Name: אינטראקציה בין בקטריופאג T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג מארח ב-Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: חקור את האינטראקציה בין בקטריופאג' T4 לבקטריה Escherichia coli במעי עכברים גנוטוביוטיים. שיטה זו מאפשרת הבנה של דינמיקת פאג'-מארח ותפקידם במערכת החיסון ובמחלות מעיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים בכך שהאדמה שעליה ביצעו את המחקר הזה היא הטריטוריה המסורתית, הקדומה והבלתי מוגבלת של אומת המוסקאם (xwməθkwəy̓əm). הארץ עליה היא ממוקמת תמיד הייתה מקום למידה עבור אנשי מוסקאם, שבמשך אלפי שנים העבירו הלאה את תרבותם, ההיסטוריה והמסורות שלהם מדור לדור באתר זה. אנו מעודדים אחרים ללמוד עוד על אדמות הילידים שבהן הם חיים ועובדים https://native-land.ca. המחברים מודים על תמיכת המועצה למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) מלגות לתואר שני - תואר שני (N.P.), פרס מייקל סמית 'מחקר בריאות BC Trainee Award (RT-2023-3174, ל- MH), מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) תוכנית מענקי גילוי (RGPIN-2019-04591 ל- C.T., RGPIN-2016-04282 ל- LCO), המכון הקנדי למחקר מתקדם / בני אדם והמיקרוביום (FL-001253 Appt 3362, ל-C.T.), פרס Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, ל-C.T.), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (PJT-159458 ל-LCO) והקרן הקנדית לחדשנות (34673 ל-LCO ו-38277 ל-CT). אנו אסירי תודה על התמיכה הטכנית ממרכז UBC למידול מחלות ו-ubcFLOW, הנתמך על ידי יוזמת החוסן הביולוגי UBC GREx, ולחברי מעבדות אוסבורן וטרופיני על דיונים קריטיים והערכה של כתב היד. איור 1A ואיור 2A נוצרו באמצעות Biorender.com.

חקר דינמיקה של חיידקי פאג'-מעיים במודלים של מורין באמצעות פאגים מסוג T4

למחברים אין מה לחשוף.

