Name: בדיקת פעילות גורם רקמת שלפוחית חוץ-תאית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 3 min 53 s
Description: למדו לבדוק פעילות גורם רקמת בווזיקולות חוץ-תאיות מפלזמה אנושית באמצעות שיטת מעבדה ייעודית. השיטה מציעה רגישות וספציפיות גבוהות יותר מבדיקות מבוססות אנטיגן מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) ופרופסורת ג'ון סי פארקר (N.M). ברצוננו להודות לגב' סיירה ארצ'יבלד על הערותיה המועילות

המחקר אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל (פרוטוקול מספר: 14-2108).
1. איסוף דם מתורמים
<ol><li>לאסוף דם שלם באמצעות venipuncture נקי לתוך הווריד antecubital עם מחט 21 גרם. השליכו את 3 מ"ל הדם הראשונים מכיוון שחלק זה של הדם עשוי להכיל TF מתאים פריווסקולריים.</li>
	<li>יש לשאוב 2.7 או 1.8 מ"ל (בהתאם לגודל הצינורות) של דם לתוך vacutainer המכיל 3.2% נתרן ציטראט (0.109 mol/L). אין למלא את הצינורות. הפוך בעדינות צינורות מיד לאחר איסוף הדם כדי לפזר את ציטראט נתרן.</li>
	<li>הימנע תסיסה אם הצינורות מועברים לפני העיבוד. הכן פלזמה בתוך 2 שעות של איסוף הדם.</li>
</ol>2. הכנת פלזמה שליטה שלילית
הערה: אין להניח דגימות על קרח בכל עת לפני ההקפאה הסופית.
<ol><li>הכינו פלסמת בקרה שלילית באמצעות דם מלא ממתנדבים בריאים. מיד לאחר איסוף הדם, להכין פלזמה ללא טסיות כדלקמן.<ol><li>העברת דגימות דם מצינורות vacutainer לצינורות 15 מ"ל.</li>
		<li>דגימות דם צנטריפוגות ב-2,500 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (20-24 מעלות צלזיוס) ללא בלימה.</li>
		<li>מעבירים את הסופרנאטנט (פלזמה ענייה בטסיות) לצינור חדש וחוזרים על הספין באותם תנאים.</li>
		<li>מעבירים את הסופרנאטנט (פלזמה מדולדלת טסיות) לצינור חדש.</li>
		<li>Aliquot את הדגימה לתוך ≥100 μL aliquots. השאירו כ-100 μL בתחתית הצינור.</li>
		<li>הקפיאו מיד את הפלזמה המדולדלת מטסיות הדם בטמפרטורה של -80°C (איור 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת פלזמה שליטה חיובית
הערה: התגובה לליפופוליסכריד משתנה בין אנשים.
<ol><li>העברת דגימות דם מן vacutainers ל 15 מ"ל צינורות.</li>
	<li>הכן פלזמה בקרה חיובית באמצעות דם מלא ממתנדבים בריאים מגורה עם lipopolysaccharide (LPS) מ Escherichia coli O111: B4 (10 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 5 שעות ב 37 ° C עם תסיסה.</li>
	<li>לאחר 5 שעות דגירה, בצע את השלבים 2.1.2 עד 2.1.6.</li>
</ol>4. בידוד שלפוחיות חוץ תאיות מפלזמה
הערה: ייתכן שכדורי EV לא יהיו גלויים. זמן ההפשרה תלוי בנפח הדגימה, אך בדרך כלל אנו מפשירים פלזמה של 100 μL למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
<ol><li>הפשיר דגימות פלזמה ב 37 ° C.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של HBSA ללא סידן [HBSA-Ca(-)] חיץ [137 mM NaCl, 5.38 mM KCl, 5.55 mM גלוקוז, 10 mM HEPES, 0.1% (w/v) אלבומין בסרום בקר] לכל 100 μL של דגימת פלזמה בצינור 1.5 מ"ל.</li>
	<li>דגימות פלזמה צנטריפוגות ב 20,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.</li>
	<li>הרכיבו מחדש את כדורית ה-EV על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ HBSA-Ca(-) לכל צינור, פיפטה למעלה ולמטה במיקום של כדורית ה-EV, וערבול כל צינור לפני צנטריפוגה בפעם השנייה ב-20,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4°C.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.</li>
