Name: הכנת תרחיף חד-תאי מעורקי התרדמה של העכבר לריצוף חד-תאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: למדו פרוטוקול עיכול דו-שלבי להכנת תרחיף חד-תאי מעורקי התרדמה של עכברים. שיטה זו מייצרת תאים בעלי חיוניות גבוהה לריצוף חד-תאי ומאפשרת זיהוי ארבעה סוגי תאים עיקריים, תוך שימוש בציוד מעבדה רגיל בלבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של סין (82070450 ל- C.T.and 82170466 ל- L.Z.) ומלגת הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (7121102223 ל- F.L).

כל נהלי בעלי החיים המתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סוצ'ו.
1. ריאגנטים והכנת חומרים
<ol><li>השתמשו ב-1x PBS ללא סידן ומגנזיום וב-2.5 U/mL הפרין נתרן מלח להכנת תמיסת הזילוח. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C, ולהתקרר מראש על קרח בעת השימוש.</li>
	<li>הכינו מגיב דיסוציאציה A המכיל 125 CDU/mL collagenase II ו-60 U/mL DNase I על ידי דילול 1250 CDU/mL collagenase II ו-3000 U/mL DNase I עם HBSS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.</li>
	<li>הכינו מגיב דיסוציאציה B המכיל ריכוז סופי של 0.12% טריפסין על ידי דילול 1 מ"ל של 0.25% טריפסין ללא EDTA (ללא פנול אדום) לתוך 1 מ"ל של 1x PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.</li>
	<li>הכינו 10 מ"ל של 1.5% FBS ו-10 מ"ל של 5% FBS ב-1x PBS. יש להשתמש ב-1.5% FBS לבריכות עורקי התרדמה ולשמור על קרח לפני השימוש. השתמש ב-5% FBS כדי לנטרל את העיכול ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>קבל את החומרים הניסיוניים, כולל מזרקים 1 מ"ל, מזרקים 20 מ"ל עם מחטים 26-G, צלחות תרבית תאים שש בארות, צינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל, מסננות תאים סטריליים 40 מיקרומטר ומכלי קרח.</li>
</ol>2. הכנת ציוד
<ol><li>לעקר את כל ציוד הניתוח, כולל מיקרוסקופ סטריאוסקופי, מספריים מנתחים, מספריים לניתוח מיקרו ומלקחיים עדינים.</li>
	<li>הפעל את מונה התאים האוטומטי ותחזק אותו ב- RT.</li>
	<li>הפעל את אמבט המים ל 37 מעלות צלזיוס מראש.</li>
	<li>מצננים מראש את המיקרוצנטריפוגה ל-4°C לפני השימוש.</li>
</ol>3. בידוד עורק התרדמה של העכבר
<ol><li>מרדימים את העכבר באמצעות 1.25% tribromoethanol על ידי הזרקה intraperitoneal (0.24 מ"ל עבור כל 10 גרם של משקל גוף) ולהפוך את העכבר כדי לבדוק אם יש רפלקס ימין לאחר 3 דקות. לאחר מכן, להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם ולהניח אותו על גבו. רססו את עור העכבר ב-75% אלכוהול.</li>
	<li>השתמש מספריים ניתוח מעוקר כדי לפתוח את העור ולחשוף את חלל החזה. פתח את הסרעפת.</li>
	<li>ממשיכים לחתוך כלפי מעלה ללסת התחתונה ומסירים בזהירות עודפי רקמות חיבור ושומן, תוך חשיפת עורק התרדמה.</li>
	<li>חותכים את הווריד הנבוב התחתון של העכבר כדי לגרום לדם לזרום מתוך מחזור הדם הסגור.</li>
	<li>להזריק 20 מ"ל של פתרון זילוח prechilled לתוך החדר השמאלי עם מזרק לאט וברציפות. הערה: אם הזלוף מצליח, איברים עשירים בדם כגון הכבד, הטחול והכליות יהפכו אפורים-לבנים.</li>
	<li>מקלפים את כל השומן ורקמות החיבור סביב עורק התרדמה בעזרת מספריים לניתוח מיקרו תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. הערה: שלב זה צריך להיעשות לאט ובזהירות כדי למנוע נזק לעורק התרדמה.</li>
	<li>בודדו את עורק התרדמה מהעכבר, שטפו עם 1x PBS כדי לשטוף שוב את הדם, והעבירו לצלחות של שש בארות המכילות 1.5% FBS על קרח.</li>
</ol>4. עיכול עורק התרדמה לתרחיף חד תאי
