הזרקת זרע עגולה לעכבר

הזרקת זרע עגולה יכולה לפתור את בעיית הרבייה אצל חלק מחולי אזוספרמיה לא חסימתית, אך יעילותה נמוכה מאוד. המחקר שלנו השתמש בעכברים כמודלים לחיפוש שיטות לשיפור יעילות ההתפתחות העוברית של ROSI בעכבר. סטטיסטיקה חלקית מצביעה על כך שפחות מ-200 עוברים אנושיים שנולדו באמצעות ROSI נולדו ברחבי העולם.

נקודת מפנה בהבנת הפוטנציאל של טכנולוגיית ROSI התרחשה בשנת 2015, כאשר טנאקה ועמיתיו דיווחו על לידות מוצלחות של 14 עוברים באמצעות טכנולוגיית ROSI, והחדירו אמון מחודש ביישום הקליני שלה ובהיתכנות שלה. המוקד הנוכחי של מחקר ROSI הוא על חריגות בשינויים אפיגנטיים והפעלה חריגה בסיוע ביציות, בעוד זיהוי מדויק של נתוני זרע עגולים הוא גם אתגר. יעילות הפיתוח של עוברי ROSI בעכבר כבר גבוהה מאוד במעבדה שלנו, בדומה למעבדות אחרות.

עם זאת, יעילות הפיתוח של מכרסמים, כמו בני אדם, היא עדיין חדשה מאוד. בעתיד נתמקד בשיפור יעילות הפיתוח של מי שאינם מכרסמים. כדי להתחיל, יש להזריק לעכברה בת שישה עד שמונה שבועות תוך צפקית 7.5 יחידות בינלאומיות כל אחת של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון בשעה 17:00 וגונדוטרופין כוריוני אנושי 48 שעות מאוחר יותר.

יש לוודא שלא נוצר מגע עם עכברים זכרים לאחר ההזרקה. לאחר המתת העכבר, לפתוח את חלל הבטן שלה. בעזרת מספריים, חותכים את החצוצרות ליד שתי השחלות ומניחים אותן בחיץ M2 שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס.

תחת המטרה פי 10 של מיקרוסקופ זקוף, אתר את החלק השקוף והמוגדל של החצוצרה. לאחר מכן, באמצעות מזרק של מיליליטר אחד, לאבטח את החצוצרה, לחתוך את החלק המוגדל, ולאסוף את מתחמי קומולוס העטרה הביצית. כדי להסיר תאי גרנולוסה, הניחו את קומפלקס הביציות בתמיסת הפעלה M2 שחוממה מראש המכילה 0.1% היאלורונידאז, ונשפו בעדינות דרך פיפטה אוראלית.

מעבירים את הביצית באופן סדרתי לטיפות KSOMaa לשטיפה שלוש פעמים, ומניחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. כדי להתחיל, השג עכבר C57BL/6 זכר בן שמונה עד 10 שבועות. פתח את חלל הבטן שלה בעדינות הבלו את epididymis ליד האשכים עם מספריים.

מניחים את התבשיל המכיל אפידידימיס בתווך M2 תחת מטרה של פי 10 של מיקרוסקופ זקוף. ובאמצעות מזרק של מיליליטר אחד, בעדינות הבלו את האפידידימיס כדי לתת לזרעונים לזרום החוצה. סיפון הזרעונים הזורמים בתרחיף לתחתית צינור המכיל 0.5 מיליליטר של חיץ M2.

לבידוד זרע עגול, העבירו את האשך המנותח למאגר M2. באמצעות מזרק של מיליליטר, חותכים בעדינות את הקרום הלבן מתחת למיקרוסקופ, ולאחר מכן סוחטים ומוציאים החוצה את צינוריות הזרע המפותלות. לאחר חילוץ המתלים, מסננים עם מסננת 400 רשת וצנטריפוגה את התאים המסוננים.

השליכו את הסופרנאטנט ודגרו על התאים עם 200 מיקרוליטר של Hoechst 33342 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מניחים את צינור הציטומטריה המכיל תאים מוכתמים בציטומטר הזרימה. לאחר התאמת המתח, בחר את אוכלוסיית התא בהתבסס על פיזור קדימה וצדדית.

לאחר מכן, הסר את הידבקויות התא בהתאם לפיזור קדימה והדק את רוחב הדופק. באמצעות שני ערוצי גילוי תחת לייזר באורך גל של 355 ננומטר, מיין את הזרעונים העגולים ואחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס. תחת המיקרוסקופ, תאי זרע עגולים של עכברים היו בקוטר של כ-10 מיקרומטר והציגו מבנה גרעין דמוי בליטה באמצע.

כדי להתחיל, להשיג ביציות וזרעונים עגולים מעכברים. לאחר מכן, הכינו את מחטי ההחזקה וההזרקה בקטרים מתאימים. הכניסו את הביציות לטיפות M2 של 10 מיקרוליטר עם או בלי ציטוכלסין B לריכוך ואחסון הגמטות.

לאחר מכן, הניחו את טיפות M2 העגולות של הזרעונים והרכיבו את צלחת הניתוח על שולחן הניתוחים המיקרוסקופי. התאם את מיקום ההזרקה וקבע את המחט. באמצעות polyvinylpyrrolidone, או PVP, להרטיב ולנקות את מחט ההזרקה.

לאחר מכן, לחלץ את זרע עגול לתוך מחט ההזרקה. סובבו את הביצית עם מחט האחיזה כדי לכוון את הגוף הקוטבי של הביציות במיקום השעה 12. לאחר מכן, הניחו את מחט ההזרקה בזהירות במיקום השעה שלוש על הביצית.

באמצעות מכשיר PiezoXpert, ליצור חור ביציות 'zona pellucida. לאחר מכן, מקדמים בעדינות את מחט ההזרקה לתוך הביצית בצורה אופקית וקרעו את קרום הביצית. מזריקים בהדרגה את הזרע העגול לתוך הציטופלסמה של הביצית.

משכו את מחט ההזרקה ושאפו כמות קטנה מקרום הביציות ליד הפתח כדי לאטום אותה. להזרקת זרע תוך ציטופלזמית, הניחו את הזרעונים על מסלול PVP. שאפו את הזרעונים מהזנב ומקמו את צווארו בפה של מחט ההזרקה.

החל piezo כדי להפריד את ראש הזרע מן הזנב. לאחר מכן, הזריקו את הזרע לתוך הביצית כפי שהודגם קודם לכן, עם מחט הזרקה בקוטר של תשעה עד 10 מיקרומטר. להפעלת ביציות בסיוע, הניחו את הביציות בתוך 20 טיפות מיקרוליטר של סידן ומדיום CZB נטול מגנזיום המכיל סטרונציום כלוריד הקסהידראט.

לאחר מכן, העבירו אותם למדיום התרבות של KSOMaa לטיפוח. במקביל, להקים קבוצה להפעלת parthenogenesis ללא הזרקת זרעונים עגולים או זרעונים עבור מחקרים אמבריולוגיים. לאחר ההפעלה, העבר למדיום התרבות KSOMaa לטיפוח.

עוברים עגולים בהזרקת זרע הציגו יעילות התפתחותית נמוכה יותר בהשוואה לעוברים בהזרקת זרע תוך ציטופלזמית.