	<li>הרכיבו מחדש את כדורית ה-EV ב-80 מיקרוליטר של HBSA-Ca(-) ופיפטה למעלה ולמטה במיקום של גלולת ה-EV (איור 2).</li>
</ol>5. אופציה: בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה
<ol><li>לאחר שלב 4.3, אספו את הסופרנאטנט והאולטרה-צנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך 70 דקות ב-4°C.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.</li>
	<li>הרכיבו מחדש את גלולת ה-EV על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ HBSA-Ca(-) לכל צינור ומערבולת כל צינור לפני אולטרה-צנטריפוגה בפעם השנייה ב-100,000 × גרם למשך 70 דקות ב-4°C.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.</li>
	<li>הרכיבו מחדש את גלולת ה-EV ב-80 מיקרוליטר של HBSA-Ca(-).</li>
</ol>6. מדידת פעילות גורם רקמת השלפוחית החוץ תאית
הערה: דגימות EV צריך להיות pipeted ולערבל היטב כדי לערבב לפני הוספה לבארות. EDTA-דיסודיום יעכב את היכולת של FXa לבקע את המצע הכרומוגני. לכן, לא ניתן להשתמש ב-EDTA-דיסודיום כתחליף ל-EDTA-tetrasodium בשלב 6.7.
<ol><li>הוסף 40 μL של דגימת EV לשתי בארות של צלחת 96 בארות.</li>
	<li>הוסף 11 μL של עכבר מעכב TF IgG אנטי אנושי [(36.4 מיקרוגרם / מ"ל, ריכוז סופי 7.8 מיקרוגרם / מ"ל)] לבאר אחת של דגימת EV ו 11 μL של עכבר בקרה IgG [(36.4 מיקרוגרם / מ"ל, ריכוז סופי 7.8 מיקרוגרם / מ"ל)] לבאר השנייה.</li>
	<li>דוגרים על צלחת 96 בארות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>במהלך זמן הדגירה, הכינו 50 μL/well של תקני TF (0, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10 ו-20 pg/mL) בשכפול באמצעות TF רקומביננטי משומן.</li>
	<li>יש להכין את תערובת הגורמים על-ידי ערבוב של 4 מ"ל HBSA עם סידן [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl2, ריכוז סופי 10 mM], 800 μL של 900 nM FX ב-HBSA-Ca(+) (ריכוז סופי: 146.4 nM) ו-120 μL של 200 nM FVIIa ב-HBSA-CA(+) (ריכוז סופי: 4.8 nM).</li>
	<li>מוסיפים 50 μL של תמיסת תערובת הגורמים לכל באר, מכסים את הצלחת בסרט ודגרים במשך שעתיים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר שעתיים, יש להפסיק את ייצור FXa על ידי הוספת 25 μL של חוצץ HBSA ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetrasodium, ריכוז סופי 5 mM] ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הרכיבו מחדש את המצע הכרומוגן שנבקע על ידי FXa ל-4mM (הוסיפו 8.7 מ"ל מים מזוקקים לבקבוקון של 25 מ"ג).</li>
	<li>הוסף 25 μL של תמיסת המצע הכרומוגנית לכל באר, כסה את הצלחת בסרט ולאחר מכן ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור, ודגר במשך 15 דקות ב 37 ° C.</li>
	<li>לאחר 15 דקות של דגירה, להסיר בועות עם מחט או על ידי צנטריפוגה ב 1,500 × גרם במשך 1 דקות.</li>
	<li>קרא את הצלחת במהירות של 405 ננומטר באמצעות קורא צלחות עם תערובת אחת לפני הקריאה.</li>
	<li>המר את דור FXa של כל באר לפעילות TF באמצעות העקומה הסטנדרטית הנוצרת באמצעות TF רקומביננטי משומן.</li>
	<li>חישוב יצירת FXa תלוי TF (פעילות EVTF) באמצעות משוואה (1): דור FXa תלוי TF (פעילות EVTF [pg/mL]) = יצירת FXa כוללת (שליטה ב-IgG היטב) - דור FXa עצמאי TF (באר IgG נגד TF) (איור 3) (1)</li>
</ol>

