ניקוי אופטי ותיוג עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בדימות מוח אנושי בקנה מידה גדול
26 בינואר 2024
הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך שלב אחר שלב לניקוי אופטי מהיר ובו-זמני, תיוג מוטי עגול ושחזור נפחי תלת-ממדי של עשרות קטעי מוח אנושיים לאחר המוות על ידי שילוב (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) טכניקת טרנספורמציה קצרה של רקמות עם הדמיה במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בפרוטוקול תפוקה גבוהה באופן שגרתי.
המוח האנושי הוא איבר מורכב המשתרע על פני מיומנויות שונות. כדי להבין את הפונקציונליות שלו, חיוני לבנות חיישני תאים מפורטים על פני המוח כולו. פרוטוקול התפוקה הגבוהה השגרתי שלנו מאפשר ניתוח של ציטוארכיטקטורה תלת-ממדית של אזורים נפחיים במוח האנושי ברזולוציה מיקרומטרית, ומאפשר אפיון מבני שלה.
שחזור נפחי של אזורים גדולים במוח האנושי מציב מספר אתגרים ניסיוניים הקשורים לממדים העצומים של דגימות המוח, ההרכב הביולוגי המורכב, תנאי הקיבוע והאחסון המשתנים לאחר המוות, והאותות האוטופלואורסצנטיים מפיגמנטים מסוג ליפופוסצין. כל אלה עלולים לפגוע ביעילות הסליקה האופטית ובהפגנת האיכות. בהשוואה לטכניקות ניקוי אחרות, שיטת טרנספורמציית הרקמה הקצרה בשילוב עם הדמיית מיקרוסקופ יריעות אור יכולה לשמש לעיבוד מהיר ובו-זמני של קטעי מוח אנושיים מרובים.
אלה גורמים לשחזור מוחי תלת-ממדי ברזולוציה תת-תאית.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה להבהרה אופטית סימולטנית, סימון רב-סבבי ושחזור נפחי בתלת-ממד של חתכי מוח אנושיים לאחר המוות. באמצעות שילוב של טכניקת S WITCH - H 2 O 2 - Antigen R etrieval - 2,2'-thiodiethanol (TDE) SHORT עם מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של גיליש-אור (light-sheet), המתודולוגיה מאפשרת אפיון מבני מפורט ברזולוציית מיקרומטרים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- היסטולוגיה
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- המוח האנושי הוא איבר מורכב הדורש בחינה מעמיקה בקני מידה משתנים.
- האתגרים כוללים טיפול בדגימות מוח גדולות ואותות של פלואורסצנציה עצמית מפיגמנטים.
- הפרוטוקול המוצג נותן מענה לחסרונות של טכניקות שקיפות (clearing) קיימות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול יעיל לניתוח מבנה המוח האנושי.
- שיפור יעילות השקיפות האופטית ואיכות ההדמיה של חתכי רקמת מוח.
- מתן אפשרות לשחזור בתלת-ממד ברמת פירוט ואמינות גבוהה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המחקר עושה שימוש במיקרוסקופיית פלואורסצנציה בלוח אור (light-sheet fluorescence microscopy).
- רקמת מוח אנושית משמשת כמודל ביולוגי, כאשר שלבי החיתוך והעיבוד המפורטים מתוארים במאמר.
- שלבים מרכזיים כוללים הטמעה של דגימות באגרוז, עיבוד באמצעות TDE וצביעה אימונוהיסטוכימית רב-סבבית עבור סממנים נוירונליים שונים.
- זמני הדגירה והטמפרטורות מוגדרים במדויק כדי להבטיח תנאי הבהרה והדמיה אופטימליים.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מוביל להבהרה אופטית יעילה ולהדמיה באיכות גבוהה של חומר אפור ולבן.
- צביעה רב-סבבית מאפשרת ויזואליזציה של אוכלוסיות נוירונליות מובחנות בחתכים של מוח אנושי.