<ol><li>השתמש מספריים micro-dissecting לנתח את עורק התרדמה לאורך, ושכב שטוח על צלחת תרבית תאים אחרת 6 בארות המכילה 1 מ"ל של 1.5% FBS על קרח.</li>
	<li>שטפו את האינטימה בזהירות עם 1.5% FBS כדי להסיר את שאריות הדם. הערה: השטיפה צריכה להיות עדינה ואיטית כדי למנוע פגיעה בתאי אנדותל.</li>
	<li>חתכו כל עורק התרדמה לכ-2 מ"מ2 חתיכות רקמה באמצעות מספריים מיקרו-דיסקרטיים ב-1.5% FBS.</li>
	<li>מעבירים את חתיכות הרקמה הללו לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם קצוות נשא ברוחב 1 מ"ל, צנטריפוגה ב 400 x גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לשקוע את הרקמות לתחתית.</li>
	<li>להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את הרקמות ב 500 μL של מגיב דיסוציאציה A.</li>
	<li>הניחו את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת. פיפטה בעדינות עם פיפטה 1 מ"ל כל 10 דקות.</li>
	<li>הוסף 500 μL של 5% FBS לתוך הצינור ומערבבים היטב עם פיפטה 1 מ"ל.</li>
	<li>סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים סטרילית בגודל 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במהירות 400 x גרם למשך 5 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר את supernatant בזהירות להשעות מחדש את גלולת התא ב 200 μL של מגיב דיסוציאציה B.</li>
	<li>הכניסו לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C ועיכלו במשך 5 דקות נוספות. יש למרוח פיפטה בעדינות כל 2 דקות במהלך העיכול כדי לנתק לחלוטין לתרחיף חד-תאי.</li>
	<li>השתמש 200 μL של 5% FBS כדי לסיים את תגובת העיכול, וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של 1x PBS על קרח.</li>
</ol>5. בדיקת תרחיף תאים וריצוף RNA חד-תאי
<ol><li>הוסף 10 μL של תמיסת AO/PI לתוך 10 μL של תרחיף חד-תאי וערבב בעדינות עם פיפטה של 20 μL.</li>
	<li>פיפטה 20 μL של התערובת לתוך שקופית התא ולחכות 1 דקה.</li>
	<li>טען את השקופית במכשיר מונה התאים האוטומטי.</li>
	<li>בחר את בדיקת הכדאיות של AO/PI ולאחר מכן המתן לדוח האיכות.</li>
	<li>השתמש בערכת מגיב 3ʹ חד-תאי כדי ליצור חרוזי ג'ל חד-תאיים בתחליב על בקר חד-תאי ולהגביר את cDNA המקודד במחזור תרמי בהתאם לפרוטוקול היצרן. הערה: כאן, Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3 שימש.</li>
	<li>בצע רצף על רצף עם אסטרטגיית קריאה של 150 bp (PE150) מקצה זוגי. השתמש ביישום תוכנה (Cell Ranger) כדי להמיר קבצי קריאת בסיס גולמיים לקבצי fastq באמצעות צינור mkfastq . לאחר מכן, השתמש בצינור הספירה של Cell Ranger לביצוע יישור, סינון, ספירת ברקוד וספירת מזהים מולקולריים ייחודיים (UMI) כדי ליצור מטריצות ברקוד13.</li>
	<li>בצע הפחתת ממדיות נתונים והדמיה חזותית עם חבילת R Seurat14.<ol><li>ראשית, הפונקציה Read10X() של Seurat קוראת בפלט של צינור Cell Ranger ולאחר מכן משתמשת במטריצת הספירה כדי ליצור אובייקט Seurat. לאחר מכן, סנן את התאים עם ביטוי של <200 או >4000 גנים או יחס גנים מיטוכונדריאלי שהיה יותר מ -10% על ידי תת-קבוצה () פונקציה של Seurat.</li>
		<li>השתמש ב- NormalizeData () וב- FindVariableFeatures() כדי לנרמל את הנתונים ולזהות 2000 תכונות משתנות מאוד, בהתאמה.</li>
		<li>בצע ניתוח רכיבים ראשי (PCA) על הנתונים שקנה המידה שלהם השתנה, וקבץ את התאים באשכולות עם dims = 30 ורזולוציה = 0.5. לבסוף, השתמש בפונקציה RunUMAP () כדי להציג באופן חזותי את ערכות הנתונים של תא בודד ובפונקציה FindAllMarkers() כדי למצוא כל סמן ביולוגי של אשכול.</li>
	</ol></li>
</ol>

