Name: הערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית במודל עכבר אוסטאופורוזיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: חקור הערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית במודל עכבר אוסטאופורוזיס באמצעות Micro-CT וצביעת HE. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי מדויק של מבנה העצם ותומכת במחקר יעילות טיפולי רפואה סינית מסורתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המנהל המחוזי של סצ'ואן לרפואה סינית מסורתית (2021YJ0175) ופרויקט חדשנות המחקר לתארים מתקדמים של בית הספר לרפואה קלינית (LCYJSKT2023-11), אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית.

פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי הוועדה האתית לבעלי חיים של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (מספר שיא: 2020-34). נקבות עכברי C57BL/6J (בנות 12 שבועות, n = 14) חולקו לשתי קבוצות באופן אקראי, קבוצה המופעלת על ידי דמה (קבוצת Sham, n = 7) וקבוצת מודל (קבוצת OVX, n = 7). בעלי החיים נרכשו מספק מסחרי (ראו טבלת חומרים). כל העכברים הוחזקו בכלובים נפרדים בטמפרטורה של 22-26 מעלות צלזיוס עם לחות של 45%-55%, הורשו להסתגל לסביבתם החדשה למשך שבוע אחד, וסיפקו גישה חופשית למים ולתזונה. כל הניסויים בבעלי חיים נערכו באוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית, וכל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.
1. הכנת מודל בעלי חיים
<ol><li>מרדימים עכבר בן 12 שבועות על ידי הזרקה intraperitoneal עם 1.25% Avertin (Tribromoethanol באלכוהול טרט-עמיל, ראה טבלה של חומרים) במינון של 0.02 מ"ל / גרם. מקם את העכבר הנוטה לניתוח על שולחן ניתוחים סטרילי, ושתק את גפיו על ידי הדבקתן המאובטחת.</li>
	<li>השתמש מספריים (ראה טבלה של חומרים) כדי לקצץ כל שיער שעלול להשפיע על הפעולה הכירורגית. הערה: מומלץ להימנע מנזק לעור בעת הכנת אתר הניתוח.</li>
	<li>שטפו ידיים ביסודיות ולבשו כפפות כירורגיות. יש לחטא את גב העכבר שלוש פעמים בפובידון-יוד (ראו טבלת חומרים), ולהשתמש בגזה רפואית (ראו טבלת חומרים) כדי לייבש אותו. הערה: היזהר; הרטבת השיער במהלך החיטוי עלולה להוביל להיפותרמיה לאחר הניתוח בעכברים.</li>
	<li>בצע חתך באורך של כ-0.5-1.0 ס"מ, הממוקם במרחק של 1 ס"מ משליש מקו האמצע של גב העכבר, באמצעות אזמל (ראה טבלת חומרים). מפרידים בעדינות את הפאשיה וחותכים דרך השריר בעזרת מספריים לרקמות (ראו טבלת חומרים) עד שהשחלה נראית לעין. קשרו את כלי הדם שמסביב עם תפרים שאינם נספגים (ראו טבלת חומרים) והסירו את השחלה.</li>
	<li>יש לשטוף את החלל בתמיסת מלח 0.9%, ולאחר מכן לתפור בנפרד את העור, השריר והפאשיה (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>חזור על אותו רצף צעדים בצד השני.</li>
	<li>הסר שומן פרי-שחלות באותו גודל כמו השחלה, ובצע את אותו הליך כירורגי שהוזכר לעיל עבור השלבים הנותרים כדי לבסס את המודל המופעל דמה.</li>
	<li>יש לאפשר תקופת החלמה של שבוע לאחר הניתוח. לאחר 8 שבועות, מודלים עכבר osteoporotic יוקמו בהצלחה 9,10.</li>
</ol>2. סריקת Micro-CT
<ol><li>הרדימו את העכבר על ידי שאיפת CO2 עודפת. הסר רקמות רכות רבות ככל האפשר מעצם הירך של העכבר לאחר המתת חסד וקבל דגימה טרייה לסריקה. הערה: אמנם אין פתרון מושלם לשימור דגימות, אך ניתן לנקוט צעדים מסוימים כדי למקסם את האיכות של תוצאות סריקת Micro-CT. לפני הקיבוע, דאגו להסיר כמה שיותר רקמות מסביב. פורמלין או פורמלין חוצץ היא שיטת הקיבוע המועדפת ביותר עם אחסון ב- PBS11,12.</li>
	<li>לחץ פעמיים על סמל התוכנה של מערכת ההדמיה micro-CT בשולחן העבודה כדי להפעיל את המערכת (ראה טבלת חומרים). בחר מיטה לדוגמה התואמת לשדה הראייה לדוגמה (FOV) של 18 מ"מ x 18 מ"מ. טען את מיטת הדגימה המתאימה למכונה וסגור את הצוהר.</li>
