Name: הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: חקור שיטה לזיהוי מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית של RPA2 בתאי RPE1. גלה כיצד שיטה זו משפרת את יחס האות לרעש ללא ריאקטיביות צולבת של נוגדנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למישל פגאנו על תמיכתו ותובנותיו המועילות, לאשלי צ'וי ושרון קייסארי על קריאה ביקורתית של כתב היד, ולג'פרי אסטרדה ווילמה דיאז על תמיכתם המתמשכת. עבודה זו נתמכה על ידי תוספת גיוון למענק המכונים הלאומיים לבריאות GM136250.

1. תחזוקה של תאי אפיתל פיגמנט רשתית hTERT-אימורטליזציה (RPE1)
<ol><li>שמור על קווי תאי RPE1 במדיום הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (Hi-FBS) ו- 100 מיקרוגרם / מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין (המכונה מעתה והלאה מדיום תרבית) באינקובטור לח עם 5% CO2 ב 37 ° C. לגידול שגרתי, יש לגדל תאי RPE1 בצלחת שטופלה בתרבית רקמה בקוטר 15 ס"מ ולפצל אותם כאשר מגיעים למפגש של 80-90% (~16-18 × 106 תאים למנה של 15 ס"מ).</li>
	<li>בעת פיצול, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מ"ל של 1x פוספט buffered מלוחים (PBS).</li>
	<li>הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA כדי לכסות את כל פני השטח של המנה. שמור על התאים בטמפרטורה של 37°C עם הטריפסין עד שהם מתנתקים.</li>
	<li>לאחר טריפסיניזציה, להשעות מחדש את התאים עם מדיום תרבית ולסובב אותם למטה ב 150 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT, 22-25 ° C). הסר את supernatant בעדינות resuspend את התאים ב 10 מ"ל של מדיום תרבית.</li>
	<li>זרע 1.6-1.8 × 106 תאים לתוך צלחת חדשה 15 ס"מ (~ 1 מ"ל של השעיית התא). הערה: כל עבודת תרבית הרקמה צריכה להיעשות תחת רמות בטיחות BSL-2. זמן הדגירה של טריפסיניזציה תלוי במפגש תאים. בדרך כלל, התהליך לוקח 2-3 דקות כדי להשלים עבור צלחת 90% confluent. תאים צריכים להיבדק לזיהום מיקופלסמה על בסיס קבוע עם ערכות זמינות מסחרית (ראה דוגמאות בטבלת החומרים).</li>
</ol>2. siRNA מפיל את גן העניין (GOI)
<ol><li>זרע 1.0 × 106 תאי RPE1 לתוך צלחת טיפול תרבית רקמה 10 ס"מ עם 10 מ"ל של מדיום תרבית ביום שלפני הטרנספקציה.</li>
	<li>ביום הטרנספקציה, מורכב siRNA. עבור צלחת של 10 ס"מ, השתמש בריכוז סופי של 20 ננומטר siRPA2 ו 12 μL של מגיב טרנספקציה מבוסס שומנים ב 500 μL של מדיום טרנספקציה בסרום נמוך. ערבבו בעדינות את כל הרכיבים על ידי הזזת הצינור ודגרו ב-RT (22-25°C) למשך 5 דקות.</li>
	<li>הוסיפו את תערובת ה-siRNA המורכבת לתאים בטיפה ודגרו על התאים עם ה-siRNA במשך 48 שעות.</li>
</ol>3. סנכרון תאי RPE1 לשלב G0
<ol><li>טריפסין את תאי RPE1 משלב 2.3 כמתואר בסעיף 1 (~2 × 106 תאים).</li>
	<li>מעבירים את מתלה התא לצינורות צנטריפוגות 15 מ"ל וצנטריפוגות אותו ב 150 × גרם, RT (22-25 ° C) למשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את supernatant ו resuspend את התאים ב 12 מ"ל של PBS. צנטריפוגה את התאים ב 150 × גרם ב RT (22-25 ° C) במשך 5 דקות. חזור על הסרת הסופרנאטנט והצנטריפוגה פעמיים.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים ב- 10 מ"ל של DMEM ללא סרום בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין,1  מ"מ נתרן פירובט, 15 מ"מ HEPES, וצלחת אותם על צלחת תרבית רקמות 10 ס"מ. הערה: אם התאים נוטים להתגבש, השהה אותם מחדש ב-1 מ"ל בלבד של DMEM ללא סרום וטפט אותם מעלה ומטה 5x באמצעות קצה P1000 כדי לעקור את הגושים לפני דילול התרחיף עד לנפח סופי של 10 מ"ל.</li>
	<li>לאחר 24 שעות של רעב בסרום, הציגו את סבב ההשתקה השני באמצעות אותו הליך המתואר בסעיף 2 על ידי הוספת siRNA מורכב לתאים הרעבים בסרום.</li>
	<li>שמור את תאי RPE1 ב- DMEM ללא סרום למשך 72 שעות לפני שתמשיך לשחרור G1.</li>
</ol>4. ציפוי כיסוי ושחרור תאים לשלב G1
<ol><li>עקרו פינצטה עם 70% אתנול והניחו כיסוי זכוכית יחיד (קוטר 12 מ"מ ועובי #1.5 [0.17 מ"מ]) בבאר של צלחת 24 בארות.</li>
	<li>דללו את מטריצת ציפוי הוויטרונקטין עם PBS לקבלת ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. הוסף 500 μL של תמיסת ויטרונקטין לכל באר המכילה את הכיסויים ודגר במשך שעה אחת ב- RT.</li>
	<li>הסר את תמיסת הציפוי ושטוף את הכיסויים עם 1 מ"ל של PBS.</li>
	<li>נתקו את תאי RPE1 המורעבים בסרום מהצלחת המטופלת בתרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ באמצעות 1 מ"ל של 0.05% טריפסין לאחר שטיפת PBS למשך דקה אחת בטמפרטורה של 37°C. הערה: התאים מתנתקים הרבה יותר מהר לאחר רעב בסרום. היזהר בעת שטיפת התאים עם PBS והשתמש בזמני טריפסיניזציה קצרים.</li>
	<li>כדי להשבית את הטריפסין, להשעות מחדש את תאי RPE1 בסך הכל 6 מ"ל של מדיום תרבית. הסר את הטריפסין הבלתי פעיל על ידי סיבוב התאים כלפי מטה באמצעות 150 × גרם ב- RT (22-25 ° C) למשך 5 דקות.</li>
	<li>להשהות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מדיום תרבית ולמדוד את מספר התא.</li>
	<li>זרע 4 × 104 תאי RPE1 על הכיסוי המצופה בסך הכל 500 μL של מדיום תרבית. הערה: ודא שיכולת הכדאיות של התא גבוהה מ- 90% לפני שתמשיך לשלבים במורד הזרם. ניתן להעריך במהירות את כדאיות התא על ידי צביעה כחולה טריפאן במהלך שלב ספירת התא.</li>
	<li>לאחר 6 שעות של ציפוי התאים למדיום התרבית, תאים משוחררי G0 יהיו בשלב G1 מוקדם. בצע ניסויים ב- G1 בחלון זה של 6-12 שעות לפני שהתאים מתחילים להיכנס לשלב S.</li>
	<li>לפני הצגת נזק לדנ"א, יש לפעום את התאים עם 10 μM 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) למשך 30 דקות ב-37°C, מדולל במדיום תרבית.</li>