בקטריופאג'ים, או פאגים, הם וירוסים שמדביקים והורגים חיידקים עם מינים וספציפיות ברמת הזן1. פאגים ממלאים תפקידים חשובים בקהילות חיידקים מורכבות כמו מיקרוביוטת המעיים, שם הם היו מעורבים בוויסות דינמיקת האוכלוסייה ובהנעת כושר חיידקי2. במהלך העשור האחרון, התעורר עניין מחודש במחקר פאגים עקב עלייתם של פתוגנים עמידים אנטי-מיקרוביאליים3, והפוטנציאל לטיפול בפאגים כאסטרטגיית טיפול אלטרנטיבית. בשנים האחרונות נעשה שימוש בקוקטיילים של פאגים ליטיים דרך הווריד בהצלחה מסוימת בזיהומים ספטיים חיידקיים חמורים ועמידים לאנטיביוטיקה בבני אדם 3,4. טיפול בפאגים דרך הפה הוצע גם כחלופה פוטנציאלית לאנטיביוטיקה לטיפול בדלקות מעיים ודלקות. יתר על כן, פאגים היו מעורבים בהצלחה של השתלות תסנין צואה (FFT), שהם תכשירי מיקרוביוטה צואתיים שסוננו לסילוק חיידקים, בטיפול בזיהום חוזר של Clostridioides difficile (rCDI)5,6, הפרעות מעי דלקתיות (IBD)7,8 ודלקת מעיים נמקית בפגים9. בהתחשב בתוצאות אלה, חשוב לקחת בחשבון אינטראקציות הן בין פאגים ומיקרוביוטת המעיים, והן בין פאגים לבין פונדקאי היונקים, שכן להוספת פאגים חדשים לקהילה קיימת עשויות להיות השפעות עקיפות על הקהילה כולה, ולא רק על חיידקי המטרה שלה 2,10.
המחקר של אינטראקציות פאגים עם חיידקי המטרה שלהם במבחנה הוכח כיעיל להבנת המנגנונים וההשפעות של אינטראקציות פאגים וחיידקים במעיים. במסגרת זו, הוכח כי פאגים T4 ספציפיים ל- Escherichia coli מסדר Caudovirales דורשים תחומים דמויי אימונוגלובולין (Ig) הממוקמים בתוך חלבוני קפסיד חיצוני אנטיגני מאוד (Hoc) על פני השטח של הנגיפים כדי להיצמד לליחה במעי11. בנוסף, מבחני טרנסוול הראו כי פאגים מסוג T4 מסוגלים לקיים אינטראקציה עם תרביות תאי אפיתל ולבצע טרנסלוקציה דרך שכבות התא על ידי מקרופינוציטוזה12,13. תוצאות אלה תומכות בהשערה שפאגים יכולים לתקשר עם הפונדקאי המטזואני שלהם, אף על פי שהם אינם מסוגלים להדביק תאים איקריוטים. מודלים אלה, למרות שהם שימושיים, חסרים את כל טווח האינטראקציות המורכבות המתרחשות במערכת האקולוגית של המעיים הדרושות לחקירה מקיפה של האינטראקציה המשולשת בין פאגים, חיידקים והפונדקאי המטזואני.
מודלים של עכברים הם כלי חשוב לחקר פאגים בסביבות מורכבות. יישום רצוי של מתן פאגים הוא כאסטרטגיה חלופית לטיפול בזיהומים עמידים מיקרוביאליים או פתוביונטים הקשורים למחלות דלקתיות כרוניות, כולל IBD. עם זאת, ספרות חדשה מציעה כי התנהגות פאגים במבחנה אינה מייצגת באופן מלא פונקציות in vivo. Buttimer et al.14 הראו כי קוקטייל פאגים היה מסוגל לרוקן את חיידקי המטרה בקונסורציום מיקרוביוטה אנושית פשוטה במבחנה, אך לא ניתן היה לשכפל אותו in vivo בעכברים גנוטוביוטיים שהתיישבו באותו קונסורציום חיידקים-פאגים. יתר על כן, במיקרוביום עכבר קונבנציונלי, פאג T7 הוביל לדלדול סלקטיבי של חיידקי המעיים שלו, אם כי נצפתה התאוששות הדרגתית לאורך זמן, המעידה על עמידות מפותחת15. מחקרים אחרים הוכיחו דו-קיום של פאגים הניתנים דרך הפה וזני חיידקי המטרה שלהם in vivo 2,16. ואכן, מעבר לדו-קיום של פאגים/חיידקים, מתן פאגים הוביל לשינויים נרחבים בהרכב ובתפקוד הכולל של קהילת המיקרוביוטה 2,16. זה רלוונטי במצבי מחלה, שכן מספר מחקרים מצאו קשרים בין שפע יחסי מוגבר של Caudovirales ו- IBD 7,8,17 שהיו בלתי תלויים בשינויים בשפע חיידקים7. עדיין לא ידוע אם זהו מניע או תוצאה של פתוגנזה של המחלה.
