Name: טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: למד שיטה אוטומטית לכימות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים באמצעות הדמיית תאים חיים בשני צבעים. שיטה זו מאפשרת מעקב מדויק בזמן אמת ותומכת בפיתוח תרופות לטיפול במחלות דלקתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למדור דימות אור במשרד המדע והטכנולוגיה במכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר Intramural של המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות (ZIA AR041199).

נויטרופילים מנבדקים אנושיים בריאים התקבלו לאחר שניתנה הסכמה מדעת במסגרת פרוטוקול מאושר של מועצת הביקורת המוסדית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). הפרוטוקול עוקב אחר הנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של NIH.
1. צביעת הנויטרופילים והכנת צלחת הבדיקה
<ol><li>יש ליטול דם היקפי בהסכמה מדעת מתאימה בכתב בהתאם להנחיות של כל מכון ולבודד נויטרופילים בכל שיטה רצויה. לדוגמה, שיטת Ficoll-dextran10,11 היא שיטה נפוצה לבידוד נויטרופילים מדם היקפי אנושי. הערה: למרות שהשיטה הנדונה כאן משתמשת בנויטרופילים אנושיים, ניתן לנתח גם נויטרופילים של עכברים באמצעות פרוטוקול דומה.</li>
	<li>להשהות נויטרופילים במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI; ראה טבלת חומרים) 1640 בינוני ב 2.0 x 106 נויטרופילים / מ"ל ולמקם את תרחיף נויטרופילים לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. הערה: בדרך כלל איננו מוסיפים סרום בקר עוברי (FBS) למדיית התרבית מכיוון שאלבומין ב- FBS יכול להפחית היווצרות נטו12 ונוקלאז יציב בחום ב- FBS יכול לפגוע ב- NETs13.</li>
	<li>הוסף צבע DNA אדום חדיר לקרום (ראה טבלת חומרים) ב 1 μL לכל 1.5 מ"ל של תרחיף נויטרופילים.</li>
	<li>דוגרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בחושך. צנטריפוגה ב 2500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר supernatant.</li>
	<li>להשהות נויטרופילים ב 1 מ"ל של RPMI, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 2500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר supernatant. חזור על הפעולה 2x (סה"כ כביסה 3x).</li>
	<li>להשהות נויטרופילים ב 1 מ"ל של RPMI ולספור באמצעות מונה התא. דילול תרחיף נויטרופילים ל 1.5 x 105 נויטרופילים / מ"ל.</li>
	<li>הוסף 4 μL של 1:100-מראש מדולל מראש קרום אטום קרום ירוק DNA צבע (ראה טבלה של חומרים) לכל 1 מ"ל של תרחיף נויטרופילים.</li>
	<li>הכניסו 100 מיקרוליטר של תרחיף נויטרופילים לכל באר לתוך צלחת 96 בארות שקופה המטופלת בתרבית רקמה (ראו טבלת חומרים). הגדר כל תנאי במשולש. הערה: הראינו בעבר7 כי אין הבדל בהיווצרות נטו וכימות בשיטה זו אם נויטרופילים ממוקמים בלוחות עם או בלי ציפוי פולי-L-ליזין. לכן, השימוש בצלחת טיפול בתרבית רקמה מספיק לשיטה זו.</li>