עיכול תאים דו-שלבי של עורק התרדמה של עכבר

<ol><li>Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+flow%3A+roles+of+epigenetic+modulation+in+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).</li>
<li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019).</li>
<li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications%3A+A+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694(2022).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death Discovery. 7 (1), 180(2021).</li>
<li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+maps+endothelial+metabolic+plasticity+in+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).</li>
<li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+gained+from+single-cell+analysis+of+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment.</a> Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).</li>
<li>Sun, H., Xu, X., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single+epithelial+cells+suspension+from+mouse+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands.</a> Bio-Protocol. 10 (4), e3530(2020).</li>
<li>Korin, B., Chung, J. -J., Avraham, S., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+of+mouse+glomeruli+for+high-throughput+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).</li>
<li>Thomson, B., Quaggin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+single+cell+suspension+from+the+murine+iridocorneal+angle%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle.</a> Bio-Protocol. 12 (10), e4426(2022).</li>
<li>Leale, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-stage+digestion+of+whole+murine+knee+joints+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage+Open%22%5BJournal%5D)">A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321(2022).</li>
<li>Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta.</a> Bio-Protocol. 6 (11), e1832(2016).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. 29, e1266(2009).</li>
<li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+UMI-based+single-cell+RNA-seq+preprocessing+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows.</a> Genome Biology. 22 (1), 339(2021).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li>
<li>Gao, X. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+of+the+rat+carotid+arteries+uncovers+potential+cellular+targets+of+neointimal+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152(2021).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+the+lumen+of+mouse+carotid+arteries+for+single-cell+multi-omics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63128(2021).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט להכנת תרחיף חד-תאי איכותי מעורק התרדמה של עכברי בר, שבו נבנתה שיטת עיכול דו-שלבית המשלבת את תהליך העיכול של collagenase/DNase וטריפסין. לאחר בדיקת האיכות של ההשעיה של תא בודד, מצאנו כי הוא עונה על הדרישות לריצוף תא בודד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. יתר על כן, מגוון סוגי תאים בעורק התרדמה, כולל VSMCs, פיברובלסטים, ECs ו- Mφ / DCs, זוהו בהצלחה לאחר עיבוד נתונים של תא יחיד.
השיטות הנוכחיות להכנת תרחיפים חד-תאיים של התרדמה עדיין נדירות. Depuydt et al. השיגו תרחיף חד-תאי מפלאק התרדמה האנושי על ידי שילוב של collagenase, DNase, מקטע אלבומין אנושי V ו-Flavopiridol בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקותו-15 דקות. לאחר מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, הם זיהו 14 אוכלוסיות תאים נפרדות, כולל תאי אנדותל, תאי שריר חלק, תאי פיטום, תאי B, תאים מיאלואידים ותאי T15. יתר על כן, החוקרים עיכלו עורקי התרדמה הנפוצים של חולדות באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA ו-0.1% קולגנאז ב-37°C וביצעו בהצלחה ריצוף RNA חד-תאי16. חמישה סוגי תאים, כולל VSMCs, פיברובלסטים, ECs, תאי מעבר ומקרופאגים, זוהו הן בעורקי התרדמה הרגילים והן בעורקי התרדמה הניסיוניים16. בנוסף, נקבע גם פרוטוקול לקבלת תכשירים חד-תאיים מועשרים ב-EC של עורק התרדמה17. לאחר השלמת העיכול האנזימטי הלומינלי, שטיפת עורק התרדמה תשיג מספיק כדורים חד-תאיים עבור scRNAseq ו-scATACseq17. כדי לשלוט באופן גמיש בזמן העיכול, פיתחנו שיטת עיכול דו-שלבית לעורקי התרדמה של עכברים, המפרידה בין השלבים של דיסוציאציה של רקמות לבין הכנת תרחיף חד-תאי. התהליך מתחיל עם 125 CDU/mL collagenase II ו-60 U/mL DNase I למשך שעה אחת, ולאחר מכן טריפסין ללא EDTA למשך 5 דקות. באופן משמעותי, אנו יכולים לשנות כראוי כל שלב של השיטה לעיכול של רקמות כלי דם אחרים בהתבסס על המאפיינים של כלי הדם.
ישנן כמה מגבלות של השיטה המתוארת. ראשית, איננו יודעים אם שיטה זו יכולה לשמש לתרבית תאים ראשונית במבחנה. מכיוון שדופן עורק התרדמה דקה יותר ויש בה פחות תאים, הדרך לתרבית ולהתרחב במבחנה היא מאתגרת. שנית, בניגוד לשיטות עיכול אחרות, פרוטוקול זה דורש פיפטינג עדין כדי לנתק תאים במהלך העיכול. אמבט מים מטלטל עלול גם לגרום לתרחיף חד-תאי באיכות טובה. שלישית, מכיוון שהשיטה שלנו ישימה לעורקי התרדמה הרגילים, נותר לחקור אם היא מתאימה לעיכול רובד התרדמה.
לסיכום, תכננו שיטת עיכול דו-שלבית כדי להשיג תרחיף חד-תאי באיכות גבוהה מעורק התרדמה של עכברי בר. פרוטוקול זה עשוי לשמש להכנת מתלים חד-תאיים עבור כלי דם אחרים עם שינויים קלים, מה שהופך אותו מועיל מאוד במחקר לב וכלי דם.