המוקד ההיסטורי של חקר הפאגים היה סביב הקשר בין פאג לבין חיידק המטרה שלו. עם זאת, חשוב גם לקחת בחשבון אינטראקציות אפשריות בין פאגים לבין הרירית, האפיתל ומערכת החיסון של הפונדקאי המטזואני. כל האינטראקציות האלה ממלאות תפקיד חשוב בתגובה הכוללת לזיהום פאגים במעי. כדי להדגים זאת, פאגים נחקרו באמצעות עכברים נטולי חיידקים (GF) כדי להבהיר את השפעתם על מערכת החיסון ללא הפרעה של המיקרוביוטה8. במערכת זו, חומצות גרעין פאגים זוהו על ידי קולטנים דמויי טול (TLR) הממוקמים בתוך אנדוזומים של תאי חיסון פגוציטיים (מקרופאגים ותאים דנדריטיים). זה הפעיל איתות במורד הזרם ועורר ייצור תלוי תאי T של אינטרפרון (IFN)-γ8 או סוג I IFNs18. יתר על כן, Fluckiger et al.19 עירבו תאי זיכרון CD8+ T בזיהוי אנטיגנים מקודדי פאגים (פרופאג'ים), מה שהביא לתגובתיות צולבת של תאי T עם אנטיגנים סרטניים, וכתוצאה מכך נטל הגידול מופחת. לבסוף, ייצור נוגדנים ספציפיים לפאגים תועד במחקרי עכברים שבהם פאגים הועברו למודלים של בעלי חיים באופן מתמשך באמצעות מי שתייה 8,20, או על ידי גאגים פומיים חוזרים ונשנים במשך מספר חודשים20, מה שמדגים את יכולתם של חלבוני פאגים לקדם תגובות חיסוניות הומורליות. אף על פי ששיטות אלה של חיסון פאגים מאפשרות הכנה אופטימלית ומתמשכת של מערכת החיסון, ייתכן שהן אינן מייצגות את האינטראקציות הטבעיות בין פאגים לסביבת המעי, וגם לא את הקינטיקה של טיפול בפאגים המיושמים דרך הפה. עד כה, מספר מצומצם של מחקרים בחנו את יחסי הגומלין של פאגים עם מין חיידק יחיד במודלים של עכברים חד-מושבתיים21. עם זאת, עכברים חד-מושבתיים הוכיחו את עצמם כקריטיים בפענוח השפעות ספציפיות של חיידקים של מינים בודדים על מערכת העיכול (GI) ועל התפתחות מערכת החיסון 22,23,24, והם עדיין עשויים להיות שימושיים בהבנת אינטראקציות משולשות בין פאגים, חיידקי המטרה שלהם והפונדקאי המטזואני.
באופן מלהיב, יש עדיין הרבה מה ללמוד על יחסי הגומלין בין פאגים במעיים לבין חיידקי מעיים, כמו גם על יחסי הגומלין המתרחשים בין המאכסן המטזואני לבין הפאגים השוכנים בתוכו. פרוטוקול זה מספק סדרה של הליכים לחקר פאג T4 מבודד ומקבילו החיידקי, E. coli (K-12, BW25113), באמצעות מודל עכבר גנוטוביוטי. נהלים סטנדרטיים אלה מספקים גם בסיס לאופטימיזציה של דיאדות פאגים/חיידקים אחרות על ידי התאמת פרמטרי הגידול לזוגות המעניינים. השיטות המתוארות כאן מתארות: (1) הכנת פאגים מסוג T4 וליזאטים של כלי רכב לגידול אוראלי של עכברים; (2) מתן פומי של פאג T4 לעכברים גנוטוביוטיים חד-מושבתיים מסוג E. coli ; (3) ניטור רמות הפאגים מסוג T4 בצואת עכברים וברקמות לאורך זמן.
עבור התוצאות המייצגות שהוצגו כאן, ליזטים מטוהרים של פאגים מסוג T4 הופצו ממניות בנק פאגים שהוחזקו על ידי מעבדת רוהוור. שיטת פאג-און-ברז להפצת פאג T4 הותאמה25, כפי שמוזכר בפרוטוקול זה. השיטה מניבה מלאי פאגים גבוה ואנדוטוקסין נמוך תוך שלושה ימים. באמצעות גישה זו, 10 מ"ל של ≥ 1010 יחידות יוצרות פלאק (pfu)/מ"ל של פאג T4 עם < 0.5 יחידות אנדוטוקסין (EU)/מ"ל נאספו באופן שגרתי. רמות האנדוטוקסין המומלצות למתן פומי או תוך ורידי בעכברים הן ≤ 20 EU/מ"ל ו-≤ 5 EU/kg/h (או 0.1 EU מנוהל מעל שעה אחת עבור עכבר במשקל 20 גרם), בהתאמה, מה שהופך זאת לשיטה מתאימה להכנת פאגים לחיסון in vivo . כל מלאי הפאגים אוחסן בטמפרטורה של 4°C במאגר פאגים של מגנזיום מלוחים (SM) (מתכון סופק בשלב 1.1.5.1). E. coli טופח במדיה LB. עבור זוגות שונים של חיידקי פאג'ים, ניתן להתאים מצעי תרבית ותנאי גדילה מגוונים מפרוטוקול זה. פאגים יכולים גם להיות מופקים מהסביבה, כגון שפכים, מים ימיים, קרקע ותכולת מעיים, וניתן לבודד ולטהר אותם לפי סמברוק וראסל26 לפני ההכנה תוך שימוש בתנאי הגידול והריבוי המתאימים לכל זוג פאגים-פונדקאים25 . לחלופין, ניתן לקבל פאגים ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) או מבנקי פאגים.