	<li>לחץ על לחצן ' התחמם' בלוח הבקרה. הערה: נדרש זמן חימום קצר. אין לנסות לפתוח את הצוהר בעת יצירת צילומי רנטגן. בדוק את אור הרנטגן בלוח הקדמי ובצג המחשב כדי לוודא אם נוצרים צילומי רנטגן.</li>
	<li>לחץ/י על הכפתור ״ תפריט״ כדי להגדיר מסד נתונים חדש, ואז צור/י מדגם חדש ולמד/י.</li>
	<li>בחר ידני מהרשימה הנפתחת תפריט והזן ערכי מתח וזרם מותאמים אישית בלוח הבקרה. הגדר מתח (kV) ל- 90, זרם (μA) ל- 80, מצב סריקה לרזולוציה גבוהה, 14 דקות ו- FOV (מ"מ) ל- 18 מ"מ x 18 מ"מ. הערה: עיין במדריך עבור מערכות מיקרו CT שונות כדי להגדיר את הפרמטרים המתאימים.</li>
	<li>מקם את העצם היטב עם סרט פלסטיק במיטת הדגימה. סגור את הצוהר. ודא שהנושא ממורכז בדיוק בחלון לכידת X על-ידי לחיצה על לחצני הכוונון במכשיר. הערה: התאמת הדגימה חייבת להיות איטית ועדינה כדי למנוע ממנה ליפול למכונה בטעות.</li>
	<li>לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל בסריקת CT.</li>
</ol>3. ניתוח נתוני CT
<ol><li>הזן את התוכנה (ראה טבלת חומרים) ובחר את הנתונים לניתוח. לחץ על Sub והגדר את גודל הפיקסל ל- 10 μm. הזז ושנה את גודל אזור העניין (ROI) כך שיכלול את עצם הירך הדיסטלית מעל לוחית הצמיחה. לחץ על התחל (ראה איור 1). הערה: גודל הפיקסל לשחזור תת-נפח נבחר ב-10 מיקרומטר מכיוון שעובי טרבקולה ההדמיה הוערך בכ-20-30 מיקרומטר בהתבסס על נתונים היסטולוגיים ממחקרים קודמים13. אם יחס האות לרעש אינו מספיק לעיבוד נתונים, יש לבצע סריקה ברזולוציה גבוהה של שעה אחת.</li>
	<li>לחץ על ניתוח 3D כפתור כדי לקבל את שחזור 3D שנוצר.</li>
	<li>ייצא את הנתונים ממערכת micro-CT למחשב לניתוח.</li>
	<li>ייבא את נתוני ה- CT המשוחזרים. לחץ/י על ״ עבד את מחשבון התמונות״ > מכן לחץ/י על Region Pad > Interactive. התאם את תיבת הסימון הצהובה להחזר ההשקעה המתאים. הערה: אזור העניין (ROI) מתחיל בערך 540 מיקרומטר פרוקסימלי ללוחית הצמיחה ומשתרע 1600 מיקרומטר בסמיכות כדי להעריך את חילוף החומרים בפועל של העצם ואת שיפוץ.</li>
	<li>בחר את ההרחבה Bone Microarchitecture Analysis (BMA) (ראה טבלת חומרים). לחץ על Segment Cortex ולאחר מכן על Segment Trabeculae. הערה: הן עצם טרבקולרית והן עצם קליפת המוח) נבחרות באופן אוטומטי. בדרך כלל אין צורך בכוונון ידני.</li>
	<li>לחץ על שמור מפת אובייקטים סופית ולאחר מכן לחץ על מדידת עצם כדי לחשב מדדים מורפומטריים של עצם. הערה: רק צפיפות מינרלים יחסית של העצם (BMD) חושבה כאן מכיוון שלא נוספה בקרה.</li>
</ol>4. הסתיידות של רקמת העצם
<ol><li>קבע את דגימות העצם בפרפורמלדהיד 4% (ראה טבלת חומרים) למשך 24 שעות. שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם PBS (ראו טבלת חומרים) במשך 20 דקות בכל פעם.</li>
	<li>שטפו את הרקמה שלוש פעמים במים מזוקקים במשך 20 דקות בכל פעם. מעבירים את הרקמה לתמיסת הסתיידות המכילה EDTA (ראו טבלת חומרים) ומסתיידים למשך 30 יום עם שינוי תמיסה שבועי עד לנקודת הקצה. הערה: דקירת מחט, צביטת יד והידוק משמשים לסיום הסתיידות כאשר רקמת העצם הופכת רכה, או שאין תחושה של התנגדות בעת מחטים. השיטה הפיזית של גילוי יכול לגרום נזק מסוים למבנה הרקמה, אז לנסות למנוע כוח מוגזם או בדיקות חוזרות.</li>
	<li>הוציאו את הרקמה מהקיבוע והשתמשו באזמל כדי לחתוך את הרקמה במכסה אדים. שים את הרקמה החתוכה ואת התווית המתאימה בקופסת התייבשות.</li>
	<li>שים את קופסת ההתייבשות בסל ומייבש אותה במעבד רקמות (ראה טבלת חומרים) עם אלכוהול מדורג (75% אתנול במשך 4 שעות, 85% אתנול במשך 2 שעות, 90% אתנול במשך 2 שעות, 95% אתנול במשך 1 שעות, אתנול נטול מים במשך 30 דקות, אתנול נטול מים II במשך 30 דקות, קסילן I במשך 5-10 דקות, קסילן II למשך 5-10 דקות, שעווה I למשך שעה אחת, שעווה II למשך שעה אחת, שעווה III למשך שעה אחת).</li>