טרשת עורקים היא מחלה דלקתית כרונית הקשורה לגורמי סיכון כגון לחץ דם גבוה, היפרליפידמיה, והמודינמיקה1. התפצלויות בעורק התרדמה מועדות לשינויים המודינמיים ומובילות להיווצרות רובד התרדמה. ההצגה הקלינית של טרשת עורקים קרוטיד יכולה להיות חריפה כגון שבץ מוחי ואיסכמיה מוחית חולפת, או כרונית כגון איסכמיה מוחית חולפת חוזרת ודמנציה וסקולרית2. מבחינה מכנית, רובד התרדמה הוא תוצאה של אינטראקציה בין תאי דופן כלי דם שונים ותאי דם שונים בתנאים פתולוגיים. לכן, חשיפת האטלס החד-תאי של כלי התרדמה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים חשובה במיוחד למניעה וטיפול בהתפתחות פלאק התרדמה.
ריצוף RNA חד-תאי הוא אחת הטכנולוגיות החזקות ביותר של המחקר הביולוגי בגלל הרזולוציה הגבוהה במיוחד שלו וזיהוי הטרוגניות התא מאותו סוג תא של אורגניזמים 3,4. חוקרים השתמשו בריצוף RNA חד-תאי כדי לערוך מחקרים בתחומים רבים, כגון מחלות לב וכלי דם5 וסרטן6. עם זאת, הפרדה מהירה ומדויקת של רקמות לתאים בודדים היא עדיין אחד האתגרים העיקריים. דיסוציאציה אנזימטית היא שיטה נפוצה הכוללת בעיקר קולגנאז, פפאין, טריפסין, DNase והיאלורונידאז. בפרט, collagenases הם מיני האנזימים העיקריים לעיכול של תא יחיד, בעיקר הידרוליזה של רכיבי קולגן ברקמות חיבור. סוגים שונים של collagenase ישימים לדיסוציאציה של רקמות שונות, כגון בלוטת החלב7, גלומרולוס8, זווית אירידוקרנית9, מפרק הברך 10, אבי העורקים11 וריאה12. בשל התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות של רקמות שונות, דיסוציאציה באותה שיטה עלולה לגרום לבעיות רבות ברכישת תאים בודדים, כגון כדאיות נמוכה של תאים, מספר תאים נמוך ופסולת תאים גדולים. לכן, המצאת שיטות העיכול לרקמות שונות חיונית להכנת תרחיפים חד-תאיים באיכות גבוהה.
פרוטוקול זה נועד לפתח שיטת עיכול תאים דו-שלבית להכנת תרחיף חד-תאי של עורק התרדמה של עכברי בר. בהתאם למאפיינים של עורק התרדמה, שילבנו collagenase/DNase עם טריפסין כדי לקבל תרחיף חד-תאי באיכות גבוהה של עורק התרדמה של עכבר, מכיוון ש-collagenase יכול לבצע הידרוליזה של קולגן ברקמות התרדמה, אשר התעכל עוד יותר על-ידי טריפסין לתרחיף חד-תאי. ספירת פלואורסצנטיות כפולה של Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) שימשה לזיהוי כדאיות התא וריכוזו, ונמצא כי התרחיף החד-תאי עונה על הדרישות לריצוף תא יחיד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. לאחר עיבוד נתונים של תא בודד, ארבעה סוגי תאים, כולל תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs), פיברובלסטים, תאי אנדותל (ECs), מקרופאגים ותאים דנדריטיים (Mφ/DCs), זוהו בעורקי התרדמה הרגילים של עכברים לאחר העיכול. היתרונות של פרוטוקול זה הם: 1) ניתן לזהות סוגי תאים מרובים בעורק התרדמה, 2) כדאיות התא נשמרת היטב, 3) ניתן לחזור עליו בקלות ללא ציוד מיוחד. פרוטוקול זה מתאים לחוקרים המעוניינים לחקור מולטיומיקה חד-תאית של עורקי התרדמה בעכבר. פרוטוקול זה עשוי גם להיות מועיל בדיסוציאציה של כלי דם אחרים עם שינויים מתאימים.

