Name: בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: למדו פרוטוקול חדשני לבידוד תאי מעיים מזחלי דגי זברה בני 5 ימים לריצוף RNA חד-תאי. השיטה מאפשרת זיהוי סוגי תאים שונים ומובילה להבנה מעמיקה של התפתחות מערכת העיכול ומחלותיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי ידידי קרן סופיה (SSWO WAR-63).

כל גידול דגי הזברה והניסויים נערכו על פי ההנחיות המוסדיות של ארסמוס MC וחקיקת רווחת בעלי חיים. השימוש בזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה נופל תחת הקטגוריה של ניסויים שאינם דורשים אישור אתי רשמי, כפי שנקבע בתקנות ההולנדיות.
1. השגת 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחלי בר ו-tg (phox2bb:GFP)
<ol><li>הקימו רבייה של דגי זברה פראיים ואספו 50 ביצים בתווך E3 חוצץ HEPES (להלן E3) בצלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ. השתמשו בדגים אלה כבקרה שלילית למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FAC).</li>
	<li>הקימו רבייה של דגי זברה tg (phox2bb:GFP) ואספו כ-300 ביצים ב-E3 בצלחת פטרי בקוטר 15 ס"מ.</li>
	<li>יש לשמור ביצים מופרות ב-E3 (מקסימום 50 ביצים לצלחת) במחזור אור/חושך של 14 שעות/10 שעות, באינקובטור בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>ב 1 dpf, להסיר ביצים מופרות ולתת אלה מופרות להתפתח ל 5 dpf.</li>
	<li>בחר זחלי tg (phox2bb:GFP) ב- 1 dpf.</li>
</ol>2. דיסוציאציה של זחלים שלמים
<ol><li>מרדימים 5 זחלי dpf עם 0.016% טריקאין.</li>
	<li>קוצצים 30 דגי זברה לחתיכות קטנות בעזרת סכין גילוח בצלחת פטרי המכילה 1 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA 10x.</li>
	<li>מעבירים את דג הזברה הקצוץ לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח כולל של 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA 10x ומשאירים על קרח למשך 3 שעות. פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 כל שעה כדי לעורר דיסוציאציה.</li>
</ol>3. בידוד המעי
<ol><li>מניחים 6-10 5 זחלי dpf מורדמים עם 0.016% טריקאין ברציפות, על צלחת אגרוז 1.8% (0.45 גרם אגרוז ב 25 מ"ל של E3), תחת מיקרוסקופ דיסקציה</li>
	<li>שים סיכת חרק אחת בראשו של דג הזברה.</li>
	<li>הסר את כל E3 הנותרים באמצעות רקמה.</li>
	<li>בודדו את המעי באמצעות סיכת חרקים אחרת, מבלי להפריע לאיברים אחרים. ודאו שהחלמון מוסר (איור משלים S1A).</li>
	<li>לאחר הבידוד, בדוק את המעי והסר את כל החומר שאינו מעיים (למשל, עור, שומן, כבד) במידת הצורך.</li>
	<li>אספו את המעי בפינצטה והניחו אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה, המכיל מלח חוצץ פוספט (PBS) עם 10% נסיוב עגל עוברי (FCS), על קרח. הערה: יש לבודד לפחות 244 מעיים, תוך שמירה על זמן הדיסקציה הכולל על 3 שעות. זה אפשרי עם שני אנשים שעובדים במקביל.</li>
</ol>4. דיסוציאציה של המעי
<ol><li>מיד לאחר הדיסקציה של כל המעיים, צנטריפוגה את צינור microcentrifuge במהירות מלאה (13,800 × גרם) במשך 30 שניות.</li>
	<li>הסר את PBS / 10% FCS אך השאר כמות קטנה (~ 100 μL) כדי למנוע מהמעיים להתייבש. הוסף 500 μL של 2.17 מ"ג / מ"ל פפאין HBSS המכיל CaCl2 ו MgCl2, כדי לנתק תאים.</li>
	<li>הפעל פפאין עם 2.5 μL של ציסטאין (1 M).</li>
	<li>לדגור את המעיים באמבט מים ב 37 ° C במשך 10 דקות. פיפטה למעלה ולמטה באמצע הדרך (לאחר 5 דקות) כדי לעורר עיכול רקמות אנזימטי.</li>
	<li>העבר תאים לצינור FACS באמצעות מסננת תאים של 35 מיקרומטר, שהורטבה מראש עם 0.5 מ"ל של PBS / 10% FCS.</li>
	<li>שטפו את המסננת על ידי הוספת סך של 2 מ"ל PBS / 10% FCS בשלבים של 0.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 700 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 300 μL של PBS / 10% FCS.</li>
	<li>הוסף 1 מיקרוגרם/מ"ל של 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לתייג תאים מתים (1:1,000) ודגר במשך 5 דקות כדי לאפשר את הוצאתם במהלך FACS.</li>
</ol>5. העשרת FACS
<ol><li>השתמשו בדגימת wildtype כדי לקבוע את השערים של אוכלוסיית התאים הממוינת על-ידי רישום 3,000 תאים על ציטומטר הזרימה (איור משלים S1B-E).</li>
	<li>השתמש בפייה של 100 מיקרומטר, קבע דיוק מיון על טוהר, והכניס את צינור האיסוף המכיל 200 μL של PBS / 5% FCS, למכונת FACS.</li>
	<li>העמיסו את תרחיף התאים של המעי ומינו תאים בודדים חיים (DAPI-שליליים) לתוך צינור האיסוף (איור 2C), על-ידי אי הכללת תאים כפולים (איור 2B) ותאים מתים (איור 2C). הערה: עבור דגי הזברה tg(phox2bb), היחס בין תאי GFP+ נבדק רק לצורך סימוכין, מכיוון שכל התאים החיים הבודדים ממוינים.</li>
	<li>שמור את צינור האיסוף על קרח לאחר מיון תאים.</li>
	<li>ספרו את תרחיף התא עם המוציטומטר, כולל בדיקת כדאיות עם טריפאן כחול. אם הכדאיות היא לפחות 80%, המשך לשלב הבא.</li>
	<li>תאים מוכנים כעת לעיבוד עבור scRNAseq (כלומר, פלטפורמת כרום גנומיקה 10x). השתמש בכ- 20,000 תאים לדגימה.</li>
</ol>