	<li>הוסף 100 μL של RPMI המכיל ריאגנטים גירוי עם או בלי מעכב, או כל מגיב אחר בעל עניין בבארות בהתאמה. השתמש תמיד בבארות בקרה חיוביות על ידי הוספת 500 ננומטר פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט (PMA) או 2.5 מיקרומטר סידן יונופור (A23187), מעכב 30 מיקרומטר AKT שימש כאן.</li>
	<li>הניחו את הצלחת במערכת ניתוח התאים החיים (ראו טבלת חומרים) השוכנת באינקובטור של 5%CO2 . הערה: עיבוי עשוי להופיע בחלק העליון והתחתון של הצלחת מספר דקות לאחר שלב זה. זה עלול לעכב הדמיה נכונה. נגבו והסירו היטב את העיבוי לפני תחילת הסריקה. הניחו את הצלחת במכונה, הפעילו את התוכנה, הזינו פרוטוקול סריקה ולאחר מכן נגבו את הצלחת ממש לפני הסריקה הראשונה.</li>
</ol>2. צלחת סריקה כדי לדמיין נויטרופילים יוצרי NET
<ol><li>הפעל את התוכנה (ראה טבלת חומרים לקבלת פרטי תוכנה). הפעל את הוסף כלי על ידי לחיצה על + בפינה השמאלית העליונה.</li>
	<li>בחר סרוק לפי לוח זמנים. בחר חדש. הערה: לאחר יצירתו, הפעל את אותו פרוטוקול סריקה על-ידי בחירה באפשרות העתק קודם ובחירת פרוטוקול מאוחסן במסך הבא.</li>
	<li>בחר רגיל. הגדר הגדרות סריקה כ: אפשרויות תא אחר תא: ללא; ערוצי תמונה: שלב, ירוק (זמן רכישה: 200 ms), אדום (זמן רכישה: 400 ms); מטרה: פי 20.</li>
	<li>בחר את הצלחת שבה נעשה שימוש מהרשימה. בחר את מיקום הכלי שבו להניח את הצלחת על המגש של מערכת הדמיה התא החי.</li>
	<li>בחר בארות שבהן יש דגימות והחלט כמה תמונות לצלם בכל באר. בהתבסס על מספר התמונות בכל באר, צור משך סריקה משוער עבור הצלחת. בדרך כלל, 4 תמונות לכל באר מספיק; עם זאת, הדבר עשוי להשתנות בהתאם לתנאים ולתדירות הסריקות.</li>
	<li>הזן את המידע מכל באר (לדוגמה, סוג התא והתרכובת) על-ידי לחיצה על צור מפת לוחות כדי לספק שם למחקר. הערה: ניתן להכין ולשמור מראש את מפת הלוחות באמצעות עורך מפת הלוחות בתוכנה. ניתן לייבא את נתוני מפת הלוחות השמורים במהלך שלב זה. אם תרצה, ניתן לדלג על הזנת מידע על מפת הלוחות ולבצע אותה מאוחר יותר. ניתן לקבל נתונים גם מבלי להזין מידע על פריסת הלוחות. עם זאת, מומלץ להזין מידע על הצלחת כדי להקל על הניתוח הבא.</li>
	<li>במסך הבא, בחר מנתח בסיסי כסוג הניתוח ובחר פרוטוקול ניתוח מהרשימה הנפתחת, המציגה הגדרות ניתוח שהיו בשימוש בעבר (לא פרוטוקולי סריקה). ניתן להשאיר ערבוב ספקטרלי הן עבור ירוק והן עבור אדום ב- 0.0%. הערה: ניתן לדלג על שלב זה, אם תרצה בכך.</li>
	<li>תזמון סריקה. עבור הניסוי כאן, לסרוק בכל 15-20 דקות במשך 8 שעות. הגדר את שעת ההתחלה של הסריקה על-ידי גרירת הפס הלבן והאפור מעל המסך. הערה: הימנע מסריקה בתדירות גבוהה מדי, אחרת ייתכן שההתקן לא יפעל היטב עקב התחממות יתר. זמן הסריקה לא יעלה על 12 שעות לכל 24 שעות. ייתכן שתראה התראה אם הסריקה תכופה מדי.</li>