	<li>השתמש במכונת הטבעה (ראה טבלת חומרים) כדי להטמיע את הרקמה הספוגה בשעווה. יוצקים את השעווה המומסת לקופסת הטבעה ומניחים את הרקמה מקופסת ההתייבשות לפני שהשעווה מתקשה.</li>
	<li>לכוון את הרקמה בהתאם למשטח ההטבעה ולהצמיד את התווית המתאימה. מצננים על שולחן הקפאה בטמפרטורה של -20°C (ראו טבלת חומרים). הסירו את גוש השעווה מקופסת ההטבעה לאחר המיצוק וקצצו את גוש השעווה לפי הצורך (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>חתכו את גוש השעווה החתוך לשקופיות בעובי 3 מיקרומטר על מיקרוטום (ראו טבלת חומרים). ציפו את המגלשות על מים חמים בטמפרטורה של 40°C במכונה לפיזור רקמות (ראו טבלת חומרים) כדי לשטח את הרקמה ולגרוף אותן במגלשה.</li>
	<li>אופים בתנור של 60 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים) עד שהמים מתאדים והשעווה נמסה. יש להוציא ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT) לשימוש מאוחר יותר.</li>
</ol>5. הוא מכתים
<ol><li>שים את המגלשות בקסילן I למשך 20 דקות, ולאחר מכן בקסילן II למשך 20 דקות. יתר על כן, לשים את המגלשות אתנול נטול מים I ואתנול נטול מים II במשך 5 דקות כל אחד, 75% אלכוהול במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף את המגלשות עם מי ברז (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>יש לדגור בהמטוקסילין (ראו טבלת חומרים) למשך 3-5 דקות. הבדיל בין הדגימות בתמיסת חומצה הידרוכלורית (ראה טבלת חומרים). טפלו בשקופיות בתמיסת אמוניה (ראו טבלת חומרים) להדבקה, ולאחר מכן שטפו את המגלשות במים.</li>
	<li>הכניסו את המגלשות ל-85%, 95% אלכוהול הדרגתי להתייבשות והכתימו בתמיסת אאוזין (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות.</li>
	<li>שים את המגלשות אתנול נטול מים I במשך 5 דקות, אתנול נטול מים II במשך 5 דקות, אתנול נטול מים III במשך 5 דקות. טפלו בשקופיות עם קסילן I למשך 5 דקות, קסילן II למשך 5 דקות, והרכיבו עם בלסם ניטרלי (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>בחנו כל שקופית מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, בחרו את הפרוסות המייצגות לסריקה פנורמית (ראו טבלת חומרים). הערה: נדרשות לפחות שלוש פרוסות רצופות לכל דגימה. לפני סריקה פנורמית, יש לבדוק את הפרוסות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהן שלמות וברורות. ודא כי חלל מח העצם, עצם קליפת המוח, ואת העצם בוטל מוצגים במלואם וכי סוגים שונים של תאי עצם ניתן לראות.</li>
</ol>6. ניתוח תמונות HE
<ol><li>פתח תמונות HE באמצעות תוכנת CaseViewer (ראה טבלת חומרים). בחר את אזור העניין (ROI) בשקופית ושמור אותו כתמונה צבעונית. הערה: בחירת החזר ההשקעה עולה בקנה אחד עם התוכנה שהוזכרה לעיל.</li>
	<li>פתחו את התמונה ב-ImageJ (ראו טבלת חומרים). בחרו בכלי שרביט מסרגל הכלים. לחץ על עצם הטרבקולר.</li>
	<li>התאם את הגדרות הסיבולת והרצף לפי הצורך. עברו אל 'התאמות > תמונה' >'שחור-לבן ' ולחצו על הלחצן 'אשר'. חזור על השלבים עבור אזורים אחרים של העצם.</li>
	<li>הפוך את הבחירה ומלא אותה בצבע לבן. שמרו את התמונה כמסיכה לניתוח (ראו איור 2). הערה: לקבלת המתודולוגיה המפורטת, עיין בעבודה שפורסמה בעבר14.</li>
	<li>פתח את המסיכה בתוכנת הניתוח15,16 (ראה טבלת חומרים). הפעל תהליך > בינארי > Make Binary כדי להמיר את התמונה הצבעונית לתמונה בינארית.</li>
	<li>השתמש בתוסף 17 (ראה טבלת חומרים) בתוכנה כדי לנתח פרמטרים מבניים: שטח הפעלה/מקטע נפח כדי לחשב נפח עצם לנפח כולל של עצם (BV/TV [%])18,19. הערה: שיטה זו ישימה עבור עצם trabeculae ומח עצם, מילוי החזר ההשקעה כולו בתמונות HE.</li>
</ol>