	<li>הסר את המדיום המכיל EdU ורדוף אחר התאים עם 10 מיקרומטר תימידין במשך 10 דקות ב 37 ° C כדי למנוע שילוב EdU שארית במהלך השראת נזק DNA.</li>
	<li>הסר את המדיום עם thymidine ולטפל בתאים עם 250 μM H2O2 במשך 1 שעות, מדולל במדיום תרבית.</li>
</ol>5. צביעה immunofluorescence של ssDNA
<ol><li>יש לשטוף תאים פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS RT (22-25°C) כדי להסיר את רכיבי המדיום והסרום. הערה: היו עדינים בעת שטיפת התאים כדי למנוע ניתוק וייבוש. אין לעבד בארות רבות בו זמנית.</li>
	<li>טרום מיצוי: דגרו על התאים שנשטפו ב-1 מ"ל של מאגר מיצוי CSK (טבלה 1) למשך 5 דקות ב-RT (22-25°C). הערה: מיצוי מקדים של CSK מסיר את כל החלבונים שאינם קשורים לכרומטין, כולל RPA2 מסיס. אזהרה: Triton X-100 מזיק בבליעה ועלול לגרום לגירוי בעור ולנזק לעיניים.</li>
	<li>הסר את מאגר CSK מהתאים ותקן אותם ישירות על ידי הוספת 0.5 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד 3.6% (ב- PBS) המכילה 0.05% Triton X-100 למשך 10 דקות ב- RT (22-25 ° C). זהירות: חשוב להכין 3.6% PFA ממלאי PFA 32% טרי. פרפורמלדהיד עלול לגרום לנזק חמור לעיניים, לגירוי בעור ולגירוי נשימתי.</li>
	<li>שטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל PBS המכיל 0.05% Triton X-100 כדי להסיר את ה-PFA.</li>
	<li>חדירה נוספת של תאים באמצעות 1 מ"ל PBS המכיל 0.5% Triton X-100 למשך 15 דקות ב-RT (22-25°C).</li>
	<li>תגובת EdU click-IT להמחשת תאים משוכפלים (שלב S)<ol><li>הסר את תמיסת החדירה ושטוף את התאים פי 2 באמצעות 1 מ"ל של חיץ חוסם (טבלה 1). אזהרה: אלבומין בסרום בקר (BSA) עלול לגרום לגירוי נשימתי.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של חיץ חוסם (טבלה 1) וניער בעדינות את הצלחת המכילה את הכיסוי למשך 10 דקות ב- RT (22-25 ° C).</li>
		<li>הסר את מאגר החסימה והוסף 500 μL של קוקטייל תגובת לחיצה המכיל פיקוליל אזיד 647 (טבלה 1). יש לדגור על החלקות הכיסוי במשך 30 דקות ב-RT (22-25°C) באמצעות נדנוד עדין ולבצע דגירות במורד הזרם בחושך. הערה: בעת שימוש בנוגדני BrdU, השתמש בכמות כפולה (1 מ"ל) ובזמן (60 דקות) עבור תגובת הלחיצה כפי שהומלץ על ידי היצרן כדי להבטיח שהתגובה רוויה וה- EdU המשולב מסומן. זה מגביל את התגובה הצולבת של נוגדני BrdU27.</li>
	</ol></li>
	<li>הסירו את תערובת תגובת הלחיצה ושטפו את התאים פעמיים עם PBS עם 0.05% Triton X-100 למשך 10 דקות ב-RT (22-25°C) (איור 1 ואיור 2).</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של חיץ חוסם ודגור ב- RT (22-25 ° C) למשך 30 דקות. לחלופין, שמור את התאים במאגר חוסם ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>יש למרוח נוגדן ראשוני (נוגד RPA2 חולדה, דילול 1:1,000) למשך שעתיים ב-RT (22-25°C) ב-250-500 מיקרוליטר של חיץ חוסם עם נדנוד עדין.</li>
	<li>שטפו את התאים פי 2 עם PBS המכיל 0.05% Triton X-100 כדי להסיר במהירות את רוב תמיסת הנוגדנים.</li>
	<li>המשך לשטוף את התאים במשך 3 x 10 דקות עם מאגר חוסם ב RT (22-25 ° C).</li>
	<li>יש למרוח נוגדן משני (אנטי-חולדה Alexa-488, דילול 1:1,000) ב-250-500 מיקרוליטר של חיץ חוסם ב-RT (22-25°C) למשך שעתיים עם נדנוד עדין.</li>
	<li>שטפו את התאים עם חיץ חוסם 2x כדי להסיר במהירות את רוב הנוגדן המשני. המשך לשטוף את התאים במשך 3 x 10 דקות עם PBS המכיל 0.05% Triton X-100 ב RT (22-25 ° C).</li>
	<li>כדי לנטרל את הגרעינים, יש לשטוף תאים פעם אחת עם PBS המכיל 0.05% Triton X-100 ו-1 μg/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) למשך 10 דקות ב-RT (22-25°C). שטפו תאים פעם אחת עם PBS למשך 5 דקות ב-RT (22-25°C).</li>
	<li>הרכיבו את זכוכית הכיסוי על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות 10 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה/כיסוי. טבלו את הכיסויים במים מזוקקים לפני ההרכבה כדי להיפטר מגבישי מלח. דמיינו את השקופיות ביום המחרת ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4°C למשך שבועות (איור 3).</li>
</ol>6. רכישה וכימות של תמונות
<ol><li>כדי לצלם תמונות, השתמש בכל מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זמין המצויד בערכות סינון שגרתיות כדי לצלם ערוצי DAPI, FITC ו- Cy5 עם הגדלה של לפחות 60-63x, צמצם מספרי גבוה ומטרות שמן כדי להמחיש מוקדים גרעיניים. הערה: עירור DAPI אופטימלי הוא ~ 359 ננומטר; עירור Alexa 488 הוא ~ 488 ננומטר; בעוד עירור Alexa 647 הוא ~ 647 ננומטר.</li>
	<li>לניתוח תמונות, פתחו קובצי תמונה בפיג'י/ImageJ.<ol><li>הכינו מסכות גרעיניות באמצעות צביעת DAPI (איור 4A-F ווידאו משלים S1).<ol><li>פתח את תמונת DAPI.</li>
			<li>בחר תהליך | שפר את הניגודיות והגדר פיקסל רווי ל- 0.35.</li>
			<li>קליק תהליך | בינארי | המר למסיכה. בחר בינארי | מלא חורים ולחץ על נתח | לנתח חלקיקים. הגדר את הגודל ל - 10-Infinity.</li>
			<li>במנהל החזר ההשקעה, לחץ על הצג הכל.</li>
		</ol></li>
		<li>מציאת מוקדי RPA2 בגרעין (איור 4G,H ווידאו משלים S1)<ol><li>פתח את תמונת RPA2.</li>
			<li>בחר תהליך | מצא את מקסימה. הגדר את ההבלטה לערך המדגיש את מוקדי RPA2 (בין 500 ל- 750), ומפריד בינה לבין הרקע.</li>
			<li>לבסוף, לחץ על לחצן מדידה במנהל החזר ההשקעה.</li>
			<li>חשב את המספר הכולל של מוקדי ssDNA גרעיניים על ידי חלוקת הערך בעמודה RawinDen ב- 255 (הערך המרבי של עוצמת הפיקסלים בכל מוקד).</li>
		</ol></li>
		<li>בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות כלי התוכנה הסטטיסטי המועדף. הערה: אל תכלול את כל התאים החיוביים ל-EdU ואת מסכות ה-DAPI המפולחות באופן שגוי מהניתוח.</li>
	</ol></li>
</ol>