	<li>בדוק את הגדרת הסריקה במסך הבא ולחץ על הוסף ללוח הזמנים כדי להתחיל בסריקה. המתן עד שקבוצת התמונות הראשונית תיסרק כדי לאשר אם הכל פועל כשורה.<ol><li>לפעמים תאים עשויים שלא להיות ממוקדים כראוי. במקרה כזה, בדקו אם קיים עיבוי (ונגבו בהתאם), הצלחת מוגדרת כראוי על המגש, או שמיקום הצלחת מצוין נכון וכו'. אם התאים עדיין צפים ולא התיישבו לתחתית הבאר, המתינו כ-5 דקות לפני הסריקה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הגדרת הגדרת הניתוח לכימות NETs
<ol><li>פתח את המחקר (כלי) לניתוח בכרטיסיה תצוגה. לחץ על הפעל ניתוח בצד שמאל של המסך. בחר צור הגדרת ניתוח חדשה.<ol><li>אם ניתוח בוצע בעבר, השתמש באותה הגדרת ניתוח עם שינויים קלים על-ידי בחירה באפשרות העתק הגדרת ניתוח קיים. במקרה זה, עבור לשלב 3.3. אם אתה משתמש בניתוח ללא כל שינוי, בחר השתמש בהגדרת ניתוח קיים; זה לא מומלץ כי רמת פלואורסצנטיות עשויה להשתנות בין בדיקות בימים שונים, וכמה תיקונים קלים הם בדרך כלל הכרחיים.</li>
	</ol></li>
	<li>בחר Basic Analyzer. השתמשו בכל ערוצי התמונה: פאזה, ירוק, אדום וחפיפה. הערה: למרות שאנו משתמשים בדרך כלל במסיכות עצם ירוקות ואדומות כדי לספור רשתות, מסיכת אובייקט חפיפה שימושית כאשר יש חשיבות לכלוך. במקרים כאלה, מספר ספירת האובייקטים החופפים ישמש כמונה במקום ספירת אובייקטים ירוקים (ראה שלב 3.9). אם נעשה שימוש בספירת אובייקטים חופפים במקום בספירת אובייקטים ירוקים, יש לספור כראוי את כל האותות האדומים. התאם את הגדרת האות האדום כדי לספור את כל העצמים האדומים עם אות אדום נמוך בתמונות שצולמו בנקודות זמן מאוחרות יותר, אך לא כדי לספור פסולת.</li>
	<li>בחר 6 - 8 תמונות מדגם מייצג לאימון. עבור הניסוי כאן, כלול את התמונות הבאות: תמונות שצולמו בין 0 ל-20 דקות כדי למטב את הגדרת האות הירוק כדי לפצות על אותות ירוקים עדינים שיכולים להיווצר בנויטרופילים שאינם יוצרי NET תמונות של מקסימום רשתות עם שליטה חיובית, שצולמו בין 3-6 שעות (הזמן משתנה בהתאם לגירוי שבו נעשה שימוש) כדי למטב את הגדרת האות הירוק להגדרת נויטרופילים יוצרי NET תמונות שצולמו סביב נקודת הזמן של שעה אחת כדי לספור את מספר התאים הכולל (מוכתמים בצבע אדום) מכיוון שהאות האדום הגרעיני הוא החזק ביותר סביב נקודת זמן של שעה אחת (כאשר כל התאים התיישבו לתחתית הבאר) ופוחת בהדרגה עקב מוות תאי. תמונות המכילות פסולת, כדי לא לכלול אותן בספירה.</li>
	<li>הגדר את הגדרת הניתוח. עצמים אדומים ועצמים ירוקים מקבילים לגרעינים של כל הנויטרופילים ואלה היוצרים רשתות, בהתאמה. התחל עם הדוגמה הבאה של והקש Preview Current או Preview All, ומווסת כל פרמטר כדי למטב את התוצאות: לירוק: סגמנטציה- חיסור רקע: כובע עליון; רדיוס: 100 מיקרומטר; סף: 0.3 GCU; פיצול קצוות: מופעל; רגישות קצה: -20; ניקוי -מילוי חור: 100 מיקרומטר2; התאמת גודל 0 פיקסלים; מסננים- שטח: מינימום 20 מיקרומטר2, מקסימום 500 מיקרומטר2; אקסצנטריות: מקסימום 0.97; עוצמה ממוצעת: מינימום 1.00 לאדום: סגמנטציה- חיסור רקע: כובע עליון; רדיוס: 10 מיקרומטר; סף: 1.0 GCU; פיצול קצוות: מופעל; רגישות קצה: -50; מילוי חור ניקוי: 50 מיקרומטר2; התאמת גודל 0 פיקסלים; מסננים- שטח: מינימום 20 מיקרומטר2, מקסימום 400 מיקרומטר2; עוצמה ממוצעת: מינימום 1.5.