- השיטה מדגימה את היכולת ללכוד פרטים תת-תאיים בשחזורי תלת-ממד.
מסקנות
- מחקר זה מבסס שיטה לניתוח מקיף של מבנה המוח ברזולוציית מיקרומטרים.
- הגישה מדגישה את הפוטנציאל לקידום הבנתנו את ארכיטקטורת המוח ואת השלכותיה על מחקרי נוירונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
דימיון תלת-ממדי (3D) רחב-היקף ובבעי resolução גבוהה של רקמת מוח אנושית הוא קריטי לקידום תיקוף מטרות והבנה מכניסטית במחקר ופיתוח (R&D) של תרופות נוירולוגיות. פרוטוקול ה-SHORT, בשילוב עם מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של גילי אור (light-sheet fluorescence microscopy), מאפשר מיפוי מבני מהיר ומולטיפלקסי של תתי-אוכלוסיות עצביות הן בחומר האפור והן בחומר הלבן. יכולת זו תומכת בביטחון ניבויי ובצמצום סיכונים בנקודות זמן מוקדמות של גילוי ובתהליכים תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ובפיתוח של ביו-פרמה&D
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מפורטת של הארכיטקטורה הנוירונלית ומיפוי תתי-אוכלוסיות לצורך תיקוף המטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת ההקשר הציטוארכיטקטוני ברקמת מוח אנושית.
- מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת נתונים מבניים כמותיים בעלי תוכן גבוה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין חתכי רקמה שעברו הבהרה אופטית וסימון רב-ערוצי, המתאימים לתהליכי דימוי כמותיים בהמשך העבודה.
- מנstandardיז את עיבוד הדגימות לצורך דימוי ואנליזה בעלי יכולת שחזור גבוהה ובתפוקה גבוהה.
- מאפשר זיהוי מולטיפלקס של סמנים עצביים, התומך בפיתוח בדיקות (assays) חסונות.
מחקר תרגומי וטרום-קלני
- מבצע התאמה בין תוצרי הדמיה מבנית לבין ארכיטקטורת המוח האנושי הרלוונטית למחלה.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח ישיר של רקמה אנושית.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות נתונים מקיפים של ציטו-ארכיטקטורה תלת-ממדית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות لديמות כמותי בתפוקה גבוהה של חתכי מוח אנושיים לצורך תיקוף מטרות ומחקרים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור נתיבים באמצעות מיפוי נוירונלי מפורט.
- סריקה: מספק דגימות הניתנות לשחזור ומוכנות לדימוי רב-ערוצי (multiplexed) לצורך ניתוח כמותי.
- אנליטיקה: מספק נתונים רב-ערוציים ברזולוציה סוב-סלולרית לניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית עם רלוונטיות ישירה לרקמה אנושית.
- שימוש חוזר ברמה ארגונית: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להרחבה לשימוש חוזר בתוכניות נוירוביולוגיות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של יעדים נוירוביולוגיים.
- ערך תפעולי: מספק עיבוד רקמות והדמיה סטנדרטיים, ניתנים להרחבה וניתנים לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) וניהול יעיל של תיק ההשקעות מבחינת הון.
- השפעה על תיק הנכסים: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסי נוירו-פארמה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בעיבוד רקמות, סימון אימונולוגי ומיקרוסקופיה מתקדמת.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשיטת לוח אור (light-sheet fluorescence microscopy) ותשתיות לדימות רב-ערוצי.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת הדגימות והדימות.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור אזורי מוח שונים או מצבי רקמה שונים.
- יש לשלוט בקפידה בטיפול בדגימות ובפרמטרי האינקובציה כדי להשיג תוצאות אופטימליות.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:18
Preparing Formalin‐Fixed Human Brain Sections for SHORT Tissue Transformation Technique
2:01
SWITCH ‐ H2O2 ‐ Antigen Retrieval — TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique
4:55
Sample Mounting for Light‐Sheet Fluorescence Microscopy and Stripping for Multi‐Round Labeling of the Same Specimens