זיהוי מוקדי DNA חד-גדילי בשלב G1 באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית RPA2

<ol><li>Hakem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-damage+repair%3B+the+good%2C+the+bad%2C+and+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">DNA-damage repair; the good, the bad, and ugly.</a> EMBO J. 27 (4), 589-605 (2008).</li>
<li>Gutierrez, R., O'Connor, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+direct+reversal+repair+and+alkylating+agent+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">DNA direct reversal repair and alkylating agent drug resistance.</a> Cancer Drug Resist. 4 (2), 414-423 (2021).</li>
<li>Krokan, H. E., Bjoras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Base excision repair.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a012583(2013).</li>
<li>Marteijn, J. A., Lans, H., Vermeulen, W., Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+nucleotide+excision+repair+and+its+roles+in+cancer+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 465-481 (2014).</li>
<li>Li, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+DNA+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of DNA mismatch repair.</a> Cell Res. 18 (1), 85-98 (2008).</li>
<li>Hustedt, N., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+DNA+repair+by+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The control of DNA repair by the cell cycle.</a> Nat Cell Biol. 19 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Yang, W., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translesion+and+repair+DNA+polymerases%3A+diverse+structure+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Translesion and repair DNA polymerases: diverse structure and mechanism.</a> Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).</li>
<li>Bhat, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+disruption+of+RAD52-ssDNA+complexation+via+novel+drug-like+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Cancer%22%5BJournal%5D)">Therapeutic disruption of RAD52-ssDNA complexation via novel drug-like inhibitors.</a> NAR Cancer. 5 (2), zcad018(2023).</li>
<li>Gupta, P., Saha, B., Chattopadhyay, S., Patro, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+differential+DNA+repair%2C+radio-sensitizes+WRN-deficient+cancer+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of differential DNA repair, radio-sensitizes WRN-deficient cancer cells in vitro and in vivo.</a> Biochem Pharmacol. 186, 114450(2021).</li>
<li>Pena-Diaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+mismatch+repair+as+a+source+of+genomic+instability+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Noncanonical mismatch repair as a source of genomic instability in human cells.</a> Mol Cell. 47 (5), 669-680 (2012).</li>
<li>Schroering, A. G., Edelbrock, M. A., Richards, T. J., Williams, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+and+DNA+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The cell cycle and DNA mismatch repair.</a> Exp Cell Res. 313 (2), 292-304 (2007).</li>
<li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).</li>
<li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Genschel, J., Modrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+5%27-directed+excision+in+human+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of 5'-directed excision in human mismatch repair.</a> Mol Cell. 12 (5), 1077-1086 (2003).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+excision+repair+in+human+cells%3A+fate+of+the+excised+oligonucleotide+carrying+DNA+damage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nucleotide excision repair in human cells: fate of the excised oligonucleotide carrying DNA damage in vivo.</a> J Biol Chem. 288 (29), 20918-20926 (2013).</li>
<li>Huertas, P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CtIP+mediates+cell+cycle+control+of+DNA+end+resection+and+double+strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human CtIP mediates cell cycle control of DNA end resection and double strand break repair.</a> J Biol Chem. 284 (14), 9558-9565 (2009).</li>
<li>Keijzers, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+exonuclease+1+%28EXO1%29+regulatory+functions+in+DNA+replication+with+putative+roles+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in DNA replication with putative roles in cancer.</a> Int J Mol Sci. 20 (1), 74(2018).</li>
<li>Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End+resection+at+double-strand+breaks%3A+mechanism+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">End resection at double-strand breaks: mechanism and regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (8), a016436(2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+beta+and+flap+endonuclease+1+enzymatic+specificities+sustain+DNA+synthesis+for+long+patch+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase beta and flap endonuclease 1 enzymatic specificities sustain DNA synthesis for long patch base excision repair.</a> J Biol Chem. 280 (5), 3665-3674 (2005).</li>
<li>Wold, M. S., Kelly, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+replication+protein+A%2C+a+cellular+protein+required+for+in+vitro+replication+of+simian+virus+40+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).</li>
<li>Wienholz, F., Vermeulen, W., Marteijn, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+unscheduled+DNA+synthesis+signal+enables+fluorescence-based+single+cell+quantification+of+transcription-coupled+nucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Amplification of unscheduled DNA synthesis signal enables fluorescence-based single cell quantification of transcription-coupled nucleotide excision repair.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e68(2017).</li>
<li>Wold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+protein+A%3A+a+heterotrimeric%2C+single-stranded+DNA-binding+protein+required+for+eukaryotic+DNA+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism.</a> Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).</li>
<li>Chen, R., Wold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+protein+A%3A+single-stranded+DNA%27s+first+responder%3A+dynamic+DNA-interactions+allow+replication+protein+A+to+direct+single-strand+DNA+intermediates+into+different+pathways+for+synthesis+or+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Replication protein A: single-stranded DNA's first responder: dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair.</a> Bioessays. 36 (12), 1156-1161 (2014).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+replication+protein+A+binding+mode+on+single-stranded+DNA+by+NSMF+potentiates+RPA+phosphorylation+by+ATR+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alteration of replication protein A binding mode on single-stranded DNA by NSMF potentiates RPA phosphorylation by ATR kinase.</a> Nucleic Acids Res. 51 (15), 7936-7950 (2023).</li>
<li>Kilgas, S., Kiltie, A. E., Ramadan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy-based+detection+of+ssDNA+foci+by+BrdU+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy-based detection of ssDNA foci by BrdU in mammalian cells.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100978(2021).</li>
<li>Madabhushi, R., Pan, L., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+its+links+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DNA damage and its links to neurodegeneration.</a> Neuron. 83 (2), 266-282 (2014).</li>
<li>Liboska, R., Ligasova, A., Strunin, D., Rosenberg, I., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+anti-BrdU+antibodies+react+with+2%27-deoxy-5-ethynyluridine+--+the+method+for+the+effective+suppression+of+this+cross-reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Most anti-BrdU antibodies react with 2'-deoxy-5-ethynyluridine -- the method for the effective suppression of this cross-reactivity.</a> PLoS One. 7 (12), e51679(2012).</li>
<li>Biehs, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+break+resection+occurs+during+non-homologous+end+joining+in+G1+but+is+distinct+from+resection+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand break resection occurs during non-homologous end joining in G1 but is distinct from resection during homologous recombination.</a> Mol Cell. 65 (4), 671-684.e5 (2017).</li>
<li>Cruz-Garcia, A., Lopez-Saavedra, A., Huertas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+accelerates+CtIP-mediated+DNA-end+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">BRCA1 accelerates CtIP-mediated DNA-end resection.</a> Cell Rep. 9 (2), 451-459 (2014).</li>
<li>Ercilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+tolerance+to+ssDNA+enables+strand+uncoupling+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Physiological tolerance to ssDNA enables strand uncoupling during DNA replication.</a> Cell Rep. 30 (7), 2416-2429.e7 (2020).</li>
<li>Lezaja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA+shields+inherited+DNA+lesions+for+post-mitotic+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">RPA shields inherited DNA lesions for post-mitotic DNA synthesis.</a> Nat Commun. 12 (1), 3827(2021).</li>
<li>Mukherjee, B., Tomimatsu, N., Burma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence-based+methods+to+monitor+DNA+end+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence-based methods to monitor DNA end resection.</a> Methods Mol Biol. 1292, 67-75 (2015).</li>
<li>Ochs, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+fosters+fidelity+of+homology-directed+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">53BP1 fosters fidelity of homology-directed DNA repair.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 714-721 (2016).</li>
<li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li>
<li>Forment, J. V., Walker, R. V., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput%2C+flow+cytometry-based+method+to+quantify+DNA-end+resection+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput, flow cytometry-based method to quantify DNA-end resection in mammalian cells.</a> Cytometry A. 81 (10), 922-928 (2012).</li>
<li>Mistrik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+and+stripes%3A+A+novel+quantitative+photo-manipulation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique.</a> Sci Rep. 6, 19567(2016).</li>
<li>Aten, J. A., Bakker, P. J., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double+labelling+with+IdUrd+and+CldUrd+for+spatial+and+temporal+analysis+of+cell+proliferation+and+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication.</a> Histochem J. 24 (5), 251-259 (1992).</li>
<li>Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+S-phase+labeling+of+dividing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Triple S-phase labeling of dividing stem cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+method%3A+click+chemistry+based+on+BrdU+coupling+for+multiplex+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation method: click chemistry based on BrdU coupling for multiplex antibody staining.</a> Curr Protoc Cytom. Chapter 7, Unit7.34 (2008).</li>
<li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+weaknesses+of+cell+synchronization+protocols+based+on+inhibition+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Strengths and weaknesses of cell synchronization protocols based on inhibition of DNA synthesis.</a> Int J Mol Sci. 22 (19), 10759(2021).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר.

