ו- ATAC-seq מזווגים של תאים זהים. פרוטוקול זה מתאר בידוד של גרעינים, הדורש אופטימיזציה בהגדרת עיבוד דגימות גידול טריות, שבריריות וקטנות. כאן אנו מספקים פרוטוקול לבידוד גרעינים מדגימות רקמת גידול מוצקה דסמופלסטית. מצאנו שגישה זו מניבה נתונים אמינים ואיכותיים גם כאשר מתל...

ככל שהידע שלנו על ביולוגיה של הגידול גדל, החשיבות של ניתוח תאים הטרוגניים על פני מיקרו-סביבה של הגידול גדלה גם היא 1,2. היכולת לרכוש RNA חד-תאי והבדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing) מאותו תא בצורה זוגית (ריצוף מולטיום) מספקת התקדמות משמעותית לקראת מטרה זו 3,4. עם זאת, ניסויים אלה יקרים וגוזלים זמן, ואיכות וההשפעה של הנתונים המתקבלים תלויים מאוד באיכות תנאי הניסוי והחומרים. פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד גרעינים פורסמו 5,6. רקמות טריות והטרוגניות דורשות אופטימיזציה של פרוטוקול מכיוון שתאים שבודדו טריים מדגימות גידול מוצקות הם שבירים יותר מאלה שבודדו משורות תאים.
שיקול נוסף הוא שעבור גידולים מוצקים, דגימות כירורגיות לרוב אינן זמינות מחדר הניתוח עד מאוחר ביום. ככזה, זה בדרך כלל לא ריאלי להמשיך ישירות מרכישת דגימה ללכידת גרעינים ללא שלב שימור בהקפאה. מניסיוננו, הקפאת תרחיף חד-תאי מניבה גרעינים באיכות הגבוהה ביותר (ולא רקמה שלמה קפואה בהבזק או שיטות שימור אחרות). זה נכון במיוחד עבור סוגי רקמות אנזימטיות עם תוכן RNase גבוה כגון הלבלב.
תנאי עיכול רקמות צריכים גם להיות מתוכננים כדי למקסם את תפוקת התאים מבלי להקריב איכות7. בהקשר של סוגי גידולים מוצקים עם מטריצות דסמופלסטיות צפופות8, יש לפרק בעדינות את המטריצה החוץ תאית לשחרור תאים. בנוסף, מאחר שסוגי התאים המבודדים הם הטרוגניים, יש להתאים את התנאים לתמיכה באוכלוסיית התאים הכוללת. דגימות סרטן הלבלב האנושי (אדנוקרצינומה של צינור הלבלב) משמשות בפרוטוקול המתואר. סרטן הלבלב מייצג סוג גידול דסמופלסטי מאוד, אשר מבשר רקמות ותאים דביקים יחסית. יתר על כן, מכיוון שדגימות גידול הלבלב הזמינות למחקר נוטות להיות קטנות יחסית, נעשים מאמצים למקסם את כמות התאים שנלכדים.
בידוד גרעינים דורש את האופטימיזציה הרבה ביותר במונחים של תנאי ליזה התא ועיתוי, כמו גם סוגים ויחסים מגיבים. גם הטיפול בגרעינים במהלך הבידוד דורש זהירות רבה. במאמר זה אנו מתארים את הניסיון שלנו במיטוב בידוד גרעיני עבור פלטפורמת ריצוף מולטי-ome 10x Genomics מרקמת גידול מוצקה (איור 1). אנו מספקים המלצות לעיכול רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים (אם רוצים) ובידוד גרעיני.

<table><tbody><tr><td>100, 70 ו-40 &mu; m מסנני תאי פלקון&nbsp;</td><td>&nbsp; ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Genomics Nuclei Buffer (20x)</td><td>10x Genomics</td><td>2000153/2000207</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker&nbsp;</td><td>וואקו, פישר סיינטיטיק</td><td>NC9582225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז (קולגנאז סוג IV)</td><td>ThermoFisher</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Thermo Fisher</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>LS006330</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s שונה נשר בינוני F-12</td><td>תרמו פישר</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו פישר</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Flowmi 40 &mu; מ&nbsp; מסננת תאים עם קצה פיפטה&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BAH136800040</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1119 Gradient Separation Cell</td><td>Separation Solution Sigma Aldrich</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2520</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Miltenyi GentleMACSTM ערכת עיכול&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>מיכל הקפאה Nalgene Cryo "Mr. Frosty"</td><td>&nbsp; ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>תחליף P40 Nonident</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פולוקסמר 188</td><td>Sigma</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>מעכב Rnase&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>טווין-20</td><td>תרמו פישר</td><td>85113</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