צביעת HE ומיקרו-CT להערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית מורין

<ol><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+osteoporosis+in+China%2C+a+community+based+cohort+study+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis.</a> Frontiers in Public Health. 11, 1084005(2023).</li>
<li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+animal+experiments+are+still+indispensable+in+bone+research%3A+A+statement+by+the+European+Calcified+Tissue+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).</li>
<li>Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+bone+microstructure+by+micro+CT+in+C57BL%2F6J+mice+for+sex-specific+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585(2022).</li>
<li>Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+quality%3A+the+determinants+of+bone+strength+and+fragility%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bone quality: the determinants of bone strength and fragility.</a> Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).</li>
<li>Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li>
<li>Akhter, M. P., Recker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+imaging+in+bone+tissue+research-review%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">High resolution imaging in bone tissue research-review.</a> Bone. 143, 115620(2021).</li>
<li>Mys, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+3D+microstructural+parameters+of+trabecular+bone+is+affected+by+the+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software.</a> Bone. 142, 115653(2021).</li>
<li>Chavassieux, P., Chapurlat, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interest+of+bone+histomorphometry+in+bone+pathophysiology+investigation%3A+Foundation%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future.</a> Frontiers in Endocrinology. 13, 907914(2022).</li>
<li>Komori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Animal models for osteoporosis.</a> European Journal of Pharmacology. 759, 287-294 (2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomy-induced+bone+loss+in+TNF%CE%B1+and+IL6+gene+knockout+mice+is+regulated+by+different+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).</li>
<li>Baum, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+imaging%3A+effects+of+bone+preservation+on+MDCT-based+trabecular+bone+microstructure+parameters+and+finite+element+models%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models.</a> BMC Medical Imaging. 15, 22(2015).</li>
<li>Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tissue+preservation+on+murine+bone+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties.</a> Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).</li>
<li>Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excised+bone+structures+in+mice%3A+imaging+at+three-dimensional+synchrotron+radiation+micro+CT%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT.</a> Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).</li>
<li>Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+histomorphometry+using+free+and+commonly+available+software%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Bone histomorphometry using free and commonly available software.</a> Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).</li>
<li>Brandi, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarchitecture%2C+the+key+to+bone+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Microarchitecture, the key to bone quality.</a> Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Domander, R., Felder, A. A., Doube, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BoneJ2-refactoring+established+research+software%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">BoneJ2-refactoring established research software.</a> Wellcome Open Research. 6, 37(2021).</li>
<li>Parfitt, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+histomorphometry%3A+standardization+of+nomenclature%2C+symbols%2C+and+units%3A+report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).</li>
<li>Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancellous+bone+volume+is+an+indicator+for+trabecular+bone+connectivity+in+dialysis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+CJASN%22%5BJournal%5D)">Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).</li>
<li>Watts, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmenopausal+osteoporosis%3A+A+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Women%27s+Health%22%5BJournal%5D)">Postmenopausal osteoporosis: A clinical review.</a> Journal of Women's Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).</li>
<li>Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+Guidelines+and+animal+models+for+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">FDA Guidelines and animal models for osteoporosis.</a> Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).</li>
<li>Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+variations+in+the+response+of+cancellous+bone+to+ovariectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).</li>
<li>Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+development+and+age-related+bone+loss+in+male+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice.</a> Bone. 33 (3), 387-398 (2003).</li>
<li>Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+trabecular+architecture+differ+in+female+and+male+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).</li>
<li>Seeman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+and+biomechanical+basis+of+the+gain+and+loss+of+bone+strength+in+women+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism+Clinics%22%5BJournal%5D)">The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).</li>
<li>Ticha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cryo-embedding+method+for+in-depth+analysis+of+craniofacial+mini+pig+bone+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19510(2020).</li>
<li>Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CT+bone+imaging+in+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Advanced CT bone imaging in osteoporosis.</a> Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).</li>
<li>Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+acquisition+and+image+processing+to+track+and+characterize+pulmonary+nodules+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice.</a> Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אוסטאופורוזיס יכול להוביל לשברים תכופים, שהם יקרים, יכולים לגרום לכאב, נכות או אפילו מוות, ולהשפיע קשות על איכות החיים של חולים20. במהלך השנים הוכר מודל כריתת השחלות כאחת השיטות הסטנדרטיות לחקר אוסטאופורוזיס21. המודל הפרה-קליני הנפוץ ביותר בבעלי חיים לאוסטאופורוזיס הוא חולדה שעברה כריתת שחלות (OVX). למרות זאת, רוב המחקר על המנגנונים של הפרעות עצם, כולל אוסטאופורוזיס, נערך באמצעות עכברים22. כדי לבסס מודל אוסטאופורוזיס בעכברות C57/BL6J בוגרות, כריתת הש...