שמירה על תרבית תאים בריאה ונטולת מיקופלסמה היא קריטית לכל הניסויים שתוארו לעיל. לתאי RPE1 יש חיבור חזק לכלי פלסטיק המטופלים בתרבית רקמות תחת אמצעי תרבית רגילים; עם זאת, מאפייני הקשירה שלהם פוחתים באופן משמעותי כאשר הם נשמרים בתנאים נטולי סרום. בנוסף, כדי לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה של מוקדי ssDNA תחת מיקרוסקופ, התאים צריכים להיות מצופים על זכוכית כיסוי בעובי 0.17 מ"מ, שאינה הידרופילית מספיק כדי לתמוך בחיבור תקין של תאי RPE1. ללא תאים שטוחים כראוי ומפוזרים באופן שווה, זה מאתגר מאוד לדמיין מוקדי ssDNA בודדים. לכן, קריטי לבחור את חומר הציפוי המתאים (למשל, ויטרונקטין) ולהשאיר מספיק זמן (6-12 שעות) לתאים להתפשט ולהתחבר לאחר שחרורם לשלב G1.
חלק מאתגר בפרוטוקול הוא להשיג תאי RPE1 הומוגניים מסונכרנים G1. זה דורש שני שלבים קריטיים. ראשית, להרעבה יעילה בסרום, יש לבצע טריפסיניזציה, לשטוף ביסודיות עם PBS ולזרוע ישירות על צלחות תרבית רקמות חדשות באמצעות מדיה נטולת סרום. שטיפת התאים ישירות בכלי תרבית רקמה להסרת הסרום לא תניב סנכרון G0 יעיל. שנית, כאשר משחררים תאים לשלב G1, יש לבצע שוב טריפסינזציה ולזרוע אותם על צלחות תרבית רקמה טריות. באופן דומה, רק שינוי המדיום והוספת מדיום גידול המכיל סרום לתאים לא יביא לכניסה סינכרונית של G1. בנוסף, עבור כניסה נכונה של G1, צפיפות הזריעה של התאים על משקפי הכיסוי המצופים חייבת להיות ברמות מפגש מסוימות. בעוד סנכרון תאים מושלם הוא בדרך כלל בלתי ניתן להשגה, פרוטוקול סנכרון זה המתואר כאן נותן ~ 97% אוכלוסיית G1 טהורה. צפיפות הזריעה המומלצת עבור RPE1 על כיסוי בקוטר 12 מ"מ היא ~ 4 × 104 כדי לרכוש שדה ראייה הומוגני להדמיה, עם מפגש של כ -70%. צפיפות זריעה גבוהה יותר גורמת לתאים להתנתק ו"להתקלף" לאחר מיצוי CSK ותגרום לאות רקע גבוה יותר במהלך רכישת התמונה.
כדי להפחית כל אות רקע ולהשיג יחס אות לרעש חיובי, שטיפה יסודית לאחר דגירה ראשונית ומשנית של נוגדנים היא חיונית. מכיוון שיש ליישם שלבי שטיפה רבים, חיוני גם למנוע מהבאר להתייבש במהלך כל שלב כביסה. אנו ממזערים חפץ זה על ידי יישום מינימום של 0.05% Triton X-100 בכל שלבי הכביסה והדגירה. לאחר שהבארות התייבשו, התאים הציגו יחס אות לרעש שונה; זה מוביל לתבנית דמוית פסיפס מתחת למיקרוסקופ ועלול להפריע להערכה. רכישת תמונה Z-stack בשילוב עם deconvolution יכולה לסייע בלכידת מוקדים במישורי מוקד שונים כדי לשפר את הניתוח.
שיטות קונבנציונליות מסתמכות על זיהוי של BrdU משולב בתנאים שאינם דנטורציה. שיטות אלה, עם זאת, תלויות בטיפול מקדים של תאים עם מינונים גבוהים של BrdU לפחות 1-2 ימים (או זמן שווה ערך מחזור התא המלא בקו התא בשימוש) כדי להבטיח שילוב גנומי אחיד. באופן בלתי נמנע, שילוב נרחב של BrdU עלול לגרום להפרעה במחזור התא36. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, שיטה זו משתמשת ב- RPA2 אנדוגני כדי לזהות מוקדי ssDNA. גישה זו אינה דורשת שילוב BrdU מונחה שכפול, ניתן להשתמש בה גם בתאים פוסט-מיטוטיים. מכיוון שאין צורך בשילוב נרחב של BrdU, הדבר חוסך זמן ומפחית את מורכבות הניסוי. על ידי שימוש בצביעת RPA2 כדי להמחיש ssDNA, אנו יכולים להשתמש ב-2′-deoxy-5-ethynyluridine (EdU) ובכימיית קליקים כדי לסמן שכפול DNA תוך הימנעות מתגובתיות צולבת אפשרית של נוגדני BrdU כנגד EdU 27,37,38. יש לנקוט בזהירות מיוחדת כדי להסוות כראוי את ה- EdU המשולב במהלך תגובת הלחיצה, כך שהנוגדנים BrdU לא יגיבו בהצלבה עם EdU27,39.