<ol><li>אם אות ירוק מוגזם מופיע בנויטרופילים שלא אמורים ליצור NETs (למשל, נויטרופילים לא מגורה ב-0 דקות שיש להם גרעינים מאוגדים), זה יכול להיות בגלל הצפה של האות האדום שזוהה בתעלה הירוקה. במקרה כזה, חזור לשלב 3.1, פתח שכבות תמונה בצד שמאל של המסך והסר את האותות האדומים מהערוץ הירוק באמצעות ביטול ערבוב ספקטרלי.</li>
		<li>אפשרות נוספת היא להגדיר היטב אחת להכתמה בודדת עם צבע אדום גרעיני כדי להבהיר כמה מהאות האדום יש להסיר מהערוץ הירוק. מצד שני, בדרך כלל אות ירוק מדמם לתוך הערוץ האדום אינו משפיע על הניתוחים. הערה: אין זה משנה אם הרגישות לאות אדום נמוכה ולא כל האותות האדומים נלכדים בתמונות שצולמו בנקודות זמן מאוחרות יותר (לדוגמה, נקודת זמן של 6 שעות). המספר המרבי של ספירת עצמים אדומים בכל תמונה נחשב למספר הכולל של נויטרופילים בתמונה וישמש כמכנה בשלב 3.9. בדרך כלל, אותות אדומים גרעיניים מגיעים לשיא בסביבות נקודת זמן של שעה אחת ופוחתים בהדרגה עקב מוות תאי (איור 1B). לכן, התאם את הגדרת האות האדום כדי לספור כראוי אובייקטים אדומים בתמונות עם אותות אדומים מרביים.</li>
	</ol></li>
	<li>בחר זמני סריקה ובארות לניתוח. בדרך כלל, יש לנתח את כל נקודות הזמן והבארות. ספק תווית להגדרת הניתוח.</li>
	<li>בדוק את הסיכום והפעל את הניתוח. זה לוקח כמה שעות להשלמת הניתוח (משך תלוי במספר נקודות זמן בארות). לאחר ההשקה, שם הגדרת הניתוח יוצג תחת שם המחקר בכרטיסיה תצוגה, והתאריך המלא יוצג בסיום.</li>
	<li>לאחר השלמתו, פתח את המחקר המנותח על ידי לחיצה כפולה על שם הגדרת הניתוח. פתחו את האפשרות 'שכבות ' בצד שמאל של המסך ובדקו אם כל תא מסומן כהלכה. אם הוא אינו מסומן כראוי, חזור לשלב 3.1 וחזור על השלבים הבאים.</li>
	<li>לחץ על מדדי גרף בצד שמאל של המסך כדי לייצא את הנתונים. בחרו 'ספירה ירוקה', 'ספירה אדומה ' או 'ספירת חפיפה' (לפי תמונה) ובחרו בנקודות הזמן ובבארות שייוצאו. לקיבוץ נבחר, בחר Plate Map Replicates אם כל הבארות צוינו כהלכה בסיום הסריקה.</li>
	<li>יצא את הנתונים. חשב את אחוז התאים יוצרי NET עבור כל תנאי/נקודת זמן לפי המשוואה הבאה באמצעות תוכנה מתאימה. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66051/66051eq01.jpg" style="margin: auto;"> הערה: הסיבה לכך שהמכנה הוא ספירת עצמים אדומה מקסימלית היא שמספר העצמים האדומים מגיע לשיא בסביבות נקודת זמן של שעה אחת ויורד בהדרגה עקב מוות תאי.</li>
</ol>