אוסטאופורוזיס היא מחלת עצם מטבולית נפוצה, במיוחד בקרב קשישים, והיא קשורה לסיכון מוגבר לשברים שבירים. ככל שאוסטאופורוזיס הופך נפוץ יותר בסין1, יהיה ביקוש גובר לחקר מבני העצם של בעלי חיים קטנים 2,3. השיטות הקודמות למדידת אובדן עצם מסתמכות על התוצאות של ספיגת קרני רנטגן דו-ממדית באנרגיה כפולה. עם זאת, זה לא לוכד את השינויים במיקרו-מבנה האדריכלי של עצם הטרבקולר, שהוא גורם מפתח לחוזק השלד4. המיקרו-מבנה של העצם משפיע על חוזקה, נוקשותה ועמידותה בפני שברים. על ידי השוואת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם במצבים נורמליים ופתולוגיים, ניתן לזהות שינויים במורפולוגיה, במבנה ובתפקוד של רקמת העצם הנגרמים על ידי אוסטאופורוזיס. מידע זה תורם להבנת התפתחות אוסטאופורוזיס והקשר שלה למחלות אחרות.
הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT) הפכה לאחרונה לטכניקה פופולרית להערכת מורפולוגיה של העצם, שם היא יכולה לספק נתונים מדויקים ומקיפים על מבנה העצם ופרמטרים של צפיפות כגון שבר נפח עצם, עובי והפרדה 5,6. יחד עם זאת, תוצאות Micro-CT יכולות להיות מושפעות מתוכנת הניתוח7. שיטות שונות של רכישה, הערכה ודיווח של תמונות משמשות מערכות מיקרו-CT מסחריות שונות. חוסר עקביות זה מקשה על השוואה ופירוש התוצאות המדווחות על ידי מחקרים שונים5. כמו כן, היא אינה יכולה כיום להחליף את ההיסטומורפומטריה של העצם במתן מידע לחוקרים על פרמטרים ברמה התאית במערכת השלד8. בינתיים, טכניקות היסטולוגיות מאפשרות תצפית ישירה ומדידה של המורפולוגיה המיקרוסקופית של העצם. צביעת Hematoxylin ו- eosin (HE) היא טכניקת צביעה נפוצה המשמשת בהיסטולוגיה כדי לדמיין את המבנה הכללי של תאים ורקמות. הוא משמש לזיהוי נוכחות של רקמת העצם ואת microarchitecture שלה.
מאמר זה משתמש במיקרו-CT בשילוב עם טכניקת חיתוך רקמות (צביעת Hematoxylin-Eosin [HE]) כדי לאסוף תמונות של רקמת עצם ולבצע ניתוח כמותי של עצם טרבקולרית כדי להעריך את השינויים במיקרו-מבנה העצם במודל עכבר אוסטאופורוזיס.