<table><tbody><tr><td>0.25% טריפסין נטול EDTA</td><td>Beyotime</td><td>C0205</td><td>מדלל 1 מ"ל של 0.25% טריפסין נטול EDTA ל-1 מ"ל של 1x PBS.</td></tr><tr><td>תמיסת מלח NaCl 0.9%</td><td>Beyotime</td><td>ST341</td><td>לדלל את תמיסת הנתרן הפרין לריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>מזרקים של 1 מ"ל</td>&<td>nbsp; SKJYLEAN</td><td>sk-r009</td><td>לביצוע זלוף לב</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>KIRGEN</td><td>KG2211W</td><td>לצנטריפוגה של חתיכת הרקמה ותרחיף התאים</td></tr><tr><td>מזרקים של 20 מ"ל</td><td>SKJYLEAN</td><td>sk-r013</td><td>לביצוע זלוף לב</td></tr><tr><td>40 ומיקרו; מסננת תאים</td><td>m JETBIOFIL</td><td>css010040</td><td>לסינון שברי רקמות לא מעוכלות</td></tr><tr><td>ערכת AO/PI</td><td>Hengrui Biological</td><td>RE010212</td><td>לזהות אם התא חי או מת</td></tr><tr><td>מונה תאים אוטומטי</td><td>Countstar</td><td>Mira FL</td><td>לנתח את מורפולוגיה התא ואת כדאיות התאים של תאי כלי דם צוואר מעוכלים</td></tr><tr><td>תוכנת Cell Ranger</td><td>10 פעמים; גנומיקה</td><td>3.0.2</td><td>לעבד פלט RNA-seq של תא יחיד של כרום ולבצע אשכולות וניתוח ביטוי גנים</td></tr><tr><td>ערכות ריאגנט של תא יחיד כרום 3'Reagent v3</td><td>10&times; גנומיקה</td><td>1000075</td><td>להכין ספריות RNA-seq חד-תאיות של תרחיף חד-תאי</td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>II סיגמא-אולדריץ'</td><td>C6885</td><td>לדלל עם HBSS לריכוז סופי של 125 CDU/mL</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Worthington</td><td>LS002140</td><td>לדלל עם HBSS לריכוז סופי של 60 U/mL</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30088.03</td><td>סיום תגובת העיכול</td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק&nbsp;</td><td>Gibco</td><td></td><td>14175095 חנות בחדר טמפרטורה</td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין</td><td>Solarbio Life Science</td><td>H8060</td><td>לדלל עם 0.9% NaCl לריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>תרמו פישר</td><td>75002560</td><td>מיושם לספינינג הרקמות וכדורי התאים</td></tr><tr><td>NovaSeq 6000&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>N/A</td><td>Sequencer</td></tr><tr><td>מי מלח עם פוספט</td><td>Solarbio Life Science</td><td>P1000</td><td>משמש לזלוף לב והשעיה מחדש של תאים</td></tr><tr><td>חבילת Seurat- R</td><td>Satija Lab</td><td>3.1.2</td><td>לביצוע הפחתת מימדות, הדמיה וניתוח של נתוני ריצוף scRNA</td></tr><tr><td>לוחות תרבית תאים עם שש בארות</td><td>NEST</td><td>703002</td><td>מקם את רקמת כלי הדם</td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>Jinghong</td><td>DK-S22</td><td>שמור על טמפרטורת העיכול על 37 מעלות; ג</td></tr></tbody></table>