רגישות משופרת לבדיקת פעילות פקטור רקמה בשלפוחיות חוץ-תאיות

<ol><li>Grover, S. P., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor%3A+an+essential+mediator+of+hemostasis+and+trigger+of+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).</li>
<li>Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+phospholipid+environment+modulates+the+activation+of+blood+clotting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).</li>
<li>Tavoosi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+phospholipid+synergy+in+blood+clotting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).</li>
<li>Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelin+encrypts+tissue+factor%3A+ATP-induced+activation+of+A-SMase+leads+to+tissue+factor+decryption+and+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding.</a> Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).</li>
<li>Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+sphingomyelinase+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Secretory sphingomyelinase in health and disease.</a> Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).</li>
<li>Versteeg, H. H., Ruf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+coagulant+function+is+enhanced+by+protein-disulfide+isomerase+independent+of+oxidoreductase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).</li>
<li>Reinhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+isomerase+acts+as+an+injury+response+signal+that+enhances+fibrin+generation+via+tissue+factor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).</li>
<li>Langer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+activation+of+monocyte+tissue+factor+by+antithymocyte+globulin+is+dependent+on+complement+and+protein+disulfide+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase.</a> Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).</li>
<li>Bogdanov, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+spliced+human+tissue+factor%3A+a+circulating%2C+soluble%2C+thrombogenic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein.</a> Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).</li>
<li>Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+spliced+tissue+factor+-+one+cut+too+many%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Alternatively spliced tissue factor - one cut too many.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).</li>
<li>Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+spliced+human+tissue+factor+%28asHTF%29+is+not+pro-coagulant%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles%2C+current+state-of-the-art%3A+emerging+role+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li>
<li>Osterud, B., Bjorklid, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+in+blood+cells+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Elite+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Tissue factor in blood cells and endothelial cells.</a> Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).</li>
<li>Hisada, Y., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell-derived+tissue+factor-positive+extracellular+vesicles%3A+biomarkers+of+thrombosis+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival.</a> Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).</li>
<li>Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Hydroxy-2-nonenal+enhances+tissue+factor+activity+in+human+monocytic+cells+via+p38+mitogen-activated+protein+kinase+activation-dependent+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).</li>
<li>Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+tissue+factor-positive+extracellular+vesicles+in+plasma%3A+strengths+and+weaknesses+of+current+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods.</a> Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).</li>
<li>Lee, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+and+analytical+variables+affecting+the+measurement+of+plasma-derived+microparticle+tissue+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity.</a> Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).</li>
<li>Claussen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicle-associated+tissue+factor+procoagulant+activity+for+the+preoperative+diagnosis+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer.</a> Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).</li>
<li>Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+and+its+procoagulant+activity+on+cancer-associated+thromboembolism+in+pancreatic+cancer%3A+Comment+by+Mackman+et+al%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al.</a> Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).</li>
<li>Sachetto, A. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+four+commercial+ELISAs+to+measure+tissue+factor+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133(2023).</li>
<li>Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+bead-based+assay+to+measure+levels+of+human+tissue+factor+antigen+in+extracellular+vesicles+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677(2022).</li>
<li>Tatsumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+commercial+assay+to+measure+microparticle+tissue+factor+activity+in+plasma%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).</li>
<li>Hisada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+microparticle+tissue+factor+activity+in+clinical+samples%3A+A+summary+of+two+tissue+factor-dependent+FXa+generation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays.</a> Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).</li>
<li>Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+severe+orthohantavirus+cardiopulmonary+syndrome+due+to+Sin+Nombre+Virus+infection+have+increased+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+and+an+activated+coagulation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system.</a> Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).</li>
<li>Schmedes, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Extracellular+Vesicle+Tissue+Factor+Activity+During+Orthohantavirus+Infection+Is+Associated+With+Intravascular+Coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation.</a> Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).</li>
<li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-Brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Campbell, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+coagulopathies+associated+with+COVID-19+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525(2021).</li>
<li>Guervilly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+extreme+levels+of+extracellular+vesicles%3A+tissue+factor+activity+in+patients+with+severe+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19.</a> Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).</li>
<li>Hisada, Y., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+tissue+factor+activity+in+extracellular+vesicles+from+human+plasma+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).</li>
<li>Sachetto, A. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+activity+of+small+and+large+extracellular+vesicles+in+different+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Research+and+Practice+in+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124(2023).</li>
<li>Bom, V. J., Bertina, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+Ca2%2B%2C+phospholipids+and+tissue-factor+apoprotein+to+the+activation+of+human+blood-coagulation+factor+X+by+activated+factor+VII%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII.</a> Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).</li>
<li>Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+activity+is+increased+in+a+combined+platelet+and+microparticle+sample+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).</li>
<li>Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exosome+journey%3A+from+biogenesis+to+uptake+and+intracellular+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47(2021).</li>
<li>Garnier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induced+to+express+mesenchymal+phenotype+release+exosome-like+extracellular+vesicles+carrying+tissue+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).</li>
<li>Park, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor-bearing+exosome+secretion+from+human+mechanically+stimulated+bronchial+epithelial+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).</li>
</ol>

אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

כאן מוצג הפרוטוקול של בדיקת פעילות ה- EVTF הפנימית שלנו. ישנם שלושה שלבים קריטיים בפרוטוקול. בעת בנייה מחדש של כדורית EV, חשוב לבצע פיפטה למעלה ולמטה במיקום של גלולת EV גם אם היא אינה נראית לעין. הרכבה מחדש חלקית של כדורית EV תגרום להערכה שלילית שגויה או הערכת חסר של ערכי פעילות EVTF של הדגימות. שנית, השימוש ב-HBSA-Ca(+) הוא קריטי בשלב 6.5 של הפרוטוקול מכיוון שלא ניתן לייצר דור FXa ללא סידן. שלישית, שימוש ב-EDTA-tetrasodium אך לא ב-EDTA-disodium כדי לעצור את ייצור FXa הוא קריטי מכיוון שהאחרון מעכב את היכולת של FXa לבקע א...

קרישת הדם מתחילה עם קשירה של גורם (F) VII/VIIa לגורם רקמה (TF)1. קומפלקס TF/FVIIa מפעיל הן את FIX והן את FX כדי להפעיל קרישת דם1. ישנן שתי צורות של TF באורך מלא, קשור לקרום: מוצפן ופעיל. בנוסף, קיימת צורה חלופית של TF (asTF). ספינגומיילין ופוספטידילכולין בעלון החיצוני של קרום התא שומרים על TF במצב מוצפן 2,3,4. כאשר תאים מופעלים או ניזוקים, סקרמבלאז פוספוליפידים מעביר פוספטידיל-סרין ופוספוליפידים אחרים בעלי מטען שלילי לעלון החיצוני1. הפעלת התאים גורמת גם לטרנסלוקציה של חומצה sphingomyelinase לעלון החיצוני, שם הוא מפרק sphingomyelin ל ceramide5. שני מנגנונים אלה ממירים TF מוצפן לצורה הפעילה. כמו כן מוצע כי חלבון דיסולפיד איזומראז מתווך היווצרות קשר דיסולפיד בין Cys186 ו- Cys209 ב- TF מוצפן, מה שמביא לביטול הצפנה של TF 6,7,8. asTF קיים גם במחזור הדם אך חסר את תחום הטרנסממברנה ולכן הוא מסיס 9,10. חשוב לציין, ל- asTF יש רמות נמוכות מאוד של פעילות מעודדת קרישה בהשוואה ל- TF פעילבאורך מלא 10,11.
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) משתחררות מתאים מארחים נחים, מופעלים וגוססים, כמו גם מתאי סרטן12. כלי רכב חשמליים מבטאים חלבונים מתאי הוריהם12. EV פעילים נושאי TF משוחררים ממונוציטים פעילים, תאי אנדותל ותאי גידול למחזור הדם 13,14,15. רמות TF בפלזמה ניתנות למדידה על ידי בדיקות מבוססות פעילות ואנטיגן. בדיקות מבוססות אנטיגן כוללות ELISA וציטומטריית זרימה16. ישנן שתי בדיקות שונות מבוססות פעילות: מבחני פעילות TF חד שלבית ודו-שלבי. הבדיקה החד-שלבית מבוססת על בדיקת קרישה מבוססת פלזמה. הדגימה המכילה TF מתווספת לפלזמה והזמן ליצירת קריש נמדד לאחר הסתיידות מחדש. הבדיקה הדו-שלבית מודדת את דור הדגימות של FXa על ידי הוספת FVII או FVIIa, FX וסידן. רמות FXa נקבעות באמצעות מצע שנבקע על ידי FXa.
הן במבחני פעילות TF חד-שלבית והן בשני שלבים, ריכוז ה-TF נקבע באמצעות עקומה סטנדרטית הנוצרת עם TF רקומביננטי. לבדיקות דו-שלביות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר לבדיקה החד-שלבית. מחקרים רבים אישרו כי לבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן 17,18,19,20,21. בנוסף, לבדיקת הפעילות הפנימית שלנו יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר לבדיקת פעילות מסחרית22. לאנשים בריאים יש רמות נמוכות מאוד או בלתי ניתנות לגילוי של פעילות EVTF בפלזמה. לעומת זאת, לאנשים עם מצבים פתולוגיים, כגון סרטן, שחמת, אלח דם וזיהום ויראלי, יש רמות ניתנות לזיהוי של פעילות EVTF וזה קשור לפקקת, קרישה תוך וסקולרית מפושטת, חומרת המחלה, ותמותה 23,24,25,26,27,28. כאן, נתאר את בדיקת הפעילות הדו-שלבית של EVTF.