<table><tbody><tr><td>4% פרפורמלדהיד</td><td>ביושארפ</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>אדובי פוטושופ</td><td>אדובי בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פתרון אמוניה</td><td>צ'נגדו קולון כימית ושות', בע"מ</td><td>2021070101</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים אנטומיים</td><td>Jinzhong מכשיר כירורגי ושות', בע"מ</td><td>J3C030</td><td></td></tr><tr><td>אתנול נטול מים</td><td>צ'נגדו קולון כימית ושות', בע"מ</td><td>2022070501</td><td></td></tr><tr><td>מכונת צביעה אוטומטית</td><td>תרמו מדעית</td><td>Varistain&trade; תוסף</td> ניתוח מיקרו-ארכיטקטורת עצם Gemini ES <td></td></tr><tr><td></td><td>AnalyzeDirect, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J עכברים</td><td>SPF (בייג'ינג) ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carrier Slides</td><td>Nantong Mei Wei de Experimental Equipment Co., Ltd</td><td>220518001</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Nantong Mei Wei de Experimental Equipment Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>220518001 הסרת אבנית פתרון</td><td>ווהאן Xavier ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>CR2203047</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>Jinzhong מכשיר כירורגי ושות', בע"מ</td><td>ZJA010</td><td></td></tr><tr><td>הטמעת תיבת סימון מכונת תרמו</td><td>מדעי</td><td>&nbsp; מכונת הטבעה PrintMate AS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ווהאן ג'ונג'י אלקטרוניקה ושות', בע"מ</td><td>JB-P5</td><td></td></tr><tr><td>פיג'י: ImageJ</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אוטם סרטים</td><td>תרמו מדעי</td><td>Autostainer 360</td><td></td></tr><tr><td>שולחן הקפאה</td><td>ווהאן ג'ונג'י אלקטרוניקה ושות', בע"מ</td><td>JB-L5</td><td></td></tr><tr><td>H& ערכת צביעה E</td><td>Leagene</td><td>DH0020</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצה הידרוכלורית</td><td>סצ'ואן Xilong מדע ושות', בע"מ</td><td>210608</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ2 תוסף</td><td></td><td>BoneJ 7.0.16</td><td></td></tr><tr><td>גזה רפואית</td><td>שאנדונג אנג יאנג טכנולוגיה רפואית ושות'.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 3-0 תפרים קלועים משי שאינם נספגים</td><td>Ethicon, Inc.</td><td>SA84G</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט</td><td>Jinzhong מכשיר כירורגי ושות', בע"מ</td><td>J32010</td><td></td></tr><tr><td>ניטרלי Balsam</td><td>Sinopharm Group מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td>תנור 10004160</td><td></td></tr><tr><td></td><td>שנחאי Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A</td><td></td></tr><tr><td>PANNORAMIC סורקי שקופיות דיגיטליים</td><td>3DHISTECH בע"מ&nbsp;</td><td>PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000</td><td></td></tr><tr><td>PBS מאגר</td><td>Biosharp</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פובידון-יוד 5%</td> <td>צ'נגדו יונגאן פרמצבטיקה ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיה מיקרו-CT קוונטית GX2</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום סיבובי</td><td>תרמו מדעי</td><td>HM325</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>Quanzhou מצוינות רפואית ושות', בע"מ</td><td>20170022</td><td></td></tr><tr><td>סריקה & עיין בתוכנה</td><td>3DHISTECH בע"מ&nbsp;</td><td>CaseViewer2.4</td><td></td></tr><tr><td>כפפות כירורגיות גומי סטריליות לשימוש חד פעמי</td><td>גואנגדונג Huitong לטקס מוצרים קבוצה ושות', בע"מ</td><td>22B141EO</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן כלוריד 0.9%</td> <td>סצ'ואן קלון פרמצבטיקה ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרקים היפודרמיים סטריליים לשימוש חד פעמי</td><td>שאנדונג Weigao קבוצה מוצרי פולימר רפואי ושות', בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחטי תפר רפואיות סטריליות</td><td>שנחאי Pudong Jinhuan מוצרים רפואיים ושות', בע"מ&nbsp;</td><td>PW8068</td><td></td></tr><tr><td>מעבד רקמות</td><td>תרמו מדעי</td><td>STP420 ES</td><td></td></tr><tr><td>מכונת פיזור ואפייה רקמות</td><td>ווהאן Junjie אלקטרוניקה ושות', בע"מ</td><td>JK-6</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoethanol</td><td>Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd</td><td>M2920</td><td></td></tr><tr><td>גוזם שעווה</td><td>ווהאן Junjie אלקטרוניקה ושות', בע"מ</td><td>JXL-818</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>צ'נגדו קולון כימיקלים ושות' בע"מ</td><td>2022051901</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית במודל עכבר אוסטאופורוזיס