עיבוד תאי מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

<ol><li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system%2C+immune+system%2C+and+epithelium+eesponses%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSitrin%2C+M+%22The+Gastrointestinal+System%22">The Gastrointestinal System</a>. , (2014).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li>
<li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li>
<li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li>
<li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li>
<li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuromyopathies%3A+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li>
<li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg%28-8.3bphox2b%3AKaede%29+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li>
<li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070(2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290(2022).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li>
<li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).</li>
<li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKline%2C+M+%22Fishing+for+answers%3A+Isolating+enteric+neurons+and+identifying+putative+ENS+mutants%22">Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants</a>. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).</li>
<li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li>
<li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

כאן, אנו מציגים שיטה לבידוד ודיסוציאציה של המעיים של 5 זחלי דגי זברה dpf באמצעות FACS. בשיטה זו, סוגי תאי מעיים שונים נאספו ונותחו בהצלחה על ידי scRNA-seq, תוך שימוש בפלטפורמת 10x Genomics Chromium. בחרנו בקו דגי הזברה tg (phox2bb:GFP), מאחר שרצינו אינדיקציה לכך שגם תאי ENS בני קיימא יבודדו (איור 2D). עם זאת, חשוב לציין כי שיטה זו יכולה להיות מורחבת בקלות לקווי עניין אחרים של דגי זברה, שכן השתמשנו רק ב- phox2bb gating כדי להעריך את הכדאיות העצבית, ולא כדי לבחור עבור אוכלוסיית תאים ס...