<table><tbody><tr><td>1-אוקטנול (99%)</td><td>Thermofisher</td><td>CAAAA15977-AP</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל PES Steriflip יחידות מסנן ואקום חד פעמיות סטריליות</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>SCGP00525</tr><tr><td>אגרוז (דרגת EEO נמוכה/רב-תכליתית/ביולוגיה מולקולרית)</td><td>פישר ביו-ריאגנטים&nbsp;</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&reg; מכשיר מסנן צנטריפוגלי 100kDa Ultra-15, Ultracel-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer&reg; צינורות, SST</td><td>BD Medical</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>כלובים אטומים להדרה ביולוגית (כלובי ISO)&nbsp;</td><td>טצ'יפלסט</td><td>1245ISOCAGE</td><td></td></tr><tr><td>C1000 מגע וסחר; Thermal Cycler עם מודול תגובה מהירה 96 בארות</td><td>BioRad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט (גבישים לבנים לאבקה)</td> <td>Fisher BioReagents</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>מנעולי כובע לצינור 1.5 מ"ל 100/pk</td><td>Andwin Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>16812612</tr><tr><td>כלורופורם (אתנול כחומר משמר/ACS מאושר)</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פלדה מצופים נחושת (4.5 מ"מ)</td><td>Crosman Corporation</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & ערכת טישו (50)</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq ירוק PCR מאסטר מיקס (2X)</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח דיסודיום חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), לביולוגיה מולקולרית, 0.5 מ' ב-H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>פישר ביו-ריאגנטים וסחר; אגר, אבקה / פתיתים, פישר ביו-ריאגנטים וסחר; &nbsp;</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>פישר ביו-ריאגנטים וסחר; מיקרוביולוגיה מדיה: LB Broth (אבקה) - Lennox&nbsp;</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp סולם DNA</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>ירוק FastMix&reg; תערובת qPCR, 1250 rxns</td><td>QuantaBio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>מסנני HEPA למכסי איזוקאז', מסנני H14 הניתנים לחיטוי עבור קו ISO</td><td>- מוקרן Techiplast</td><td>UISOHEPAXTBOX-300</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט heptahydrate</td><td>פישר BioReagents</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 6000 שייקר מודגר</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>8354-30-0009</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוביולוגיה מדיה: מרק LB (אבקה) - לנוקס</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה עם מכסה הצמד נעילה, 2 מ"ל</td><td>פישר</td><td>14-666-315</td><td></td></tr><tr><td>סרט איטום פרפילם</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>מלאי פאג'ים</td><td>Carolina Biological Supply&nbsp;</td><td>לא ישים PicoLab</td><td></td></tr><tr><td>&reg; דיאטת עכבר 20 EXT</td><td>LabDiet</td><td>5R58</td><td></td></tr><tr><td>פירס וסחר; ערכת אנדוטוקסין כרומוגנית Thermo</td><td>Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A39552S</tr><tr><td>RNase A (17,500 U)</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>סט DNase נטול RNase</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (אבקה לבנה עדינה)</td><td>פישר כימיקל</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (גבישי/מוסמך ACS)</td><td>פישר כימיקל</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור (דגם בדיקה CL-18; מקור כוח דגם FB50)</td><td>פישר ריחני&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מבודד סרט גמיש סטרילי&nbsp;</td><td>מחלקה נקייה ביולוגית&nbsp;</td><td>לא SYBR&TRADE</td><td></td></tr><tr><td>; כתם ג'ל DNA בטוח</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 מחזור תרמי&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>פריימר פאג'ים T4, קדימה (CCACACATAGCGCGAGTATAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>פריימר פאג'ים T4, קדימה (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>קיאגן&nbsp;</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, תמיסה 1M, pH 8.0, דרגת ביולוגיה מולקולרית, Ultrapure</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAJ22638AE מים, (ללא DNASE, RNASE)</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP2484100</td><td></td></tr></tbody></table>