לבסוף, יתרון חשוב בשימוש ב-RPA2 במקום ב-BrdU הוא פשוט יחס אות לרעש מעולה בהשוואה לצביעת BrdU מחוץ לשלב S. מצאנו שצביעת BrdU ללא דנטורציה והיכולת שלה לדמיין ssDNA מוגבלת לשלב S אפילו בתאים משוכפלים (איור 2). נוגדן BrdU נקשר רק ל- BrdU החשוף מספיק במתיחות ssDNA. קשירה של חלבוני תיקון, כולל RPA2, למתיחות ssDNA עלולה לדכא או לעכב את החשיפה המספקת של BrdU ב- ssDNA. מצאנו גם כי מיצוי מראש של CSK נחוץ להדמיית ssDNA באמצעות נוגדן BrdU. הדבר אפשרי מכיוון שעקבות ssDNA אינן נגישות לנוגדן מבלי להסיר מהן רכיבי חלבון הקשורים קלות.
עם זאת, ישנן כמה מגבלות הקשורות לפרוטוקול זה. מגבלה של שימוש ב- RPA2 לזיהוי ssDNA היא הצורך לייעל את שלב החילוץ מראש של CSK. עודף RPA2 לא קשור חייב להישטף מהדנ"א לפני קיבוע התאים. מצד אחד, תת-מיצוי מוביל לרקע גבוה בגלל מקטע החלבון RPA2 שאינו קשור ל-ssDNA. מצד שני, מיצוי יתר יוביל לאובדן אות. עבור זיהוי BrdU, זה אינו משתנה מכיוון ש- BrdU משולב ביציבות ב- DNA ולא ניתן לשטוף אותו על ידי מיצוי מראש. לכן, יש לשקול בזהירות את זמן החילוץ מראש של CSK, את כמות Triton X-100 בחיץ, את הנפח ואת הטמפרטורה שבה מתבצע החילוץ מראש. חילוץ מוקדם של CSK גם מגביל את השימוש בגודל הגרעין כדי להבחין בין תאי G0/G1 לתאי S/G2.
בנוסף, איננו יכולים לשלול את האפשרות שחלק מהאות שמגיע מ-RPA2 מקורו בכך שהוא קשור לאינטראקטורים אחרים של חלבונים קושרי כרומטין. יש גם לקחת בחשבון את ספציפיות המין של נוגדן RPA2. הנוגדן המשמש בפרוטוקול זה יכול לזהות RPA2 של בני אדם, עכברים, חולדות, אוגרים וקופים. מגבלה נוספת של גישה זו היא שלא כל קווי התאים יכולים להיות מורעבים בסרום לסנכרון G0. רוב קווי התאים הסרטניים יכולים לעקוף את נקודות הביקורת של מחזור התא ולהתרבות אפילו במדיה נטולת נסיוב. למרות שרעב בסרום מועיל, מכיוון שהוא אינו גורם נזק לדנ"א, יש לעקוב בקפידה אחר יעילות סנכרון התאים שלהם כדי לוודא שמושגת העשרה נכונה של שלב מחזור התא. עבור תאים שאינם מגיבים לחסך בסרום, יש לשקול שיטות אחרות לסנכרון תאים (למשל, ניעור מיטוטי, עיכוב CDK1 למעצר G2, או טכניקות לא פולשניות כגון אילוטריציה צנטריפוגלית). שיטה אפשרית נוספת היא שימוש בהדמיה בתוכן גבוה כדי למדוד EdU ותכולת DNA גרעיני עבור פרופיל מחזור התא של תאים אסינכרוניים31. יש לשקול את ההשלכות של שימוש בשיטות סנכרון חלופיות כדי למנוע הפרעה לניתוח במורד הזרם. לדוגמה, השימוש בבלוק תימידין כפול או אפידיקולין, המשמש לעתים קרובות בספרות, יגרום ללחץ שכפול ולנזק לדנ"א40.
חקירת מנגנוני תיקון הדנ"א ממשיכה להוות מוקד דיון מרכזי בתחומי הסרטן והביולוגיה של התא. הפרוטוקול המוצג כאן מציע גישה רבת ערך להכנת תאים, המאפשרת הדמיה וניתוח כמותי של ssDNA עם חשיפה לחומרים מזיקים לדנ"א. יש לציין כי פרוטוקול זה מדגיש את השימוש בחלבון קושר ssDNA, RPA2, ומדגים את הספציפיות הגבוהה שלו כדי לדמיין כמויות קטנות של מוקדי ssDNA תוך הימנעות מתגובתיות צולבת לא רצויה בכל שלבי מחזור התא. השימוש ב-RPA2 מעניק יתרונות רבים, במיוחד עבור חוקרים השואפים לנתח תאים בשלב G1 של מחזור התא. פרוטוקול זה לוקח בחשבון מספר מגבלות ומטפל בחששות הקשורים להפרעות אותות, רעשי רקע לא רצויים ותגובתיות צולבת בעת שימוש בצביעת RPA2 או BrdU לזיהוי ssDNA.