כימות היווצרות נטו באמצעות ניתוח תאים חיים בצבע כפול

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Wigerblad, G., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+systemic+autoimmune+and+autoinflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases.</a> Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).</li>
<li>Wagner, D. D., Heger, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thromboinflammation%3A+From+atherosclerosis+to+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).</li>
<li>Njeim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+contributes+to+the+pathogenesis+of+diabetes+and+its+complications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications.</a> J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).</li>
<li>De Meo, M. L., Spicer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis.</a> Semin Immunol. 57, 101595(2021).</li>
<li>Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+as+drivers+of+immune+dysregulation+in+autoimmune+diseases+with+skin+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations.</a> J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).</li>
<li>Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).</li>
<li>Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+neutrophils+undergoing+NET+formation+and+distinguishing+mechanisms+of+neutrophil+cell+death+by+use+of+a+high-throughput+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method.</a> Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonlighting+chromatin%3A+when+DNA+escapes+nuclear+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control.</a> Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+quantification+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and quantification of NETosis.</a> Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).</li>
<li>Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+whole+blood+and+buffy+coats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats.</a> J Vis Exp. (175), 62837(2021).</li>
<li>Neubert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+serum+albumin+inhibit+in+vitro+formation+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Front Immunol. 10, 12(2019).</li>
<li>von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+calf+serum+contains+heat-stable+nucleases+that+degrade+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps.</a> Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
</ol>

לסופרים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

לשיטות הנוכחיות לכימות NETs ex vivo יש מספר חסרונות המגבילים את יכולתנו לחקור נויטרופילים, NETs ומטרות טיפוליות פוטנציאליות באופן בלתי משוחד ובתפוקה גבוהה10,14. לדוגמה, ספירה ישירה של תאים יוצרי NET לאחר צביעה אימונופלואורסצנטית, הנחשבת לתקן הזהב לכימות NETs, היא תפוקה נמוכה ותלויה בראייה הסובייקטיבית של המפעיל. בדיקת לוחות המזהה את הפלואורסצנטיות של צבע DNA בלתי חדיר לקרום מכמתת דנ"א חוץ-תאי כסמן חלופי של NETs באופן אובייקטיבי ובתפוקה גבוהה, אך מכיוון ש...

מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) הן מבני כרומטין דמויי רשת שנפלטים מנויטרופילים בתגובה לגירויים דלקתיים שונים. NETs מורכבים מדנ"א, היסטונים וחלבונים/פפטידים אנטי-מיקרוביאליים שונים, אשר לוכדים והורגים פתוגנים זיהומיים ומעוררים תגובות דלקתיות1.
בעוד NETs מועילים להגנה על המארח מפני פתוגנים, הם צברו תשומת לב כמניע פוטנציאלי של מחלות אוטואימוניות שונות2, פקקת3, מחלות מטבוליות4, וצמיחה גרורתית של סרטן5. ככזה, עיכוב של היווצרות NET הוא אופציה טיפולית פוטנציאלית עבור מחלות אלה. עם זאת, למרות כמה מולקולות מכוונות NETs מבטיחות בפיתוח6, עדיין אין טיפול מאושר המשפיע באופן ספציפי על מנגנון זה. ניתן לייחס זאת, לפחות חלקית, להיעדר שיטות כימות אובייקטיביות, בלתי מוטות, ניתנות לשחזור ובעלות תפוקה גבוהה ליצירת NET.
הקמנו ודיווחנו על שיטה חדשה המשתמשת בפלטפורמת דימות תאים חיים בצבע כפול 7,8. תמונות בהילוך מהיר של נויטרופילים מוכתמים בצבע גרעיני חדיר לקרום וצבע DNA בלתי חדיר לקרום מנותחות על ידי התוכנה, ומספרי הנויטרופילים לפני ואחרי יצירת NET נספרים במספר נקודות זמן. מאחר ששלמות קרום הפלזמה אובדת במהלך היווצרות הרשת על ידי ויסות פירוק לאמין B בתיווך PKCα ולאמין 9 בתיווך CDK4/6, נויטרופילים יוצרי NET מוכתמים על ידי צבע DNA אטום לקרום בעוד נויטרופילים בריאים אינם. שיטה זו מתגברת על הבעיות של טכניקות שדווחו בעבר לכימות היווצרות NET ומספקת כימות NET בלתי מוטה, תפוקה גבוהה, ניתנת לשחזור ומדויקת באופן אוטומטי.