אינטראקציה בין בקטריופאג' t4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-vivo

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

בקטריופאג'ים (פאג'ים) הם וירוסים שמדביקים חיידקים ברמת המינים והזנים, והם הישויות הביולוגיות הנפוצות ביותר בכל המערכות האקולוגיות הידועות. בתוך קהילות חיידקים, כמו אלה שנמצאות במיקרוביוטה של המעיים, פאגים מעורבים בוויסות הדינמיקה של אוכלוסיית המיקרוביוטה ובהנעת אבולוציה חיידקית. בעשור האחרון התעורר עניין מחודש במחקר פאגים, בין השאר הודות ליכולות ההרג הספציפיות לפונדקאי של פאגים ליטיים, המציעים כלי מבטיח נגד האיום הגובר של חיידקים עמידים מיקרוביאלית. יתר על כן, מחקרים אחרונים המוכיחים כי פאגים נצמדים לליחה במעי מצביעים על כך שייתכן שיש להם תפקיד מגן במניעת פלישת חיידקים לאפיתל הבסיסי. חשוב לציין, שבדומה למיקרוביום חיידקי, פגיאומים משובשים נקשרו להחמרה בתוצאות במחלות כמו מחלות מעי דלקתיות. מחקרים קודמים הראו כי פאגים יכולים לווסת את המיקרוביום של בעלי חיים ובני אדם באמצעות השתלות תסנין צואה, מה שיועיל לבריאות הפונדקאי. עם גל המחקר האחרון מגיע הצורך לבסס ולתקנן פרוטוקולים לחקר פאגים בהקשר של מיקרוביום המעי. פרוטוקול זה מספק סדרה של נהלים לחקר פאגים מבודדים מסוג T4 והפונדקאי החיידקי שלהם, Escherichia coli, בהקשר של מערכת העיכול של מורין. השיטות המתוארות כאן מתארות כיצד להתחיל מליזט פאגים, לתת אותו לעכברים ולהעריך את ההשפעות על רמות החיידקים המארח והפאגים. פרוטוקול זה יכול להשתנות ולהיות מיושם על זוגות פאג'ים-חיידקים אחרים, והוא מספק נקודת מוצא לחקר הדינמיקה של פונדקאי-פאג'ים in vivo.

