הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

טכניקה זו נועדה לעזור לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה של המטופויזיס נורמלי ומחלות במח העצם על ידי הזרקה בטוחה והשתלה של דגימות חולים יקרות ערך לתוך העכברים דרך הפה, ולאחר מכן שאיפה של מח העצם. זה כבר זמן רב ידוע כי יעיל יותר להשתיל כמויות קטנות של דגימות יקרות ישירות לתוך מח העצם של עכברים עבור ניסויים שנעשו על ידי הזרקה תוך ורידי. עם זאת, אין סרטונים טכניים בפועל, ולכן זה נחשב בדרך כלל טכניקה משוכה גבוהה.

הפרוטוקול שלנו מאפשר להשתיל בקלות ובבטחה כל דגימה בעלת ערך בעכבר עם מספר קטן של תאים. יש ביקוש גבוה לטכנולוגיה זו, ובעזרת וידאו זה, כל אחד יכול ללמוד את זה במהירות. אנו מקווים שכולם יוכלו לשלוט בטכנולוגיה זו ולתרום באופן משמעותי לקידום המדע.

כדי להתחיל, הכינו תרחיפים של תאים עם עד 3 מיליון תאים לדוגמה באמצעות 20 מיקרוליטר של FACS, חיץ או אמצעי הפשרה. יש לשמור אותם על קרח לפני ההזרקה. יש לחטא את הרגל המכילה את עצם הירך ולהזריק לה שלושה סטים של פילינג לסירוגין באמצעות פילינג פובידון יוד או כלורהקסידין וספוגי גזה ספוגי גזה ספוגי אתנול 70%.

ייצבו את הרגל על ידי צביטת עצם הירך עם האגודל והאצבעות המורה. דחפו את השוקה עם הטבעת או עם האצבע החמישית כדי לשמור על השוקה כפופה מעצם הירך. ודא מיקום נכון להזרקה מוצלחת.

השתמש בקצה של מחט סטרילית ריקה 27G כדי לנקר את גיד הפטלר על גבי עצם הירך. כדי להבטיח את נקודת ההחדרה הטובה ביותר, הכנס את מחט 27G עם מזרק מחובר ממש מתחת לגיד הפטלרי. הניחו אותו בבטחה בין שתי הקונדילים של עצם הירך, סובבו את המחט כלפי חוץ וכלפי מעלה כדי ליישר אותה במקביל למוט עצם הירך.

סובבו את המחט במעגלים תוך כדי הקדמתה לחלל מח הירך. הכנס את המחט עד שיש ירידה ניכרת בהתנגדות. אשר מיקום מחט נכון על ידי תנועה לרוחב.

צור לחץ שלילי על ידי משיכת בוכנה המחט לאחור תוך הזזת המחט בתוך חלל מח העצם. בדוק אם יש דם או מח במזרק כדי לוודא שהמחט נמצאת בחלל מח העצם. לאחר הבטחת מיקום המחט הנכון, להסיר אותו לאט ולהכניס את התא המכיל מזרק דרך אותו שורש.

חשוב לזכור את השורש והזווית של הזריקה הראשונה בעת המעבר למחט חדשה. לאחר שהתאים מוזרקים בהצלחה לתוך עצם הירך, בזהירות להסיר את המחט ואת מזרק, שמירה על לחץ על המזרק. לאחר מכן הסר את העכבר מחרוט האף והנח אותו על מגבת נייר נקייה כדי למנוע שאיפה של מצעים.

להתאוששות, השאר את העכבר על כרית חימום או משטח מבוקר אחר. ודא התאוששות מהרדמה לפני שתחזיר אותם למדף העכבר. צפו בעכברים לסימני מצוקה או זיהום במהלך 24 השעות הבאות.

התחל על ידי הכנה להליך לפני שאיפת מח העצם, להרטיב מזרק 0.5 מיליליטר 27G עם CSM על ידי מילוי והוצאת CSM פעמיים עד שלוש. לאחר מכן שאפו בעדינות את מח העצם מהעכבר המורדם, והניבו 20 עד 50 מיקרוליטר מח עצם. לאחר מכן להסיר באופן מלא את המחט מן עצם הירך ולהשעות את הדגימה aspirated ב 500 מיקרוליטר של CSM.

הסר את העכבר מחרוט האף והנח אותו על מגבת נייר נקייה כדי למנוע שאיפת מצעים במהלך ההתאוששות. נטר את כל העכברים כדי לוודא התאוששות מהרדמה לפני הנחתם על גב מדף העכבר. תאי גלולה ממח העצם עם סיבוב של חמש דקות ב 300G בארבע מעלות צלזיוס.

שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו חיץ ACK ליזיס לכל צינור. מערבלים את התאים להשעייתם מחדש ומניחים אותם על קרח למשך 5 עד 10 דקות. מסננים את מתלה התא דרך רשת ניילון לתוך צינור חדש.

שטפו את הצינור המקורי עם חיץ FACS והעבירו אותו דרך רשת הניילון, תאי גלולה שוב על ידי סיבוב במשך חמש דקות ב 300G בארבע מעלות צלזיוס. שואפים את הסופרנאטנט מהתאים הכדוריים ומוסיפים את תמיסת הצביעה המכילה את הנוגדנים הרצויים. שמור את הצינורות על קרח במשך 20 דקות.

לשטוף את התאים ולהמשיך לנתח אותם בהתאם למערך הניסוי. ניתן להעריך בקלות טכניקות השתלה עם פלישה מינימלית של עכבר באמצעות תמונת ביולומינסנציה. כאן נצפתה השתלה של קו תאי K562 שמקורו בבני אדם עם Acalook במודל עכבר xenograft בצד עצם הירך המוזרקת.

השתלת HSPCs חיוביים ל- CD34 הביאה ליותר מ -10 עד 20% מקליטת התאים האנושיים בשמונה שבועות לאחר ההשתלה. באופן דומה, השתלת HSCs שמקורם בדם טבורי הביאה לקליטה אנושית של עד 10% לאחר ההשתלה. השתלה מוצלחת נוספת של HSPCs שמקורם במח עצם בוגר, תאי גזע של לוקמיה, HSPCs שמקורם בדם טבורי CRISPR Cas9 ותאי AML iPSCs שמקורם בחולים הושגה באמצעות הליך זה.