<table><tbody><tr><td>מעכב AKT</td><td>Calbiochem</td><td>124028</td><td></td></tr><tr><td>צלחת שקופה 96 בארות</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ניתוח תאים חיים</td><td>Sartorius</td><td>N/A</td><td>Incucyte Software (v2019B)</td></tr><tr><td>צבע ירוק DNA אטום לממברנה&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>צבע אדום גרעיני</td><td>Enzo</td><td>ENZ-52406</td><td>גלולת נויטרופילים הופכת לכחלחלה.</td></tr><tr><td>ניתן להשתמש ב-RPMI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11835030</td><td>פנול אדום מכיל RPMI.</td></tr></tbody></table>

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

Real-Time High Throughput Technique to Quantify Neutrophil Extracellular Traps Formation in Human Neutrophils

נויטרופילים הם תאים משושלת מיאלואידית המהווים חלק חיוני של מערכת החיסון המולדת. העשור האחרון חשף תפקידי מפתח נוספים שנויטרופילים ממלאים בפתוגנזה של סרטן, מחלות אוטואימוניות ומצבים דלקתיים חריפים וכרוניים שונים, בכך שהם תורמים לייזום ולהנצחה של חוסר ויסות חיסוני באמצעות מנגנונים מרובים, כולל היווצרות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs), שהם מבנים חיוניים להגנה אנטי-מיקרוביאלית. מגבלות בטכניקות לכימות היווצרות רשת באופן בלתי מוטה, ניתן לשחזור ויעיל הגבילו את יכולתנו להבין עוד יותר את תפקידם של נויטרופילים בבריאות ובמחלות. אנו מתארים שיטה אוטומטית, בזמן אמת ובתפוקה גבוהה לכימות נויטרופילים העוברים היווצרות רשת באמצעות פלטפורמת הדמיה של תאים חיים בשילוב עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה, תוך שימוש בשני צבעי דנ"א שונים כדי לדמיין דנ"א תוך-תאי וחוץ-תאי. מתודולוגיה זו מסוגלת לסייע בהערכת הפיזיולוגיה של הנויטרופילים ולבדוק מולקולות שיכולות להתמקד בהיווצרות רשת.

שיטה זו מספקת ניגודיות פאזה, תמונות פלואורסצנטיות אדומות (צבע חדיר לממברנה) וירוק פלואורסצנטי (צבע אטום לממברנה) שצולמו בכל נקודת זמן. יחד עם תהליך יצירת NET, שינויים מורפולוגיים נצפים בניגודיות פאזה ובתמונות פלואורסצנטיות אדומות, וברגע שהקרום נפרץ, ניתן לראות פלואורסצנטיות ירוקה (איור 1). בניסוי זה, נויטרופילים יוצרי NET הם בדרך כלל עגולים, במקום ליצור מבנה דמוי רשת. הסיבה לכך היא שהרזולוציה של המכונה אינה גבוהה מספיק כדי ללכוד מבנה דמוי רשת עדין וצבע ירוק בלתי חדיר מכתים את הכרומטין לפני ש...

אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.

Neutrophils are myeloid-lineage cells that form a crucial part of the innate immune system. The past decade has revealed additional key roles that ...

המחקר שלנו מתמקד בנויטרופילים, שהם מגיבים ראשונים חיוניים במערכת החיסון וממלאים תפקיד משמעותי במחלות שונות. במהלך שני העשורים האחרונים, התברר כי נויטרופילים תורמים להתפתחות סרטן, מחלות אוטואימוניות ומצבים דלקתיים אחרים על ידי שיבוש הוויסות החיסוני. זה כולל יצירת מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות, רשתות, מבנים דמויי רשת המגיבים לדלקת ויכולים להיות ממוקדים לטיפול במחלות אלה.עם זאת, למרות כמה מולקולות מבטיחות המכוונות לרשתות, בפיתוח עדיין אין טיפול מאושר המשפיע באופן ספציפי על מנגנון זה. ניתן לייחס זאת לפחות חלקית להיעדר שיטת כימות אובייקטיבית, בלתי מוטה, ניתנת לשחזור ובעלת תפוקה גבוהה להיווצרות נטו. הפרוטוקול שלנו משתמש בהדמיית תאים חיים בשני צבעים כדי לנתח התנהגות נויטרופילים באמצעות צבעים חדירים ובלתי חדירים לממברנה למעקב מדויק אחר היווצרות רשת.שיטה זו מבחינה בין נויטרופילים יוצרי רשת ובריאים בהתבסס על שלמות הממברנה ומספקת התמיינות ברורה של סוגי מוות תאי באמצעות שינויים מורפולוגיים הנבלעים בדימות ניגודיות פאזה. שיטה זו מתגברת על הבעיות של טכניקות שדווחו בעבר לכימות היווצרות נטו ומספקת כימות רשת יעיל, ניתן לשחזור ומדויק באופן אוטומטי. שיטה זו תסייע בפיתוח תרופות ממוקדות נויטרופילים על ידי מתן היכולת לסנן מטרות טיפוליות מרובות נגד היווצרות נטו באופן תפוקה גבוהה.