כדי לקיים חיים, תאים סוקרים ומתקנים דנ"א ללא הרף כדי לשמור על שלמותם הגנומית. תאים עלולים לצבור סוגים שונים של נזק לדנ"א עקב מקורות אנדוגניים (למשל, חמצון, אלקילציה, דהמינציה, שגיאות שכפול) ואקסוגניים (למשל, UV, קרינה מייננת) של גורמי עקה של DNA. כישלון לתקן נגעים אלה גורם אפופטוזיס, מעצר מחזור התא, או הזדקנות יכול להוביל למחלות1. נגעי DNA יכולים להיות מטופלים על ידי כל אחד ממסלולי תיקון ה- DNA העיקריים הבאים: DR (תיקון היפוך ישיר), אשר מתקן בעיקר בסיסים אלקילטים2; BER (תיקון כריתת בסיס), המכוון לשגיאות בסיסי DNA לא מגושמים ולשברי DNA חד-גדיליים (SSB)3; NER (תיקון כריתת נוקלאוטידים) תיקון נגעי DNA מגושמים ומעוותים סליל4; MMR (תיקון אי-התאמה) מתמקד בעיקר באי-התאמות DNA, לולאות החדרה/מחיקה (IDLs) ונזקי בסיס מסוימים5; NHEJ (חיבור קצה לא הומולוגי) ו- HRR (תיקון רקומבינציה הומולוגית) הפעילים שניהם בהפסקות DNA דו-גדיליות (DSBs)6; ו-TLS (translesion synthesis), שהוא מנגנון מעקף נגע DNA7. למרות שלמסלולים אלה יש ייחודיות מצע ברורה, יש ביניהם חפיפות מסוימות כדי להבטיח יתירות לתיקון יעיל. הבנת הפעולה של מסלולי תיקון הדנ"א השונים בשלבים שונים של מחזור התא היא חיונית מכיוון שגורמי תיקון דנ"א אלה יכולים לשמש מטרות חיוניות לגישות טיפוליות לטיפול בסרטן, הזדקנות והפרעות נוירולוגיות 8,9.
DNA חד-גדילי (ssDNA) נוצר לאורך מחזור התא עקב תיקון נגעי DNA שנוצרו על ידי גורמים אנדוגניים ואקסוגניים הפוגעים ב- DNA. בעקה גנוטוקסית, ssDNA נוצר בשפע בשלבי S ו-G2 שבהם HRR ו-MMR הם בעלי הפעילות הגבוהה ביותר שלהם וכאשר מנגנון השכפול נתקע או קורס כאשר הם נתקלים בנגעי DNA 6,10,11. מסלולי תיקון דנ"א אחרים (למשל, NHEJ/microhomology-mediated end joining (MMEJ)/Single strand annealing [SSA]) מייצרים גם הם ssDNA במהלך תיקון DSB12. עקבות ssDNA אלה נובעות בדרך כלל מכריתת DNA, המבוצעת על ידי אקסונוקלאזות כגון EXO1, DNA2 ו- CtIP במהלך HR ו- MMR, אנדונוקלאזות כגון XPF ו- XPG במהלך NER, או באמצעות הפעולה המשולבת של POLB ו- FEN1 במהלך BER 4,13,14,15,16,17,18,19 . הודות לעבודת מנגנון השכפול, עקבות ssDNA נוצרות גם כאשר מנחת המסוקים של הדנ"א משחרר את הדנ"א מול פולימראזות משוכפלות הקשורות ל-PCNA20. לעומת זאת, בשלב G1, היעדר HRR ושכפול DNA והפעילות המוגבלת של MMR מפחיתים את היקף עקבות ssDNA הנוצרים ולכן מאתגרים יותר לאיתור 10,11,21.
רצועות ssDNA תאיות הן מבנים רגישים מאוד שיש להגן עליהם כדי למנוע היווצרות DSB. זה מושג על ידי ציפוי עקבות ssDNA עם RPA. RPA הוא קומפלקס חלבונים הטרוטרימרי שופע המורכב מתת-יחידות מרובות (RPA1, RPA2 ו-RPA3, המכונים גם RPA70, RPA32 ו-RPA14, בהתאמה), אשר באים לידי ביטוי בכל מקום לאורך מחזורהתא 22. כל תת-יחידה של RPA מכילה תחום קושר DNA (DBD), המסוגל לקיים אינטראקציה עם 4-6 נוקלאוטידים, ותת-היחידות המשולבות יוצרות ליבת טרימריזציה יציבה. בסך הכל, RPA נקשר לכ-20-30 נוקלאוטידים בעלי זיקה תת-ננומולרית23,24.
שיטות קונבנציונליות משתמשות במיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי (IF) כדי להמחיש מוקדי ssDNA על ידי תיוג 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) המשולב בדנ"א גנומי באמצעות נוגדני BrdU25. גישה זו מסתמכת על העובדה כי נוגדני BrdU יכולים לזהות BrdU רק ב- ssDNA25 חשוף. למרות שגישה זו פשוטה, היא מציגה גם מגבלות מסוימות. לדוגמה, תאים מטופלים מראש כדי לשלב BrdU לפני תחילת הניסוי, וזה לוקח זמן רב ויכול להפריע למשפיעים במורד הזרם. לכן, זיהוי ssDNA מבוסס BrdU מוגבל לתאים משוכפלים ולא ניתן להשתמש בו עבור תאים שקטים. זה לא כולל את היישום של שיטה זו כדי לחקור תיקון DNA בתאים שאינם משתכפלים למרות חשיבותה במספר מחלות כגון סרטן ניוון עצבי 5,26. בנוסף, מכיוון שהמבנים של BrdU ו-EdU דומים מאוד, רוב נוגדני BrdU מציגים תגובתיות צולבת כלפי EdU, שיש לקחת בחשבון כאשר מכוונים לניסויי תיוג כפול27. צביעת RPA שימשה בעבר להצגת מוקדי ssDNA בעיקר בתאי שלב S; עם זאת, כמה מאמרים השתמשו בו בהצלחה גם מחוץ לשלב S 28,29,30,31,32,33,34,35. הפרוטוקול הבא מנצל ביעילות את התכונות של RPA, ומאפשר הדמיה של מוקדי ssDNA בעקבות נזק לדנ"א בשלב G1 של מחזור התא (אם כי ניתן להשתמש בו בכל שלבי מחזור התא).

