עיבוד רקמות ובידוד פיברובלסטים ראשוניים מהנרתיק האנושי

מחקר על הפרעות הפוגעות בעיקר באנשים ממין נשי אינו נחקר מספיק ואינו ממומן. צניחת איברי האגן היא הפרעה הקשורה קשר הדוק עם המין הנשי. זה קורה כאשר השרירים והרצועות נחלשים וגורמים לאיברי האגן לרדת נמוך יותר באגן, יצירת בליטה בנרתיק.

מעט ידוע על אינטראקציות תאיות בהקשר של פתופיזיולוגיה זו, וגם לא כיצד גורמים ברמת הרקמה משפיעים על הצלחת התערבויות כירורגיות. בידוד של פיברובלסטים ראשוניים מהנרתיק האנושי עשוי להיות שימושי לחקר מנגנונים ביולוגיים העומדים בבסיס צניחת איברי האגן. צניחת איברי האגן משפיעה בדרך כלל על אנשים מבוגרים או לאחר גיל המעבר.

בידוד והתפשטות של פיברובלסטים ראשוניים מחקר של מצב זה הוא מאתגר בשל אוכלוסיות תאים מופחתות ויכולת קלונוגנית של תורמים מבוגרים. רוב המאמרים המשתמשים בדגימות נרתיק אנושיות משתמשים ברקמה מאנשים לפני גיל המעבר עם צניחת איברי האגן. למרות שכמה מאמרים דיווחו על שימוש בדגימות הן מאנשים לפני גיל המעבר והן לאחר גיל המעבר, הם לא תיארו בפירוט מספיק את הפרוטוקול המשמש לבידוד מוצלח של פיברובלסטים מתורמים מבוגרים או לאחר גיל המעבר.

בידוד ומידול מחלות באמצעות פיברובלסטים מרקמה לאחר גיל המעבר עשויים להיות חיוניים להבנת הפתופיזיולוגיה התאית של צניחת איברי האגן מכיוון שמצב זה הוא בעל השכיחות הגבוהה ביותר בקרב אנשים בעשור שלאחר גיל המעבר, אנו מתארים שיטה לבידוד ותרבית של תרחיף חד תאי מועשר בפיברובלסטים מרקמת הנרתיק האנושית באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית ואנזימטית. מאמר זה מתאר פרוטוקול אמין כיצד לרכוש פיברובלסטים נרתיקיים אנושיים לאחר גיל המעבר או הזדקנות. רקמות שנקטפו נותחו היסטולוגית כדי לאמת את הפרוטוקול.

למדוד ולחתוך את הרקמה לגודל של כסנטימטר אחד בריבוע. הקפידו על מדידה מדויקת של גודל הביופסיה. הכינו שתיים עד שלוש ביופסיות נרתיקיות נוספות, בגודל של סנטימטר אחד בריבוע כל אחת מתורם בודד והניחו את הביופסיות בצד.

לאחר הנחת ביופסיית הנרתיק בצלחת פטרי תרבית תאים, לטחון את רקמת הנרתיק לשברים קטנים, באמצעות שני אזמלים סטריליים. ודא שקצות הלהבים מאונכים לפני השטח של הרקמה. יש להפעיל לחץ שווה ויציב על פני הרקמה, באמצעות שני אזמלים.

בצע פעולת משיכה לסירוגין כדי לחתוך את הרקמות לחתיכות קטנות מאוד. חזור על טכניקת טחינה זו, באמצעות שני אזמלים, עד שהדגימה תהיה עקבית אחידה עם חתיכות מילימטר עד שניים. הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של מדיה תרבית תאים ללא סרום לצלחת, להשהות את הרקמה הטחונה.

פיפטה התמיסה המכילה שברי רקמות למעלה ולמטה כדי לשבור את כל הגושים. מעבירים את התמיסה המכילה שברי רקמות לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסף מדיה נוספת של תרבית תאים ללא סרום עד שהנפח הכולל הוא 10 מיליליטר.

לאחסן Liberase ב 230 microliter aliquots לשימוש. הוסף 230 מיקרוליטר של Liberace לצינור. לדגור את הצינורות במשך שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה נמרצת מתמדת, באמצעות מיקסר דגימה.