הכנת תרחיף חד-תאי מעורקי התרדמה של העכבר לריצוף חד-תאי

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

עורקי התרדמה הם כלי דם מרכזיים בצוואר המספקים דם וחמצן למוח, אך היצרות התרדמה מתרחשת כאשר עורקי התרדמה נסתמים על ידי פלאק. חשיפת ההרכב התאי של עורק התרדמה ברמת התא הבודד חיונית לטיפול בטרשת עורקים של התרדמה. עם זאת, אין פרוטוקול מוכן לשימוש להכנת מתלים חד-תאיים מעורקי התרדמה. כדי לקבל פרוטוקול מתאים לדיסוציאציה של עורקי התרדמה הרגילים ברמת התא הבודד עם פחות נזק לתאים, תכננו שיטת עיכול דו-שלבית על ידי שילוב תהליך העיכול של collagenase/DNase וטריפסין. ספירת פלואורסצנטיות כפולה של Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) שימשה לזיהוי כדאיות התא וריכוזו, ונמצא כי התרחיף החד-תאי עונה על הדרישות לריצוף תא יחיד, עם כדאיות של תאים מעל 85% וריכוז תאים גבוה. לאחר עיבוד נתונים של תא בודד, חציון של ~2500 תעתיקים לכל תא זוהו בכל תא עורק התרדמה. יש לציין כי מגוון סוגי תאים של עורק התרדמה התקין, כולל תאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs), פיברובלסטים, תאי אנדותל (ECs), מקרופאגים ותאים דנדריטיים (Mφ/DCs), היו ניתנים לגילוי בו זמנית. פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם להכנת תרחיף חד תאי של כלי דם מרקמות אחרות עם שינויים מתאימים.