כדי לחקור את יחסי הגומלין בין פאג T4/E. coli dyad במעי המורין, פאג T4 וליזטים של כלי רכב הוכנו, נוקו וטוהרו (איור 1A). ליזטים של פאגים T4 כוסו על ידי בדיקת פלאק ונמהלו ל-2 x 10,7 pfu/mL (2 x 10,6 pfu/mouse) במאגר SM. גם ליזטים של כלי רכב עברו טיטור כדי לוודא שאין נוכחות פאגים בת קיימא ונמהלו באותו נפח של חיץ SM כמו הפאג ליזט T4. רמות האנדוטוקסין כומתו בליזטים מדוללים באמצעות ערכת כימות אנדוטוקסין כרומוגנית. בפאג T4, בפאג מומת בחום ובליזטים של כלי רכב היו רמות אנדוטוקסין נמוכות מהרמות המקובלות למי שתייה (&lt;20 EU/mL)25 (איור 1B). מכיוון שליזט הרכב הכיל כמות דומה של אנדוטוקסין כמו הפאג ליזט T4, הוא נחשב לאמצעי בקרה מתאים. הפאג' ליזט המומת בחום (2 x 10,7 pfu/mL לפני הטיפול בחום) הכיל פחות אנדוטוקסין מאשר ברכב ובפאג ליזט T4. בהתאם להוראות הערכה, דגימות שטופלו באוקטאנול 1 נבדקו לעיכוב בדיקה על ידי הוספת תקן אנדוטוקסין לליזט הרכב (רכב ספייק), כדי לתת ריכוז סופי של 0.5 EU/mL. רמות האנדוטוקסין הגבוהות ברכב פחות רמות האנדוטוקסין ברכב נמדדו ב-0.5 EU/מ"ל ±25%, בהתאם להמלצות היצרן (איור 1B). זה הוכיח כי 1-אוקטאנול הוסר בהצלחה וכי לא היה עיכוב הבדיקה שנגרם על ידי lysates שיכול להפריע לתוצאות של הבדיקה.
אי קולי עכברי K-12 (BW25113) מונוקולוניזציה C57BL/6 גודלו בתוך איזולטור ויניל סטרילי גמיש בתנאים גנוטוביוטיים (איור 2A). עכברים מדור F0 יושבו עם E. coli באמצעות הוספתו לסביבה ולדיור המשותף שלהם. רק הצאצאים (דור F1 ו-F2) שהתיישבו באי-קולי מלידה באמצעות שידור אנכי ודיור משותף שימשו לניסויים. אסטרטגיה זו שלטה בשינויים במערכת החיסון, בייצור הריר ובהתפתחות מערכת העיכול המתרחשת בתגובה לחיסון חיידקי22,37, ולכן אפשרה למדוד שינויים המתרחשים רק בגלל החדרת פאגים. לאחר שהתבגרו, עכברי ניסוי הועברו לאיזוקאז'ים סטריליים, שם כל אחד מהם קיבל 2 x 106 pfu של פאג T4 או נפח שווה של ליזט רכב על ידי gavage אוראלי בגיל 6-8 שבועות. שפע הפאגים T4 וה-E. coli נוטר במשך ארבעה שבועות על ידי איסוף כדורי צואה ומבחני ציפוי נקודתי על אגר 0.5% (רך) או 1.5% אגר, בהתאמה. במהלך הניסוי הזה, פאגים מסוג T4 ואי קולי הצליחו להתקיים יחד מבלי שאף אחת מהאוכלוסיות תתרוקן (איור 2B, C). מתן פומי של פאג T4 במינונים נמוכים יותר של 2 x 102 ו-2 x 104 pfu/עכבר לא הפחית את היכולת של פאג T4 ליישב את המעי בהשוואה ל-2 x 106 pfu (איור 2D). באופן דומה, לא נצפתה השפעה תלוית מינון של חיסון T4 על רמות E. coli (איור 2E).
חשוב לציין כי עקביות בציפוי בין הדגימות נמצאה כחיונית לספירת הפלאק. לדוגמה, כאשר הוסיפו חיידקים לאגר הרך, נקבע כי צפיפות החיידקים השפיעה מאוד על תוצאת הבדיקה. תוספת של E. coli שהיה בתת-תרבית במשך שעה, 1.5 שעות או שעתיים, הביאה לספירת פלאק נמוכה יותר מאשר עם תוספת של E. coli בתת-תרבית במשך 2.8 שעות או יותר. יתר על כן, כימות הפלאק התייצב על ~1 x 109 pfu/mL כאשר E. coli היה בתת-תרבית במשך 2.8 שעות עד 16 שעות (לילה), שהיה גידול של בערך פי 5 בהשוואה לערך שחושב מתת-תרבית של שעה אחת (~2 x 108 pfu/ml) (איור 3A). במקום תת-תרבית, ניתן לחסן חיידקי מטרה לאגר רך מתרביות לילה. כאן, הנפח של תרבית E. coli בת 16 שעות (לילה) שחוסנה לתוך האגר הרך השפיע על ספירת הפלאק (איור 3B). תוצאות אלה מצביעות על כך שצפיפות E. coli בתוך האגר יכולה להשפיע על ספירת בדיקת פלאק. בשתי הגישות, תוצאות כימות הפאגים הגיעו לאותו ערך (109 pfu/ml), מה שמרמז על כך שחיידקי המטרה חייבים להיות בעלי צפיפות גבוהה מספיק באגר הרך כדי להבטיח דיוק בספירת הפלאק.