<table><tbody><tr><td>צינור 1.5 מ"ל לצנטריפוגה של 20,000 x g</td><td>כל חברה</td><td>N/A</td><td>אנו משתמשים בזה של פישר סיינטיפיק (מספר קטלוגי: 05-408-129).</td></tr><tr><td>צינור 1.5 מ"ל לאולטרה-צנטריפוגה</td><td>לכל חברה</td><td>N/A</td><td>אנו משתמשים בזה של בקמן קולטר (מספר קטלוגי: 357448)</td></tr> <tr><td>צינור 15 מ"ל</td><td>כל חברה</td><td>N/A</td><td>אנו משתמשים בזה מ- VWR (מספר קטלוגי: 89039-666)</td></tr> <tr><td>21 G x 0.75 אינץ'. סט איסוף דם BD Vacutainer Safety-Lok עם 12 אינץ'. צינורות ומתאם לואר</td><td>BD</td><td>367281</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>כל חברה</td><td>N/A</td><td>אנו משתמשים בזה של גלוב סיינטיפיק (מספר קטלוגי: 120338).</td></tr><tr><td>צינורות ציטראט BD Vacutainer</td><td></td> BD <td>363083</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה לצינור 1.5 מ"ל</td><td>כל חברה</td><td>N/A</td><td>אנו משתמשים בצנטריפוגה 5417R (אפנדורף).</td></tr><tr><td>צנטריפוגה לצינור 15 מ"ל</td><td>כל חברה</td><td>N/A</td><td>אנו משתמשים בצנטריפוגה 5810R (Eppendorf).</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>אתילנדיאמין טטראצטי חומצה טטרה סודיום מלח דיהידרט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>מעבדת מחקר אנזימים</td><td>FVIIa אנושית</td><td>HFVIIa</td><td>יש לדלל את התמיסה עם HBSA-Ca(+).</td></tr><tr><td>מעבדת מחקר אנזימי</td> <td>FX אנושיים</td><td>HFX1010</td><td>יש לדלל את התמיסה עם HBSA-Ca(+).</td></tr><tr><td>גורם רקמה אנטי אנושי מעכב של עכבר IgG, שיבוט HTF-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>550252</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2630</td><td>ישנם מספר ליפופוליסכריד מ-E. coli. ליפופוליסכריד שונים יש פוטנציאל שונה להפעיל מונוציטים.</td></tr><tr><td>עכבר IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5381</td><td></td></tr><tr><td>Pefachrome FXa 8595</td><td>מעבדת מחקר אנזימים</td><td>085-27</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>כל חברה</td><td>N/A</td><td>אנו משתמשים ב-SpectraMax i3x מבית Molecular</td></tr><tr><td>Devices Re-lipidated Re-lipidant רקמה פקטור, Dade Innovin</td><td>Siemens</td><td>10873566</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>אופטימה TLX</td><td></td></tr><tr><td>רוטור אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>TLA-55</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת פעילות גורם רקמת שלפוחית חוץ-תאית

Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity Assay

גורם רקמה (TF) הוא קולטן טרנסממברנה עבור פקטור (F) VII ו- FVIIa. קומפלקס TF/FVIIa יוזם את מפל הקרישה על ידי הפעלת FIX ו- FX. TF משתחרר מתאים למחזור הדם בצורה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV). רמת ה-TF החיובי (+) לרכב חשמלי עולה במחלות שונות, כולל סרטן, זיהומים חיידקיים ונגיפיים ושחמת הכבד, וקשורה לפקקת, קרישה תוך-וסקולרית מפושטת, חומרת מחלות ותמותה. ישנן שתי דרכים למדוד TF+ EV בפלזמה: בדיקות מבוססות אנטיגן ופעילות. הנתונים מצביעים על כך שלבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן. מאמר זה מתאר את בדיקת פעילות ה- EVTF הפנימית שלנו המבוססת על בדיקת דור FXa דו-שלבית. FVIIa, FX וסידן מתווספים לדגימות המכילות TF+ EV כדי ליצור FXa בנוכחות ובהיעדר נוגדן נגד TF כדי להבדיל בין דור FXa תלוי TF לבין דור FXa שאינו תלוי ב- TF. מצע כרומוגני שנבקע על ידי FXa משמש לקביעת רמת FXa, בעוד שעקומה סטנדרטית הנוצרת עם TF רקומביננטי משומן משמשת לקביעת ריכוז TF. לבדיקת פעילות EVTF פנימית זו יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקת פעילות TF מסחרית.

תוצאה מוצלחת נותנת ערך בקרה חיובי של ≥0.5 pg/mL וערך בקרה שלילי של &lt;0.5 pg/mL. עדיף למצוא מגיב LPS גבוה עם פעילות EVTF &gt;1.0 pg/mL לשליטה חיובית. התוצאה המייצגת מראה את פעילות ה-EVTF של כלי רכב חשמליים שבודדו מפלזמה מכל הדם של 11 תורמים בריאים, עם וללא הפעלת LPS (איור 4). שישה מתוך אחד עשר תורמים (תורמים 2, 4, 5, 8, 10, 11) היו מגיבי LPS בינוניים עד גבוהים, ואילו חמישה מתוך אחד עשר תורמים (תורמים 1, 3, 6, 7, 9) היו מגיבים LPS נמוך.
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-together....

כאן אנו מתארים בדיקת פעילות רקמת שלפוחית חוץ-תאית בבית. בדיקות מבוססות פעילות ובדיקות מבוססות אנטיגן שימשו למדידת גורם רקמה בשלפוחיות חוץ-תאיות מדגימות פלזמה אנושיות. לבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן.

Tissue factor (TF) is a transmembrane receptor for factor (F) VII and FVIIa. The TF/FVIIa complex initiates the coagulation cascade by activating both FIX ...

רמות נמוכות של שלפוחיות חוץ-תאיות חיוביות לגורם רקמה קיימות בפלזמה מחולים עם מחלות שונות. עם זאת, לרוב הבדיקות מבוססות האנטיגן, כולל ELISA וציטומטריית זרימה, אין את הרגישות לזהות רמות נמוכות אלה. מאמרים רבים השתמשו ב- ELISA או ציטומטריית זרימה כדי לזהות גורם רקמה בפלזמה.הפרוטוקול שלנו מודד את פעילות פקטור הרקמה בפלזמה עם רגישות גבוהה וספציפיות, אם כי יש שונות מסוימת עקב השימוש בבדיקה פונקציונלית. ישנן ערכות בדיקה מסחריות המודדות את רמות פעילות פקטור הרקמה בפלזמה. עם זאת, ערכות אלה אינן מכילות נוגדנים נגד פקטור הרקמה, ולכן אינן יכולות להבחין בין יצירת פקטור X שאינו תלוי בפקטור רקמה לבין ייצור פקטור X שאינו תלוי ברקמה.

extracellular-vesicle-tissue-factor-activity-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מחקר זה מתאר assay microplate רומן שמודד את פעילות קרישת FV במהלך היווצרות קריש פיברין בפלזמה אנושית שלא דווח בעבר. השיטה משתמשת בקורא microplate הקינטית ברציפות כדי למדוד את השינוי בספיגה ב405nm במהלך היווצרות קריש פיברין בפלזמה אנושית.