Optimized Nuclei Isolation from Fresh and Frozen Solid Tumor Specimens for Multiome Sequencing

ריצוף מולטיום, המספק RNA חד-תאי זהה/מזווג והבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing), מייצג פריצת דרך ביכולתנו להבחין בהטרוגניות של תאי הגידול - מוקד עיקרי של מחקר סרטן תרגומי בשלב זה. עם זאת, איכות נתוני הרצף הנרכשים באמצעות מודל מתקדם זה תלויה מאוד באיכות חומר הקלט. 
תנאי העיכול צריכים להיות אופטימליים כדי למקסם את תפוקת התאים מבלי להקריב את האיכות. זה מאתגר במיוחד בהקשר של גידולים מוצקים עם מטריצות דסמופלסטיות צפופות שיש לפרק בעדינות לשחרור תאים. תאים שבודדו טריים מרקמת גידול מוצקה הם שבירים יותר מאלה שבודדו משורות תאים. בנוסף, מכיוון שסוגי התאים המבודדים הם הטרוגניים, יש לבחור תנאים שיתמכו באוכלוסיית התאים הכוללת. 
לבסוף, תנאי בידוד גרעיני חייבים להיות אופטימליים בהתבסס על תכונות אלה במונחים של זמני ליזה וסוגים/יחסים מגיבים. במאמר זה, אנו מתארים את הניסיון שלנו עם בידוד גרעיני עבור פלטפורמת ריצוף 10x Genomics multiome מדגימות גידול מוצק. אנו מספקים המלצות לעיכול רקמות, אחסון של תרחיפים חד-תאיים (אם רוצים), בידוד גרעיני והערכה.

כדי לבודד גרעינים באיכות גבוהה מדגימות של גידולים מוצקים של מטופלים לצורך ריצוף מולטיומי (איור 1), רקמת הגידול נותקה ותרחיף של תא בודד נשמר בהקפאה (איור 2A-D). לאחר מכן הופשר מתלה התא בזמן לכידת המולטיום המתוכננת. לכידת גרעינים בוצעה עם ריאגנטים ותזמון אופטימליים של חיץ ליזיס כדי למקסם הן את האיכות והן את התפוקה (איור 3A-D). תמונות גרעינים מייצגות מציגות גודל וצורה ...

הפרוטוקול מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידולים מוצקים לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics, כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים והערכה של גרעינים מבודדים.

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

ככל שהידע שלנו בביולוגיה של הגידול גדל והעניין להבין את המורכבות של האופן שבו תאים מתקשרים בתוך הגידול ומשפיעים על תוצאות המטופלים, גדלה גם החשיבות של ניתוח תאים הטרוגניים ברחבי המיקרו-סביבה של הגידול. ריצוף מולטיום, המאפשר רכישת RNA של תא בודד וריצוף תקיפה מאותו תא בצורה של תא מזווג, מספק התקדמות משמעותית לקראת מטרה זו. עם זאת, איכות הנתונים המתקבלים מניסויים אלה תלויה מאוד באיכות תנאי הניסוי ובחומר הביולוגי המוקלט.פרוטוקול זה מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידול מוצקות לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics. פרוטוקול זה אמין באמצעות מתלים טריים או קפואים של תא בודד. אנו מספקים המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים של תא בודד והערכה של גרעינים מבודדים.בפרוטוקול זה, השתמשנו בדגימות אדנוקרצינומה של צינור הלבלב האנושי, שהן סוג רקמה עיקרי במעבדה שלנו. סרטן הלבלב מייצג סוג גידול דסמופלסטי מאוד, אשר מבשר רקמה דביקה יחסית, כמו גם תאים. יתר על כן, מכיוון שדגימות גידול הלבלב הזמינות למחקר נוטות גם הן להיות קטנות יחסית, נעשים מאמצים למקסם את כמות התאים שנלכדו.

optimized-nuclei-isolation-from-fresh-frozen-solid-tumor-specimens

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לבידוד גרעינים בודדים מרקמת גליומה טרייה קפואה. הגרעינים הבודדים יכולים לשמש כדגימות לטכניקות ריצוף כגון ריצוף RNA של גרעינים בודדים (snRNA) ובדיקת גרעינים בודדים לריצוף כרומטין נגיש טרנספוזאז (snATAC) כדי לקבל תובנות עמוקות יותר לגבי הטרוגניות בין ותוך גידולים שנצפתה בגליומה של רקמות העצבים המרכזיות.