<table><tbody><tr><td>נוגדן אלפא-טובולין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6074</td><td>נוגדן ראשוני (1:5,000)</td></tr><tr><td>Axio Observer מיקרוסקופ הפוך</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Bis-Tris Plus מיני ג'ל חלבון, 4-12%</td> <td>Invitrogen&nbsp;</td><td>NW04127BOX</td><td></td></tr><tr><td>Western Blot Bovine Serum Albumin&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>001-000-162</td><td>חסימת</td></tr><tr><td>BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-100MG</td><td>אנלוגי נוקלאוטידים</td></tr><tr><td>נוגדן BrdU BU1/75</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>נוגדן ראשוני (1:500)</td></tr><tr><td>CellAdhere דילול מאגר</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07183</td><td>מגיב ציפוי</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Flow Cytometry ערכות בדיקה&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>ציטומרי זרימה</td> <td>C10632</td>&nbsp;</tr><tr><td>ערכת התפשטות תאים Click-iT Plus EdU להדמיה, Alexa Fluor 647 צבע</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10640</td><td>ערכת תגובת לחיצה</td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA טבליות מעכב פרוטאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5892791001</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Countess 3 מונה תאים אוטומטי&nbsp;</td><td></td><td>מונה תאי</td> <td>AMQAX2000 Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Coverslip&nbsp;</td><td>neuVitro</td><td>GG12PRE</td><td>תרבית רקמה</td></tr><tr><td>נוגדן ציקלין A2 סנטה</td><td>קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-271682</td><td>נוגדן ראשוני (1:1,000) לנוגדנים IF ו-WB</td></tr><tr><td>Cyclin B1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td>נוגדן ראשוני (1:5,000)</td></tr> <tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>בקרת רכב</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, עם HEPES</td><td>מדיום תרבית תאים 12430051 Gibco</td><td></td><td>לתאי RPE</td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>את ה-PBS המשמש לאורך כל הפרוטוקול</td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>bp220-1</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>Eclipse Ti2 סדרת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>ומיקרוסקופ</td></tr><tr><td>EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10637</td><td>אנלוגי נוקלאוטידים</td></tr><tr><td>פלקון 24 בארות</td><td>צלחת קורנינג&nbsp;</td><td>תרבית רקמה</td> <td>351147</td></tr><tr><td>כלי תרבית תאי בז 100 מ"מ</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>תרבית רקמות</td> <td>353003</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי,</td><td>תוסף מדיה</td><td>Gibco</td><td>16140071</td> מושבת בחום</tr><tr><td>פיג'י (ImageJ)</td><td>NIH</td><td>גרסה 1.54f</td><td>תוכנה ואלגוריתמים</td></tr><tr><td>FxCycle PI/RNase Staining Solution</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>F10797</td><td>PI מכתים</td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני בעל ספיחה צולבת גבוהה, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>נוגדן משני (1:1,000)</td></tr> <tr><td>עז נגד חולדות IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A48262</td><td>נוגדן משני (1:1,000)</td></tr><tr><td>נוגדן Histone H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>נוגדן ראשוני (1:10,000)</td></tr> <tr><td>hTERT RPE1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>קו תאים</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>מגיב סיגמא-אולדריץ'</td><td>H1758-100ML</td><td></td></tr> מי <tr><td>חמצן 30% נשמה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H1009-100ML</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>הידרוקסיאוריאה, 98% אבקת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H8627-5G</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>Invitrogen טהור במיוחד 0.5 מ' EDTA pH 8.0</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15-575-020</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>ליבפקטמין RNAiMAX מגיב טרנספקציה</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>13778150</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>תמיסת מגנזיום כלוריד 1 M</td><td>מגיב סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>MycoFluor</td><td>Thermo Fisher</td><td>M7006</td><td>ערכת זיהוי מיקופלזמה</td></tr><tr><td>ניאוקרזינוסטטין מ- Streptomyces carzinostaticus&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N9162-100UG</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>NuPage MES SDS מאגר ריצה (20x)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>NP0002</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>onTARGETplus Human RPA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-017058-01-0005</td><td>siRNA</td></tr><tr><td>p27 נוגדן</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>נוגדן ראשוני 610241</td><td>(1:1,000)</td></tr><tr><td>תמיסה מימית פרפורמלדהיד (32%)</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>50-980-494</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן PARP1</td> מקבע <td>טכנולוגיית איתות תאים&nbsp;</td><td>9542S</td><td>נוגדן ראשוני (1:1,000)</td></tr> <tr><td>נוגדן PCNA</td><td>טכנולוגיית איתות תאים&nbsp;</td><td>13110S</td><td>נוגדן ראשוני (1:2,000)</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>תוסף מדיה</td><td>15140163</td></tr><tr><td>pH3 נוגדן pH3</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>3377S</td><td>נוגדן ראשוני (1:2,000)</td></tr><tr><td>טבליות מעכב פוספטאז PhosSTOP</td><td>מגיב</td><td>4906837001 סיגמא-אולדריץ</td><td>'</td></tr><tr><td>PIPES מאגר 0.5 M תמיסה, pH 7.0</td><td>Bioworld</td><td>41620034-1</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>Precision Plus חלבון קליידוסקופ תקני חלבון צבוע מראש</td><td>Bio-Rad</td><td>1610395</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>גרסה 10</td><td>ניתוח סטטיסטי וגרף</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td>מדיה הרכבה</td></tr> מדיה <tr><td>בסרום מופחת (Opti-MEM)</td> <td>Gibco</td><td>31985070</td><td>המשמשת לטרנספקציה</td></tr><tr><td>נוגדן Rpa32/rpa2 (עכבר)</td><td>EMD Millipore</td><td>NA19L</td><td>נוגדן ראשוני (1:1,000) לנוגדנים WB</td></tr><tr><td>Rpa32/rpa2 (חולדה)</td><td>טכנולוגיית איתות תאים&nbsp;</td>נוגדן ראשוני <td>2208S</td><td>(1:1,000) לתמיסת</td></tr><tr><td>נתרן כלורי IF (5 מ')</td> <td>מגיב</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td><td>תוסף מדיה</td> <td>11360070 Gibco</td><td></td></tr><tr><td>נתרן טטרבוראט דקהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B3535-500G</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>תרמו מדעי פירס DAPI נגד גרעיני&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>כתם חומצת גרעין</td></tr><tr><td>תימידין, אבקת</td><td>מגיב Sigma-Aldrich</td><td>T1985-1G</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה מימית Triton X-100 (10%)</td><td>חומר ניקוי</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>1540054</td><td>חומר דיסוציאציה של תאים</td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07180</td><td>ריאגנט ציפוי</td></tr><tr><td>ZE5 Cell Analyzer</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>וזרימה ציטומריה&nbsp;</td></tr></tbody></table>