מדידה של פעילות פקטור V בפלזמה אנושית באמצעות Assay קרישת Microplate

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית קטנה (EVs) של כל הרקמות, כולל דגימות המוח ואת הגידול. שיטה זו מציעה שיטה לשחזור כדי לחלץ EVs מרקמות מוצק עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים.

מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לחילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מהדם ההיקפי ומרקמות מוצקות עם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים.

בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות

כאן אנו מתארים את העשרת שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית אופטימלית.

שיטת העשרה לבועיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד

הפרוטוקול המוצע כולל הנחיות כיצד להימנע מזיהום באנדוטוקסין במהלך בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות מסופרנאטנטים של תרביות תאים, וכיצד להעריך אותן כראוי.

בידוד של תכולת אנדוטוקסין נמוכה שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בשורות תאים סרטניים

פרוטוקול זה חוקר את השימוש בפלזמה עשירה בשלפוחית חוץ-תאית (EV) כאינדיקטור ליכולת הקרישה של EV. פלזמה עשירה ב- EV מתקבלת באמצעות תהליך של צנטריפוגה דיפרנציאלית והסתיידות לאחר מכן.

קביעת פעילות הקרישה של שלפוחית חוץ-תאית (EV) באמצעות זמן קרישה המופעל על ידי EV (EV-ACT)

מאמר זה מפרט את הפרוטוקול לכימות אחוז הטסיות החיוביות לפקטור רקמה (TF) באמצעות ציטומטריית זרימת דם מלאה, תוך הערכת החלבון: (1) תוך-תאית במצבי מנוחה, ו-(2) על פני התא, הן במנוחה והן בתנאי פעילות. ניתנת גם הנחיות להערכת טסיות חיוביות TF בפלזמה עשירה בטסיות.

ניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי גורמי רקמה בטסיות בבני אדם

מדידה של פעילות מערכת עצבים אוטונומית בדרך כלל גבולות החוקר והמשתתף למעבדה, אשר עשוי לספק סביבה מאיימת לילדים. מערכת ניטור VU אוניברסיטת אמבולטורי (VU-AMS) מכשיר יכול להקליט שליטה אוטונומית לב בכל סביבה. VU-AMS הוכיח מאוד נוח לבדיקה בילדים.

מערכת מדידת פעילות לב עצבים אוטונומית (ANS) בילדים

כדי לשפר את הידע של היווצרות neotissue תאית ומולקולרית שלנו, מודל עכברי של TEVG פותח לאחרונה. השתלים הושתלו שתלי כחציצת וריד נבוב infrarenal בעכברי C57BL / 6. מודל זה משיג תוצאות דומות לאלה שהושגו בחקירה הקלינית שלנו, אבל לאורך זמן כמובן הרבה מקוצר.

השתלה של וריד נבוב חציצת שתל נחותה בעכבר דגם

על מנת להבין את המנגנונים התאיים ומולקולריים שבבסיס neotissue היווצרות והתפתחות היצרות במסתמי לב רקמה מהונדסת, מודל עכברי של השתלת שסתום לב heterotopic פותח. שסתום לב ריאה הושתל לנמען באמצעות טכניקת השתלת לב heterotopic.

השתלה של הריאה Valve שימוש במודל עכבר של Heterotopic לב והשתלות

למדו לבדוק פעילות גורם רקמת בווזיקולות חוץ-תאיות מפלזמה אנושית באמצעות שיטת מעבדה ייעודית. השיטה מציעה רגישות וספציפיות גבוהות יותר מבדיקות מבוססות אנטיגן מסורתיות.

בדיקת פעילות גורם רקמת שלפוחית חוץ-תאית

גלה סרטונים נוספים