Name: ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: למדו כיצד לבנות תא זרימה ותא מיזוג לצילום במיקרוסקופ זקוף באמצעות פארפילם וחימום. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ליצור סביבה יציבה לניטור אקטין פירוק בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות תא תזרים כפי שמוצג בסרטון. ודא את החותם parafilm הדוקה ולהשתמש coverslips שטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אקטין מחייב סוכן בחדר עבור &#39;5-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק הלא ספציפית אתרי הקישור על coverslip הזכוכית עם חלבון חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקטין לפלמר בתוך החדר על ידי זורם G-אקטין ב polymerizing חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשלון unpolymerized אקטין ידי זורם חיץ עודף. </li></ol>

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

ובכן, מה שהייתי רוצה לעשות היום הוא להראות לכם כיצד לבנות תא זרימה, תא היתוך להדמיה במיקרוסקופ אנכי. לאחר מכן, אני יוצר שני חללים באמצעות סרט. מה שאני עושה הוא לוקח את ה-parafilm וגוזר אותו לרצועות קטנות.בשלב הבא, פעולה זו תבנה למעשה את התעלים עבור הדפנות, ואני מייבש אותם באמצעות זרימת אוויר מוטה. אני מניח את לוכסנית הכיסוי על גבי הפרפין, וכך זה נראה בסיום. לאחר מכן, אני מחמם זאת על גבי בלוק חימום כדי להמיס את הפרפין וליצור למעשה איטום.מה שרואים כאן הוא זכוכית כיסוי, ומעליה שתי שכבות של phim, כפי שניתן לראות כאן. ומעל לזה, שוב, ישנה זכוכית כיסוי במידה של 22 על 22 מילימטר. זו שפה, שלחצתי כנגד ה-param כדי ליצור את האיטום.בסדר, הנוזל נכנס לכאן בכיוון אחד ואני יכול לשאוב אותו החוצה באמצעות נייר סינון כאן, בכיוון הזה. אראה לכם איך לעשות זאת בעוד רגע. מה שאני מעדיף לעשות הוא להניח זאת בתא לחות, שזה תהליך פשוט מאוד.קחו שני סוגים של רצועות מוגבהות והניחו מתחתיהן מסנן נייר. כדי למנוע רעשים, כפי שעשיתי, אני מניח את מכסה הזכוכית (cover slip) על תא הזרימה. כעת, הדרך להחדרת תמיסה לתא היא פשוט להניח את קצה הפ pipette בפתח התא ולשחרר את הנוזל.כעת אני מדגיר את התא כשהמכסה סגור למשך 10 דקות. מה שאני עושה בדרך כלל כדי לשאוב את הנוזל מהצד השני הוא להשתמש בנייר סינון שגזרתי לרצועות דקות כפי שרואים כאן. אני לוקח אחת מהרצועות הדקות הללו ובמקביל אני מזניח את התמיסה בכניסה בעוד אני מניח את נייר הסינון ביציאה כדי לשאוב את התמיסה להחלפה.כך תוכלו לראות את הנוזל זורם דרך התמיסה. לאחר מכן אני ממתין חמש דקות לסגירה. כעת אני מוכן להוסיף את ה-actin, ואת ה-actin עליי למעשה לפולימריז; אני מבצע פולימריזציה בתוך תא הזרימה (flow chamber) לפי אותם הליכים כפי שבוצעו קודם לכן.מכיוון שהמצב הוא זה, וכעת לאחר שהאקטין עבר פולימריזציה, אני שוטפת את כל עודפי האקטין שלא עברו פולימריזציה באמצעות נפח גדול של באפר בלבד. כאן יש לי כ-100 µL, שזה נפח של מספר תאי ריאקציה של באפר. רק, אתם יודעים, כאשר נייר המסנן הופך לרווי, עלי לשנות את הכיוון. בסדר?כעת אני מוכן לבצע דימוי באמצעות רכיבים אלו. תא פרפוזיה עם actin מחובר אליו. כעת אני לוקח את העגלה, מניח אותה תחת המיקרוסקופ, ומכיוון שאני מבצע דימוי עם עדשת שמן, אני אשים מעט שמן טבילה על פני השטח העליון של הזכוכית, כדי להבטיח שהתמיסה, החלבון או כל רכיב אחר יגיב עם ה-actin שבפנים.לכן, אני יכול למעשה להחליף את התמיסה בזמן שאני מבצע את הדמיית ה-time lapse.

monitoring-actin-disassembly-with-time-lapse-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

Microtubules מטבעם פולימרים לא יציבים, ומיתוגם בין הצמיחה וקיצור הוא אקראי וקשה לשליטה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות microtubules המפולח עם כובעי ייצוב photoablatable. Depolymerization של microtubules המפולח יכול להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע לניתוח של תנועות עם קצות microtubule פירוק.

הכנת Microtubules מקוטע לחקר תנועות מונעים על ידי מסתיים microtubule הפירוק

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

מוצג כאן פרוטוקול מקיף לביצוע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים, שניתן להרחיב בקלות לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים. הפרוטוקול מפרט את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, רכישת הנתונים וניתוחם.

ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

פרוטוקול זה הוא מדריך להדמיה של אקטין דינמי ומיקרוטובולים באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית פנימית במבחנה (TIRF).

הדמיה של אקטין ודינמיקת צימוד מיקרוטובול במבחנה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)

מאמר זה מציג פרוטוקולים להנדסה ולאפיון רשתות תלת-ממדיות מרוכבות הניתנות לכוונון של חוטי אקטין ומיקרו-טובולים המסתבכים. חומרים מרוכבים עוברים ארגון מחדש אקטיבי ותנועה בליסטית, מונעים על ידי מנועי מיוזין II וקינסין, ומכוונים על ידי הריכוזים היחסיים של אקטין, מיקרוטובולים, חלבונים מוטוריים וקרוסלינקרים פסיביים.

שחזור ואפיון מרוכבים של אקטין-מיקרוטובול עם דינמיקה ומכניקה מונעות מנוע ניתנות לכוונון

בעבודה זו, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת לחקר הפורואלסטיות של ג'ל אקטומיוזין בתנאים מבוקרים. הדינמיקה של ג'ל האקטומיוזין והממס המוטבע מכומתים, שבאמצעותם מודגמת פורואלסטיות הרשת. אנו דנים גם באתגרים הניסיוניים, במלכודות הנפוצות וברלוונטיות למכניקת השלד התא.

המכניקה של (פורו-)רשתות אקטומיוזין אלסטיות כמערכת מודל של שלד התא

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

למדו כיצד לבנות תא זרימה ותא מיזוג לצילום במיקרוסקופ זקוף באמצעות פארפילם וחימום. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ליצור סביבה יציבה לניטור אקטין פירוק בזמן אמת.

ניטור אקטין פירוק עם מיקרוסקופיה זמן לשגות

גלה סרטונים נוספים