יחד, תוצאות אלה מדגישות את החשיבות של פיתוח הבנה של קינטיקה של חיידקי פאגים באמצעות ניסויי פיילוט in vitro ו-in vivo לפני ביצוע מניפולציות ניסיוניות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig01v2.jpg"> איור 1: הכנת ליזטים של פאגים. (A) תהליך עבודה להתחלת ליזט פאגים ממלאי פאגים עם טיטר גבוה. ליזטים הופצו, נוקו, התרכזו ואנדוטוקסינים הוסרו. זיהום 1-אוקטאנול הוסר על ידי ואקום מהיר. (B) אנדוטוקסינים כומתו בפאגים ובליזטים של כלי רכב באמצעות ערכת כימות אנדוטוקסין כרומוגנית. קווים כחולים מקווקווים מציינים את הגבולות העליונים והתחתונים כדי להפריך עיכוב מוצר בבקרת עיכוב המוצר (0.5 EU/mL ± 25%). כל נקודה מייצגת אחד משני העתקים טכניים. גובה העמודות מייצג את הממוצע בין עותקים משוכפלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig01largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig02v2.jpg"> איור 2: יצירת עכברים חד-מושבתיים וניטור רמות הפאגים והחיידקים בכדוריות צואה. (A) תהליך עבודה ליישוב עכברים נטולי חיידקים עם זן חיידקים יחיד ודור של עכברים חד-מושבתיים מסוג F1 ו-F2. (ב-ה) רמות של פאג T4 ואי קולי התגלו בכדוריות צואה של עכברי C57BL/6 שנולדו חד-מושבתיים עם E. coli וחוסנו בפאג T4 בגיל 6-8 שבועות. ביום 0 (טרום קולוניזציה) ובימים שצוינו לאחר הקולוניזציה, רמות הפאגים T4 נמדדו על ידי ציפוי נקודתי ומבחני פלאק בשיטת שכבת אגר יחידה. רמות E. coli נמדדו על ידי ציפוי נקודתי על 1.5% LB אגר. (ב, ג) קינטיקה של (B) רמות פאג T4 ו- (C) E. coli בכדוריות צואה שהחלימו לאחר חיסון עם 2 x 106 pfu של פאג T4 או ליזט רכב (מנורמל עבור רמות נפח ואנדוטוקסין). (ד, ה) (D) רמות T4 פאג' ו-(E) E. coli בכדוריות צואה שהחלימו לאחר חיסון עם 2 x 102 pfu, 2 x 104 pfu או 2 x 106 pfu של פאג T4. קווי שגיאה מייצגים ממוצע ושגיאת תקן של הממוצע (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig02largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig03v2.jpg"> איור 3: דיוק בפתרון בעיות במבחני פלאק. (A) טיטר ליזט פאג' T4 המשתמש בתרביות לילה או תת-תרביות של E. coli להכנת אגר רך (0.5% אגר, LB). תת-תרביות נעשו באמצעות דילול 1:50 של תרבית E. coli בן לילה לתוך LB טרי. 5 מ"ל של תכשירי אגר רך חוסנו עם 100 μL של E. coli ו 20 μL של T4 פאג. CaCl2 ו- MgSO4 לא נוספו לאגר רך עבור בדיקות אלה, אך ניתן להוסיף אותם במידת הצורך. תת-תרבית E. coli פעמים מתחת ל-2.8 שעות גרמו לירידה בכמות הפאגים הנראית לעין. (B) טיטר T4 פאג ליזט באמצעות צפיפויות E. coli שונות בהכנת אגר רך. הוספת נפחים שונים של E. coli מתרבית לילה (לא תת-תרבית, כמו ב-A) לתוך האגר הרך הביאה לרמות שונות של פאגים לכאורה. קווי שגיאה מייצגים אי-ודאות מחושבת של טיטר פאגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig03largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