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

מיקרו-מבנה עצם מתייחס לסידור ואיכות רקמת העצם ברמה המיקרוסקופית. הבנת מיקרו-מבנה העצם של השלד חיונית להשגת תובנה לגבי הפתופיזיולוגיה של אוסטאופורוזיס ושיפור הטיפול בה. עם זאת, טיפול בדגימות עצם יכול להיות מורכב בשל תכונותיהן הקשות והצפופות. שנית, תוכנה מיוחדת מקשה על עיבוד וניתוח תמונה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים פתרון חסכוני וקל לשימוש לניתוח מיקרו-מבנה עצם טרבקולרית. צעדים מפורטים ואמצעי זהירות מסופקים. Micro-CT היא טכניקת הדמיה תלת-ממדית (תלת-ממדית) לא הרסנית המספקת תמונות ברזולוציה גבוהה של מבנה העצם הטרבקולרית. היא מאפשרת הערכה אובייקטיבית וכמותית של איכות העצם, ולכן היא נחשבת לשיטת תקן הזהב להערכת איכות העצם. עם זאת, היסטומורפומטריה נותרה הכרחית מכיוון שהיא מציעה פרמטרים חיוניים ברמת התא, המגשרת על הפער בין הערכות דו-ממדיות (2D) ותלת-ממדיות של דגימות עצם. באשר לטכניקות ההיסטולוגיות, בחרנו להסיר את רקמת העצם ולאחר מכן לבצע הטבעה מסורתית של פרפין. לסיכום, שילוב של שתי שיטות אלה יכול לספק מידע מקיף ומדויק יותר על מיקרו-מבנה העצם.

ניתוח מיקרו-CT מדדנו את הפרמטרים המיקרו-אדריכליים הטרבקולריים בעכברים משתי הקבוצות ודיווחנו על הערכים הממוצעים שלהם ועל SDs בטבלה 1. ההתפלגות של כמה פרמטרים (כלומר, היחס בין נפח העצם לנפח הרקמה הכולל, עובי טרבקולרי, הפרדה טרבקולרית) בתוך כל קבוצה מודגמת באיור 3.
תוצאות אלה מצביעות על הבדלים משמעותיים בין עכברים מקבוצת OVX לקבוצת Sham עבור מספר פרמטרים שהוערכו ממיקרו-CT. כלומר, ה...

פרוטוקול זה מציג שיטה חסכונית ויעילה להערכה כמותית של מיקרו-ארכיטקטורה של עצם במודל עכברי של אוסטאופורוזיס על ידי שילוב של צביעת Hematoxylin-Eosin (HE) וטכניקות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT).

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...

המחקר שלנו התמקד בהשפעות של רפואה סינית מסורתית, או TCM, על אוסטאופורוזיס. אנו מנסים לחקור את המנגנון, היעילות והבטיחות של התערבות TCM לאוסטאופורוזיס. הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת הפכה לאחרונה לטכניקה פופולרית להערכת מורפולוגיה של העצם.הוא יכול לספק נתונים מדויקים ומקיפים על פרמטרים של מבנה וצפיפות עצם, כגון נפח עצם, עובי שבר והיפרדות. מערכת השלד היא מבנה הרקמה הייחודי ביותר מבחינת התכונות הפיזיות של הגוף. הוא מכיל את המרכיב האנאורגני ארגינין סידן פוספט, והוא קשה ונוקשה כתוצאה מכך.תהליך הפגיעה בתסמיני העצם הוא מייגע. סיפקנו תהליך שלם ומפורט ממודלים ועד אוסטאופורוזיס בהערכה לחוקרים. אנו מאמינים כי יישום הטכנולוגיה יביא ללא ספק שיפורים גדולים במחקר אוסטאופורוזיס בהקשר של חקר אתנו-רפואה.

trabecular-bone-microarchitecture-evaluation-an-osteoporosis-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור מודל שבר הקשורות אוסטאופורוזיס בחוליות עירום עכברוש יכול להיות הערכה longitudinally ויוו באמצעות semiautomated microcomputed מבוססי טומוגרפיה כמותיים וניתוח מבני.