מערכת העיכול (GI) היא מערכת מורכבת הממלאת תפקיד חיוני בבריאות וברווחה הכללית. הוא אחראי על העיכול והספיגה של חומרים מזינים, כמו גם חיסול של מוצרי פסולת 1,2. מערכת העיכול מורכבת ממספר סוגי תאים, כולל תאי אפיתל, תאי שריר חלק, תאי מערכת החיסון ומערכת העצבים האנטרית (ENS), אשר מתקשרים באופן הדוק זה עם זה כדי לווסת ולשמור על תפקוד מעיים תקין 3,4,5. לפגמים בהתפתחות מערכת העיכול יכולות להיות השפעות מרחיקות לכת על היבטים שונים כגון ספיגת חומרים מזינים, הרכב המיקרוביוטה, ציר המעי-מוח וה-ENS, מה שמוביל למספר הפרעות נוירומוסקולריות אנטריות, כגון מחלת הירשפרונג וחסימת מעיים כרונית 6,7. הפרעות אלה מאופיינות בחוסר תנועתיות חמור של המעי הנגרם על ידי שינויים בתאי מפתח שונים, כגון תאי interstitial של Cajal, תאי שריר חלק, ואת ENS 6,8,9. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי עדיין אינם מובנים היטב.
דג הזברה הוא אורגניזם מודל רב ערך לחקר התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי שלה בשל התפתחותה העוברית המהירה, שקיפותה בשלבים עובריים וזחליים, ויכולת גנטית 10,11,12,13,14. קיימים קווי דגי זברה טרנסגניים רבים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים. דוגמה לקו כזה היא דג הזברה tg(phox2bb:GFP), המשמש בדרך כלל לחקר ENS, שכן כל תאי phox2bb+, כולל נוירונים אנטריים, מסומנים15,16. כאן, באמצעות קו דגי הזברה tg (phox2bb:GFP), אנו מציגים שיטה לבידוד מעיים של זחלי 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) לצורך ניתוח ריצוף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) (איור 1).

<table><tbody><tr><td>10x טריפסין (0.5%)-EDTA (0.2%)</td><td>Sigma</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת תאים</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon צינור תחתון עגול 5 מ"ל (צינורות FACS) מכסה הצמד</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger v3.0.2</td><td>10X Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#D-9542</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>אולימפוס SZX16</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III מכונת מיון</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS עם CaCl2 and MgCl2</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>סיכות חרקים</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>MS-222, Tricaine</td><td>Supelco</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>Seurat v3</td><td>Stuart et&nbsp;al. (2019)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>חתול#T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף rna חד-תאי

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

מערכת העיכול מבצעת מגוון תפקודים חיוניים לחיים. פגמים מולדים המשפיעים על התפתחותה יכולים להוביל להפרעות נוירומוסקולריות אנטריות, המדגישות את החשיבות להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי. במחקר זה, אנו מציגים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה כדי להשיג תאים חיים וברי קיימא אשר יכולים לשמש לניתוח ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq). פרוטוקול זה מבוסס על דיסקציה ידנית של המעי של דג הזברה, ואחריה דיסוציאציה אנזימטית עם פפאין. לאחר מכן, תאים נשלחים למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ותאים בני קיימא נאספים עבור scRNA-seq. בשיטה זו הצלחנו לזהות בהצלחה סוגים שונים של תאי מעי, כולל תאי אפיתל, סטרומה, דם, שרירים ומערכת החיסון, כמו גם תאי עצב אנטריים ותאי גליה. לכן, אנו רואים את זה להיות משאב יקר ערך לחקר הרכב מערכת העיכול בבריאות ומחלות, באמצעות דג הזברה.

בעזרת פרוטוקול זה השגנו בידוד ודיסוציאציה מוצלחים של מעיים שלמים מ-5 זחלי dpf. באמצעות שימוש בפפאין כאנזים דיסוציאציה, שיפרנו באופן משמעותי את יכולת הקיום של התא, ואפשרנו לכידה של 46,139 אירועים המערבים תאים יחידים בני קיימא (6.4% מכלל התאים) מתוך 244 מעי מבודדים (איור 2A). זחלי הבר השלמים שימשו כאמצעי בקרה כדי להבטיח שתהליך המיון יהיה אופטימלי, מה שיאפשר זיהוי ומיון תאים יעילים. זחלים שלמים יכולים לשמש מאחר שאנו ממיינים רק תאים חיים ובודדים (איור משלים S1B-E). כל תאי המעי ה...

במאמר זה אנו מתארים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה, לצורך ניתוח ריצוף RNA חד-תאי.

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

מטרת המחקר שלנו היא לחקור את השינויים הטרנסקריפטומיים המתרחשים במהלך התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי של זחלי דגי זברה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול חדש המאפשר בידוד של סוגי תאים שונים בתוך המעי של דג הזברה, שיש לו יישומים פוטנציאליים בהבנת בריאות מערכת העיכול ומחלות. בשנים האחרונות גובר העניין בחקר האינטראקציה בין מערכת העצבים האנטרית לבין סוגי תאי מעי אחרים במהלך ההתפתחות והחולי.הבנת הדינמיקות המורכבות הללו באמצעות טכניקות מתקדמות כמו ריצוף RNA חד-תאי, טומנת בחובה פוטנציאל לחשוף תובנות קריטיות לגבי נוירומיופתיה אנטרית, שיובילו לאבחון וטיפולים מדויקים יותר. באמצעות פרוטוקול זה זיהינו בהצלחה סוגים שונים של תאי מעי, כולל אפיתל, סטרומה, דם, שרירים, תאי מערכת החיסון ואפילו תאי עצב ותאי גליה אנטריים, שלא נלכדו קודם לכן בכמות זו בגישות דומות. לכן, אנו מספקים טכניקה אמינה ללמוד את הרכב העיכול במהלך הפיתוח ואת תפקוד לקוי.