הדמיה של מוקדי dna חד-גדיליים בשלב g1 של מחזור התא

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

לדנ"א מסלולי תיקון תאיים ייעודיים המסוגלים להתמודד עם נגעים שעלולים לנבוע הן ממקורות אנדוגניים והן ממקורות אקסוגניים. תיקון DNA דורש שיתוף פעולה בין חלבונים רבים, האחראים לכסות מגוון רחב של משימות, החל מזיהוי ואיתות על נוכחות נגע DNA ועד לתיקון פיזי שלו. במהלך תהליך זה, עקבות של DNA חד-גדילי (ssDNA) נוצרים לעתים קרובות, אשר בסופו של דבר מתמלאים על ידי DNA פולימראזות. טבען של רצועות ssDNA אלה (הן מבחינת אורך והן מבחינת מספר), יחד עם הפולימראז שגויס כדי למלא פערים אלה, הם ספציפיים למסלול תיקון. ההדמיה של מסלולי ssDNA אלה יכולה לעזור לנו להבין את הדינמיקה המסובכת של מנגנוני תיקון דנ"א.
פרוטוקול זה מספק שיטה מפורטת להכנת תאים מסונכרנים G1 למדידת היווצרות מוקדי ssDNA בעת לחץ גנוטוקסי. באמצעות גישה אימונופלואורסצנטית קלה לניצול, אנו מדמיינים ssDNA על ידי צביעה עבור RPA2, מרכיב של חלבון השכפול ההטרוטרימרי קומפלקס A (RPA). RPA2 נקשר ומייצב מתווכי ssDNA המתעוררים בעקבות לחץ גנוטוקסי או שכפול כדי לשלוט בתיקון הדנ"א ובהפעלת מחסום הנזק לדנ"א. צביעת 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) משמשת להדמיה של שכפול DNA כדי לא לכלול תאים בשלב S. פרוטוקול זה מספק גישה חלופית לבדיקות הקונבנציונליות המבוססות על 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) והוא מתאים יותר לזיהוי מוקדי ssDNA מחוץ לשלב S.

הפרוטוקול הבא מציג זיהוי של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא תוך שימוש בסנכרון מחזור התא ואחריו צביעה אימונופלואורסצנטית RPA2.

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair ...

תגובת נזק לדנ"א היא הכרחית לכל החיים. מכיוון שהדנ"א חשוף כל הזמן למנועים מזיקים שונים, חוסר התיקון שלהם מוביל לחוסר יציבות גנומית ולמחלות. פיתחנו שיטה המבוססת על התכונות הביולוגיות של RPA2, כדי להמחיש דרכי דנ"א חד-גדילי במהלך תיקון דנ"א בשלבים שונים של מחזור התא.השיטה המסורתית לזיהוי DNA של גדיל יחיד משתמשת בנוגדני BrdU. גישה זו יכולה לשמש לשכפול תאים באופן פעיל. בנוסף, נוגדן זה נוטה להגיב צולבת עם אנלוגים נוקלאוטידים אחרים, הגבלת השימוש בהם.שלא כמו BRDU, לגישה שלנו יש יחס אות לרעש גבוה יותר, מה שהופך אותו לשמיש בכל שלב מחזור. הבנת הפעולה של מסלולי תיקון דנ"א שונים בשלבים שונים של מחזור התא ותאים שעשויים להיות בלתי משוכפלים היא חיונית. הפרוטוקול שלנו מספק גישה וכלי חדשים להמחשת מוקדי DNA חד-גדיליים, כאשר גישות קלאסיות המשתמשות ב-BrdU מוגבלות.הבנה מקיפה של תהליכי תיקון DNA יכולה לשמש מטרות טיפוליות לטיפול בסרטן, הזדקנות ומחלות נוירולוגיות. רוב התאים שלנו מתמיינים סופנית ולכן אינם משתכפלים ומתחלקים. חיוני להשיג הבנה טובה יותר של האופן שבו תאים אלה מתקנים נגעים שונים בדנ"א.לכן, המעבדה שלנו תתמקד בעיקר בתהליכי תיקון דנ"א לאחר שכפול ובפיתוח כלים חדשים לחקור אותם.

visualizing-single-stranded-dna-foci-in-the-g1-phase-of-the-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

אנו מציגים פרוטוקול לסינכרון תימידין כפול של תאים הלה ואחריו ניתוח באמצעות קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו היא המפתח להשגת מספר גדול של תאים, כי המשך באופן סינכרוני שלב S מיטוזה, המאפשר לימודים mitotic התפקידים של חלבונים רב תכליתי אשר גם בעלי פונקציות לאטמוספרה.

שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים כיצד לדמיין כריתת קצה דו-גדילית של דנ"א במהלך שלב S/G2 של מחזור התא באמצעות שיטה מבוססת אימונופלואורסצנטיות.

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים לקביעה מדויקת של משך שלב ה-S ב-S. cerevisiae באמצעות EdU, אנלוגי של תימידין, המשולב ב-vivo ומזוהה באמצעות כימיה של קליק על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. היא מאפשרת אפיון קל של משך שכפול הדנ"א והתעלמות מפגמי שכפול במוטציות.

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

חקור שיטה לזיהוי מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית של RPA2 בתאי RPE1. גלה כיצד שיטה זו משפרת את יחס האות לרעש ללא ריאקטיביות צולבת של נוגדנים.

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא

גלה סרטונים נוספים