בידוד גרעינים מרקמות גליומה טריות קפואות: שיטה להשגת גרעינים שלמים מדגימות גידולי גליומה

הטרוגניות תוך-גידולית היא תכונה אינהרנטית של גידולים, כולל גליומות. פיתחנו פרוטוקול פשוט ויעיל המשתמש בשילוב של חוצצים וצנטריפוגה הדרגתית כדי לבודד גרעינים בודדים מרקמות גליומה קפואות טריות למחקרי רצף גרעין יחיד ו- ATAC.

בידוד גרעינים מגידולים טריים במוח קפוא ל-RNA-seq חד-גרעיני ו-ATAC-seq

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים מרקמות כבד מוקפאות בהבזק, בארכיון עבור RNA-seq, ATAC-seq ומולטיומיקה של מפרקים (RNA-seq ו-ATAC-seq).

בידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה עבור מולטיומיה חד-תאית

המחקר מתאר פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים איכותיים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף RNA של גרעינים בודדים במורד הזרם.

פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים בודדים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף גרעין יחיד

ההצלחה של תעתיק חד-תאי/חד-גרעיני ומולטי-אומיקה תלויה במידה רבה באיכות התאים/גרעינים. לכן, בידוד תאים/גרעינים מרקמה וטיהורם חייבים להיות סטנדרטיים ביותר. פרוטוקול זה מתאר את הכנת הגרעינים מהמוח וממח העצם לבדיקת מולטיום-גרעינים חד-גרעיניים במורד הזרם.

הכנה איכותית של גרעיני מוח ומח עצם לבדיקות מולטיום של גרעינים בודדים

כתב יד זה מתאר פרוטוקולים קליניים עבור שני לוחות ריצוף מהדור הבא. פאנל אחד חוקר ממאירויות המטולוגיות ואילו הפאנל השני מתמקד בגנים שעברו מוטציה בדרך כלל בגידולים מוצקים. סיווג מולקולרי של מוטציות מניעות בגידולים ממאירים אנושיים מציע מידע פרוגנוסטי וחיזוי רב ערך.

רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים

קבלת דנ א גנומי באיכות גבוהה רקמות הגידול, מהווה צעד ראשון חיוני לניתוח שינויים גנטיים באמצעות רצף הדור הבא. במאמר זה, נציג שיטה פשוטה ומהירה כדי להשיג שלמות הדנ א של מגע ההטבעה ציטולוגיה דגימות ולהעשיר תאים סרטניים.

שיטה פשוטה ומהירה להשיג גידול איכותיים הדנ א של דגימות קליני-פתולוגיים באמצעות מגע ההטבעה ציטולוגיה

אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד של תאים מתחילים הגידול מחולה סרקומה האדם נגזר xenografts תלי על ידי מיון מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית, באמצעות אנטיגן לוקיציט אנושי-1 (HLA-1) כסמן שלילי, ועל אימות נוסף האפיון של התאים האלה HLA-1-שלילי גידול מתחיל.

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

כתב היד מתאר מבוססי שבב דיגיטלי PCR assay לזהות נדיר CDH1 התעתיק variant (CDH1a) רגילה מוקפאות ורקמות הגידול המתקבל בחולים עם סרטן קיבה.

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

במחקר זה, אנו מציגים הרומן ונוהל יעיל הבידוד של לימפוציטים מ טלאים של פייה (PPs), בו ניתן להשתמש לאחר מכן ב- vivo ו- in vitro לקשרי מבחני פונקציונלי, כמו גם מחקרים cytometric זרימה של הזקיקים T עוזר, מרכז נבטי B תאים.

שחקני המפתח unraveling Humoral חסינות: מתקדם וממוטב לימפוציט בידוד פרוטוקול טלאים מאתר של Peyer

למד שיטה אופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידול מוצק טריות וקפואות לריצוף מולטיומי. פרוטוקול זה משפר את איכות הנתונים ומאפשר ניתוח מיקרו-סביבתי מדויק של הגידול.

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

גלה סרטונים נוספים