gut-isolation-from-zebrafish-larvae-for-single-cell-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הבידוד של איכות גבוהה, RNA שלם הוא צעד חיוני בפרוטוקולים מעבדה רבות. הנה, אנחנו מדגימים מיצוי RNA מעוברים דג הזברה כולו סינתזה cDNA עבור יישום עוקבת הפרוצדורות השונות כולל ניתוח ביטוי גנים microarray.

RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

סרטון זה מתאר פרוטוקול לבידוד נוירונים, מקרופאגים ותאי מיקרוגליה ממוחות של דגי זברה זחלים על-ידי שיבוש מכני של רקמת המוח. אוכלוסיות התאים המטוהרים יכולות לשמש גם לניתוח גנומי.

בידוד תאי מוח מזחלי דגי זברה: שיטה להשגת נוירונים, מקרופאגים ותאי מיקרוגליה שלמים מרקמת המוח של דגי הזברה

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד תאים בודדים מעוברי דג הזברה, העשרה לתאים מעניינים, לכידת תאי דג זברה במערכות מולטיפלקס תאים בודדים מבוססות מיקרופלואידית, והערכת ביטוי גנים מתאים בודדים.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד רקמת האשכים של דג הזברה הזחל, אשר יקל על חקירות של בידול מין דג הזברה ותחזוקה.

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד את האוכלוסייה תאים בצד מ מודל דג הזברה של myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). זה assay האוכלוסייה בצד רגיש מאוד מתואר דג הזברה T-ALL, אבל זה עשוי להיות ישים סוגים אחרים של תאים ממאירים ולא ממאיר דג הזברה.

בידוד של האוכלוסייה בצד Myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה דג הזברה

פרוטוקול זה מציג גישה לניתוח transcriptome כל מעוברים דג זברה, הזחלים, או תאים ממוינים. אנו כוללים בידוד של RNA, מסלול ניתוח של נתוני RNASeq, המבוססות על לרביעיית-PCR אימות של שינויים בביטוי הגנים.

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

אנו מציגים פרוטוקול לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה הזחל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. על בידוד, RNA מופק מן התאים האלה כדי לנתח את פרופיל ביטוי גנטי. פרוטוקול זה מאפשר האוסף של RNA באיכות גבוהה עבור ביצוע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ו- transcriptomics.

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

אנו מתארים טכניקה לפרופיל microRNAs בעוברי עכבר מוקדם. פרוטוקול זה מתגבר על האתגר של קלט תאים נמוך והעשרת RNA קטנה. תוואי זה יכול לשמש כדי לנתח שינויים בביטוי miRNA לאורך זמן בנסיגות תאים שונים של עובר העכבר המוקדם.

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

בידוד גרעיני בודד מסתמך על חדירות הדיסוציאציה וחומרי הניקוי המבוססים על קרום התא, צעדים הזקוקים לאופטימיזציה ונוטים להציג חפצים טכניים. אנו מדגימים כביסה ופרוטוקול ללא אנזים לבידוד מהיר של גרעינים שלמים ישירות מרקמות שלמות, מניב גרעינים מתאים לגרעין בודד RNA-seq (snRNA-Seq) או ATAC-seq.

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

כאן, אנו מציגים שיטה ליישור והקפאה של דגימות זחלי דג זברה מרובות (Danio rerio) ואיסוףן בשקופית אחת לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי.

סידור קומפקטי מרחבית של קטעי דג זברה זחלים לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי

למדו פרוטוקול חדשני לבידוד תאי מעיים מזחלי דגי זברה בני 5 ימים לריצוף RNA חד-תאי. השיטה מאפשרת זיהוי סוגי תאים שונים ומובילה להבנה מעמיקה של התפתחות מערכת העיכול ומחלותיה.

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

גלה סרטונים נוספים