Semiautomated האורך מבוסס-טומוגרפיה Microcomputed כמותיים ניתוח מבנה של מודל הקשורות אוסטיאופורוזיס שבר בחוליות עכברוש עירום

כתב יד זה מתאר מודל מאתר osteolysis calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo, המהווה מודל חיה אידיאלית להערכת הגומלין שבין חלקיקי ללבישה, תאים שונים התרופפות אספטי.

בנייה והערכה של מודל מאתר Osteolysis Calvarial על ידי חשיפה לחלקיקים CoCrMo ב התרופפות אספטי

נייר זה מורה משתמשים ויוו הסורקים טומוגרפיה שחושב מיקרו (µCT) כיצד עזים ומתנגד, כראוי למקם לרסן את האיבר האחוריות של עכבר לתנועה מינימלי במהלך דימות ברזולוציה של עצם השוקה. התוצאה היא תמונות באיכות גבוהה ניתן לעבד לכמת במדויק את עצם מיקרו-ארכיטקטורה.

מיקום מתאים ואיפוק של איבר הינד עכברוש עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה ממוקד של עצם באמצעות מיקרו-ארכיטקטורה In Vivo שחושב מיקרו טומוגרפיה

אנו מציגים זרימת עבודה עבור הממיין וכימות עצמות trabecular לתמונות מימד מבוסס על הגבול החיצוני של העצם באמצעות תוסף ImageJ. גישה זו הוא יותר יעיל, מדויק יותר הגישה הנוכחית יד-עיצוב ידני ומספק שכבה-על quantifications, אשר אינן זמינות תוכנה מסחרית הנוכחי.

החיצוני-גבולות בסיוע פילוח, כימות של עצמות Trabecular על ידי תוסף Imagej

הפרוטוקול הנוכחי יוצר שיטה קפדנית ומתוכנות לכמת של שינויים מורפולוגיים המלווים אוסטיאוארתריטיס. יישום פרוטוקול זה יכול להיות בעל ערך בניטור התקדמות המחלה והערכת התערבויות טיפוליות אוסטיאוארתריטיס.

מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי

פרוטוקול זה מתאר שיטה קנונית להבנת הגנים הקריטיים השולטים בפעילות אוסטאוקלסט ב- vivo. שיטה זו משתמשת במודל עכבר מהונדס וכמה טכניקות קנוניות כדי לנתח פנוטיפ השלד.

ניתוח פנוטיפ שלד של מודל עכבר מחיקה מותנית Stat3

פרוטוקול זה מתאר הליך כירורגי להקמת שבר דיאפיזיאלי בעצם הירך של עכברים, המיוצב באמצעות חוט תוך מדולרי, לצורך מחקרי ריפוי שברים.

ביסוס מודל שבר עצם הירך הדיאפיזי בעכברים

בפרוטוקול זה, מתוארות שתי גישות כדי להפוך את בדיקת הדחיסה החד-צירית של חוליות מותניות של עכברים ליותר ברת השגה. ראשית, מתוארת ההמרה של מכונת כיפוף תלת נקודות למכונת בדיקת דחיסה. שנית, שיטת הטבעה להכנת משטח העמסה המשתמשת בצמנט עצם מותאמת לחוליות מותניות של עכבר.

בדיקת דחיסה חד-צירית של חוליות מותניות של עכבר עם הטבעה של משטח הטעינה

הפרוטוקול מראה בניית מודל אימון פשוט וחסכוני לנשיאת משקל חולדה עבור אוסטאונקרוזיס המושרה על ידי סטרואידים של ראש הירך באמצעות סרט טיפולי אלסטי.

מודל נושא משקל ללא מתח של אוסטאונקרוזיס המושרה על ידי סטרואידים של ראש הירך בחולדות

אנו מציעים פרוטוקול להערכת התחדשות עצם ברמות היררכיות שונות. גישה רב-מודלית זו מאפשרת ניתוח מבני בקני מידה שונים לאורך זמן, תוך התמודדות יעילה עם אתגרים בהכנת הדגימה. הוא גם מספק תהליך עבודה אמין להערכת יעילות הביוחומרים בקידום התחדשות העצם.

גישה רב-מודלית להערכת התחדשות עצם וביצועי פיגומים

חקור הערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית במודל עכבר אוסטאופורוזיס באמצעות Micro-CT וצביעת HE. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי מדויק של מבנה העצם ותומכת במחקר יעילות טיפולי רפואה סינית מסורתית.

הערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית במודל עכבר אוסטאופורוזיס

גלה סרטונים נוספים