פרוטוקול זה מתאר שיטת עיכול תאים דו-שלבית להכנת תרחיף חד-תאי של עורקי התרדמה של עכברים (איור 1). שיטת עיכול תאים דו-שלבית זו משלבת collagenase/DNase עם טריפסין כדי לנתק ביעילות את דופן כלי התרדמה של העכבר כדי להשיג מתלים חד-תאיים באיכות גבוהה לריצוף תא יחיד. לאחר הדיסוציאציה, ריכוז התא ויכולת הקיום של התא חושבו על ידי מונה תאים אוטומטי. השדה הבהיר הראה את המורפולוגיה של תאי כלי התרדמה לאחר העיכול, וצביעה פלואורסצנטית כפולה של AOPI זיהתה בו זמנית את כדאיות התאים (איור 2A,B). יש לציין כי בהשוואה לשימוש בריאגנט דיסוציאציה A בלבד, רקמת עורק התרדמה יכולה להיות מנותקת באופן יסודי יותר בשילוב עם מגיב דיסוציאציה B. בנוסף, מצאנו ספירת תאים בת-קיימא של תשעה עורקים, וקוטר התא הממוצע סיפק את הדרישות של ריצוף חד-תאי לאחר עיכול תאים דו-שלבי (איור 2C). בינתיים, 176,000 תאים בודדים נאספו מתשעה קרוטידים, ורוב כלי הדם נותקו לתאים בודדים עם כדאיות גבוהה (איור 2C).
לאחר יישור, סינון, ספירת ברקוד וספירת UMI, הנתונים הגולמיים של ריצוף תא בודד נותחו באמצעות חבילת R Seurat. התפלגות הגנים לתא, UMI לכל תא והקריאות המיטוכונדריאליות לכל תא מוצגות בחלקות כינור (איור 3A-C). יש לציין כי בכל תא של ~2500 תעתיקים לתא זוהה חציון של ~2500 תעתיקים לכל תא. לאחר הסרת התאים באיכות נמוכה, 14,580 תאים זוהו ושימשו לניתוח RNA-seq חד-תאי במורד הזרם. באמצעות שימוש ב-2,000 גנים משתנים עם פרופילים דומים, אשכולות ללא פיקוח מבוססי Seurat הראו ארבעה סוגי תאים עיקריים, כולל VSMCs (74.0%), פיברובלסטים (16.5%), ECs (6.5%) ו-Mφ/DCs (3.0%), בעורקי התרדמה הרגילים של עכברים לאחר העיכול (איור 3D-F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65863/65863fig01.jpg"> איור 1: תרשים סכמטי של עיכול עורק התרדמה של עכברים. לאחר שעורק התרדמה של העכבר בודד ונחתך, נוסף 500 μL של מגיב דיסוציאציה A כדי לנתק את עורק התרדמה של העכבר. כאשר תרחיף התא סונן וצנטריפוג, 200 μL של מגיב דיסוציאציה B נוספו לדיסוציאציה נוספת כדי לקבל תרחיף חד-תאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65863/65863fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65863/65863fig02.jpg"> איור 2: הכנת תרחיף חד-תאי מעורק התרדמה של עכבר. (A) המורפולוגיה של התא ויכולת הקיום התאית של תאי עורק התרדמה לאחר שעה אחת של עיכול עם מגיב דיסוציאציה A מוצגים בתצוגת השדה הבהיר ובצביעת AOPI. תאים בעלי גרעין המוכתמים בפלואורסצנטיות ירוקה הם תאים חיים, ואילו אלה המוכתמים בפלואורסצנטיות אדומה הם תאים מתים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) המורפולוגיה התאית ויכולת הקיום התאית של תאי עורק התרדמה לאחר עיכול תאים דו-שלבי מוצגים בתצוגת השדה הבהיר ובצביעת AOPI. תאים בעלי גרעין המוכתמים בפלואורסצנטיות ירוקה הם תאים חיים, ואילו אלה המוכתמים בפלואורסצנטיות אדומה הם תאים מתים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) יכולת הקיום של התא, ספירת התאים הכוללת, ספירת התאים בת קיימא וקוטר התא הממוצע נמדדו לאחר עיכול תאים דו-שלבי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65863/65863fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65863/65863fig03.jpg"> איור 3: מדדי בקרת איכות סטנדרטיים (QC) עבור scRNA-seq ונוף התאים של עורק התרדמה . (A) תרשימי כינור המראים את התפלגות הגנים לתא (nFeature RNA), (B) UMI לכל תא (nCount_RNA), ו-(C) קריאות מיטוכונדריאליות לכל תא (אחוז mt) עבור נתוני scRNA-seq. (D) תרשים סעפת אחידה של קירוב והיטל (UMAP) המציג את ארבעת סוגי התאים המזוהים של עורק התרדמה. (E) תרשים נקודה המציג את הסמנים המגדירים כל סוג של אשכול תאים בלוח D. הגודל של כל עיגול מציין את יחס התאים בתוך הקבוצה המבטא כל תעתיק . הנקודות הכחולות מציינות גנים בעלי ביטוי גבוה והנקודות האפורות מציינות גנים בעלי ביטוי נמוך. (F) תרשים מוט מוערם המציג את השפע היחסי של ארבעת סוגי התאים שזוהו על-ידי scRNA-seq של עכברי בר (WT). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65863/65863fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כאן אנו מתארים פרוטוקול עיכול תאים דו-שלבי להכנת תרחיף חד-תאי של עורקי התרדמה של עכברים.