שמור על תסיסה מתמדת. מערבלים את הצינורות במרווחים של 30 דקות במהלך הדגירה. דגימות צנטריפוגות במשך חמש דקות ב 3000 גרם.להסיר ולהשליך את supernatant.

יש להשהות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד עד שניים של תרבית תאים עם נסיוב בקר עוברי 10% כדי לדלל את הליבראז. פיפטה נמרצת עד שהגלולה תלויה מחדש במלואה. מסננים את תרחיף אנזימי הרקמה על ידי פיפטוף עדין של התמיסה מעל מסננת התא.

משוך תרחיפים של תאים מביופסיות רקמה מרובות של אותו תורם יחד. בעזרת בוכנה של מזרק סטרילי של חמישה מיליליטר, לחץ דרך תרחיף אנזים הרקמה מעל המסננת. חזור על שלב זה עד שנראה כי שברי הרקמה הנותרים נלחצים במלואם.

הצלחת משכה את תרחיף התאים מביופסיות נרתיקיות מרובות מאותו תורם על צלחת פטרי אחת. לאחר דגירה של לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, יש להתבונן בתאים במיקרוסקופ ניגוד פאזה. הקפידו למקד את המיקרוסקופ בתחתית הצלחת.

מספר קטן של פיברובלסטים יחוברו לתחתית. להלן ייצוג דיאגרמטי של הפרוטוקול, המדגיש שלבים מרכזיים. איור שני מציג תמונת ניגודיות פאזה של תאים מרחפים ביום האפס.

איור 3 הוא תמונת ניגודיות פאזה של פיברובלסטים ראשוניים בנרתיק ביום ה-14 של התרבית בהגדלה של פי 100 מתרחיף משוך של שלוש ביופסיות של רקמה בריבוע של סנטימטר אחד. טבלה ראשונה מציגה את התוצאות משימוש בפרוטוקולים אחרים כדי לנסות בידוד פיברובלסטים בנרתיק במחקר הנוכחי. פיברובלסטים זוהו על ידי צביעה חיובית של המנטון.

ניתוח אימונופלואורסנציה בוצע על רקמות נרתיק לפני גיל המעבר ולאחר גיל המעבר המוצגות כאן. התמונות צולמו בהגדלה של פי 200. פיברובלסטים מבודדים הוכתמו גם באקטין שריר חלק אלפא ואקטין F בדגימות רקמה לפני גיל המעבר ולאחר גיל המעבר.

פיתחנו פרוטוקול אופטימלי ואמין לבידוד פיברובלסטים ראשוניים מרירית הנרתיק בתורמים מבוגרים. שימוש בפרוטוקולים שפורסמו בעבר עבור רקמות בעלי חיים ובני אדם לדיסוציאציה של תאים ראשוניים לא הצליח לחלץ פיברובלסטים כלשהם מדגימות נרתיק אנושיות במחקר זה. אנו משערים שתי סיבות אפשריות לאתגרים של ניתוק תאים מרקמת הנרתיק האנושית.

עובי העור של הרירית גדול יותר אצל תורמים מבוגרים ובהשוואה לזה של רקמה שאינה רירית, וצפיפות הפיברובלסטים עשויה להיות מופחתת במידה ניכרת אצל אנשים מבוגרים. אין לשנות כמה שלבים קריטיים. יישום עיכול מכני קפדני מאוד, תוך שימוש בטכניקת שני אזמלים, ומשיכת תרחיף התא של שלוש עד ארבע ביופסיות בעובי מלא של תורם יחיד.

לפרוטוקול שלנו יש יתרון מובהק. העיכול המכני והאנזימטי מובילים לתפוקות טובות יותר עבור רקמות לאחר גיל המעבר, אך אין להם השפעה שלילית על דגימות לפני גיל המעבר. אנו מכירים במספר מגבלות לפרוטוקול שלנו.

הגישה לרקמת הנרתיק האנושית עשויה להיות מאתגרת במצבים בהם ניתוח צניחת נרתיק אינו מבוצע, והצורך במשיכת מתלי תאים של דגימות ביופסיה מרובות של רקמות עשוי גם הוא להוות מגבלה. פרוטוקול זה לדרישת פיברובלסטים בנרתיק האנושי יהיה כלי שימושי למחקרים עתידיים בהפרעות ברצפת האגן, במיוחד אצל אנשים לאחר גיל המעבר, כמו גם תוספת חשובה למחקר בריאות האישה.