בקטריופאג'ים (פאגים), נגיפים שמדביקים חיידקים, הם מרכיב אינטגרלי של מיקרוביום המעי. אף על פי שהתושבים הסימביוטיים האלה מניעים את הכושר החיידקי ואת דינמיקת האוכלוסייה, מעט מאוד מובן על האופן שבו הם משפיעים על הומאוסטזיס מעיים ומחלות. פרוטוקול זה חוקר פאגים T4 מבודדים בתוך מודל עכברי, הניתן להתאמה לזוגות פאגים-חיידקים אחרים.

אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

מטרת המחקר שלנו היא להבין את יחסי הגומלין המשולשים בין חיידקי בקטריופאג'ים לבין מערכת החיסון של יונקים בהקשר של מעי המעיים, מעי עכבר גנוטוביוטי. אנו מקווים לקבל תובנות לגבי אינטראקציות אלה בתנאי בריאות ומחלות כדי להבין טוב יותר את חשיבותו של מיקרוביום המעי. התפתחויות אחרונות מצאו כי בקטריופאג'ים יכולים להיות מזוהים על ידי מערכת החיסון של יונקים.הוצע כי פגאומת המעי האנושית עשויה להיות בלתי מווסתת במצבי מחלה כגון הפרעות מעי דלקתיות, וגירוי חיסוני על ידי פאגים עלול להחמיר פנוטיפים של מחלות. מטרתנו היא לספק לאחרים פרוטוקול סטנדרטי לייצור פאג ליזט T4 לצורך חיסון וספירה במודלים של עכברים גנוטוביוטיים. פרוטוקולים אלה יכולים להיבנות ולהשתנות לשימוש עם זוגות חיידקי בקטריופאג'ים אחרים.

t4-bacteriophage-e-coli-interaction-murine-intestine-prototypical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מתאר את התהליך להכנת גרסה מתויגת-fluorescently של bacteriophage מבדה, זיהום...

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024).This video demonstrates the in vivo interaction between T4 bacteriophage and E. coli in the murine intestine, and the fecal spot plating method to quantify their coexistence by measuring bacterial colonies and phage plaques.

Assessing the Coexistence of T4 Bacteriophage and E. coli in Murine Fecal Samples

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לשימוש בהגדרות תפוקה גבוהה כדי לסנן את היעילות האנטיבקטריאלית של קוקטיילים בקטריופאז '.

יעילות בקטריופאז' עבור שלטונוקל ביולוגי של פתוגנים המועברים במזון מוערכת באמצעות הגדרות תפוקה גבוהה

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

השתלת מח עצם Murine היא טכניקה בשימוש נרחב ללמוד מנגנונים אימונולוגיים המסדירים את מחלת שתל נגד מארח בבני אדם. היכולת לעקוב אחר דפוסי סחר בתא...

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

חברים של סוג Burkholderia הם פתוגנים חשיבות קלינית. אנו מתארים שיטה לסך מיצוי חלבון חיידקים, תוך שימוש בהפרעה מכאנית, וג'ל אלקטרופורזה 2-D לניתוח proteomic שלאחר מכן.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

כאן, הליך מתואר להקמת זיהום מערכתי בחולדה היילודים עם תרבויות של Escherichia coli K1. הליך בלתי פולשני זה מאפשר קולוניזציה של מערכת העיכול, טרנסלוקציה של הפתוגן למחזור המערכתי, ופלישה של מערכת העצבים המרכזית במקלעת דמית העין.

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic Coli Escherichia זיהום בעכברוש הילודים

המחקר הנוכחי מתאר את הפיתוח והיישומים של מערכת בדיקה מהונדסת גנטית המבוססת על טרנספקציה של תאי לוקמיה בזופילית של חולדות עם הגן FcεRIα של הסוסים. תאים שעברו טרנספטציה מבטאים קולטן פונקציונלי שבו ניתן להפעיל את שחרור המתווכים של התגובה האלרגית על ידי IgE ואנטיגן.

פיתוח במבחנה מערכת מודל לחקר האינטראקציה של Equus Caballus IgE עם קולטן גבוה הזיקה שלה FcεRI

חקור את האינטראקציה בין בקטריופאג' T4 לבקטריה Escherichia coli במעי עכברים גנוטוביוטיים. שיטה זו מאפשרת הבנה של דינמיקת פאג'-מארח ותפקידם במערכת החיסון ובמחלות מעיים.

אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo

גלה סרטונים נוספים