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

מסיסות נמוכה ותחקיר תאים גדול יותר הם הקשיים העיקריים של דיסוציאציה של רקמת כלי הדם. שיטת שני השלבים או העיכול שלנו מתאימה מאוד לדיסוציאציה של רקמת התרדמה וניתן להשתמש בה להכנת חשדות לתאים בודדים עבור כלי דם אחרים עם שינויים קלים, מה שהופך אותה למועילה מאוד במחקר לב וכלי דם. פרוטוקול זה מתאים להשגת סוגי תאים מרובים בעורק התרדמה, וניתן לחזור עליו בקלות ללא ציוד מיוחד.בעתיד, אנו שואפים להשתמש בתת-קבוצות תאים שהתגלו על ידי ריצוף יונים של תא בודד לטיפול ממוקד במחלות לב וכלי דם.

preparation-single-cell-suspension-from-mouse-carotid-arteries-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים aggitation רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi Dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת nerual הוא הסביר.

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

הסרטון מדגים הכנה של תרחיף חד-תאי של תאי חיסון מרקמת מוח מורינה. זה כרוך בעיכול אנזימטי כדי לשחרר תאים מרקמת המוח, ואחריו צנטריפוגה הדרגתית צפיפות כדי לבודד את תאי החיסון על בסיס הצפיפות שלהם כדי לקבל את ההשעיה של תא יחיד.

הכנת תרחיף חד-תאי של תאי מערכת החיסון מרקמת המוח המורין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד במהירות את הגרעינים באיכות גבוהה מן הרקמה טרי או קפוא עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. אנו כוללים רקמת חומרי ניקוי-מכניים, היפוטוניק-מכניים הפרעה ותא פירוק אפשרויות, אשר שניהם יכול לשמש עבור בידוד של גרעין האטום.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

הפרוטוקול הנוכחי מציג שיטה מהירה, יעילה ועדינה לבידוד תאים בודדים המתאימים לניתוח RNA-seq חד-תאי משיניים שיניים חד-תאיות של עכבר, שיניים שיניים לבנות עכבר ושיניים אנושיות הגדלות ללא הרף.

בידוד מהיר של תאים בודדים מעכבר ושיניים אנושיות

אנו מציגים שיטה לבידוד תאי אנדותל וגרעינים מלומן של עורקי הצוואר של עכברים החשופים לתנאי זרימה יציבים או מופרעים כדי לבצע ניסויים באומיקה חד-תאית.

בידוד תאי אנדותל מהלומן של עורקי הצוואר של עכברים לניסויים רב-תאיים חד-תאיים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד כמות מספקת של לא-קרדיומיוציטים בודדים עם כדאיות גבוהה מלב עכבר לאחר אוטם שריר הלב (MI). זה יכול לשמש לריצוף תא בודד לאחר מכן, ניתוח ציטומטריית זרימה, ותרבית תאים ראשונית.

הכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים לריצוף RNA חד-תאי מלב עכבר בוגר לאחר אוטם שריר הלב

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

כדי להשיג פריציטים קורטיקליים במוח העכבר העומדים בדרישות scRNA-seq, אנו מציגים פרוטוקול FACS מותאם באופן קריטי המבוסס על בחירת CD13⁺/CD31⁻. השיפורים המרכזיים שלנו משפרים משמעותית את חיוניות התא ואת שלמות ה-RNA, ומאפשרים פרופיל טרנסקריפטומי אמין.

בידוד פריציטים מרקמת קורטיקת העכבר באמצעות FACS לצורך ריצוף תא יחיד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשגת תליות חד-תאיות איכותיות מקרניות עכבר שלמות באמצעות עיכול רציף עם קולגנאז A וטריפסין. שיטה זו מניבה תאים בודדים ברי קיימא עם שלמות RNA גבוהה, מה שהופך אותם לתואמים ליישומים בהמשך כמו ריצוף RNA חד-תאי וציטומטרי זרימהy.

פרוטוקול לאיסוף תלייה חד-תאית מקרנית עכברים

למדו פרוטוקול עיכול דו-שלבי להכנת תרחיף חד-תאי מעורקי התרדמה של עכברים. שיטה זו מייצרת תאים בעלי חיוניות גבוהה לריצוף חד-תאי ומאפשרת זיהוי ארבעה סוגי תאים עיקריים, תוך שימוש בציוד מעבדה רגיל בלבד.

הכנת תרחיף חד-תאי מעורקי התרדמה של העכבר לריצוף חד-תאי

גלה סרטונים נוספים