real-time-high-throughput-technique-to-quantify-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה ליצירת ובידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs). נויטרופילים מבודדים מדם היקפי ומעוררים באמצעות phorbol myristate acetate (PMA) כדי לייצר NETs. במהלך הדגירה, הנויטרופילים עוברים תהליך של מוות תאי (NETosis) כדי לשחרר NETs המורכבים מכרומטין מעובה מעורבב עם חלבונים ציטופלזמיים גרגיריים.

טכניקת מבחנה ליצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות אנושיות

סרטון זה מדגים את ההשראות וההדמיה של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות או NETs בנויטרופילים מסומנים מראש באמצעות נסיוב מטופלים המכיל נוגדנים ציטופלזמיים אנטי-נויטרופילים. יתר על כן, שימוש בצבע DNA בלתי חדיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה של NETs.

אינדוקציה והדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים שסומנו מראש

מוצגים מבחני תפוקה גבוהים המספקים בשילוב כלים מצוינים לכימות שחרור NET מנויטרופילים אנושיים.

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

אנו מתארים שיטות כדי לבודד את הכלבים נויטרופילים של דם מלא, להמחיש את NET-צורה נויטרופילים בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ זריחה. גם המתוארים הם פרוטוקולים לכמת היווצרות נטו, citrullinated היסטון H3 (citH3) ביטוי באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence.

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת נויטרופילים מלכודות (רשתות) ו-NETQUANT הפעלה, תוכנה אוטומטית לחלוטין לכמת של רשתות בתמונות immunofluorescence.

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

פרוטוקול זה מתאר assay מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים (נטו) של תפוקה רגיש מאוד, גבוהה עבור כימות חצי אוטומטיות של ex-vivo נטו היווצרות מאת immunofluorescence קונפוקלית תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות נטו והשפלה אחרי גירויים שונים והוא יכול לשמש כדי ללמוד טיפולים פוטנציאליים, ממוקדות נטו.

תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

מוצג כאן פרוטוקול לאינדוקציה וניתוח של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות במבחנה (NETs). כימות של דנ"א, קתליצידין (LL37) ופעילות אנזים הניב נתונים המראים את השונות בהרכב ובמורפולוגיה של NETs המושרים על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים בתנאים מבוקרים דומים.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

פרוטוקול מוגדר זה מתאר גישת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להמחיש ולכמת שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית (NET) במבחנה. השיטה הניתנת לשחזור מאפשרת לחקור את המאפיינים והקינטיקה של שחרור NET בעת גירוי עם משפרי NETosis מובהקים ומאפשרת הערכה של הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים של NETosis.

כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

מלכודות תאי נויטרופילים (NETS) הן מנגנון חשוב החיסון המולדת להילחם חיידקים פתוגניים, פטריות וטפילים. כאן אנו מתארים שיטות לבודד גרנולוציטים נויטרופילים מהדם האנושי כדי להפעיל אותם בצורה הרשתות. אנו מציגים טכניקות הכנה לדמיין הרשתות מיקרוסקופ אור אלקטרונים.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

כאן אנו מדווחים טכניקה ניסויית של מיקרוסקופיה intravital פלואורסצנטי לדמיין אינטראקציות heterotypic טסיות דם נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים. טכנולוגיה מיקרוסקופית זה תהיה יקרה כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של מחלת כלי דם ולבדוק סוכנים תרופתיים בתנאי pathophysiological.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

למד שיטה אוטומטית לכימות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים באמצעות הדמיית תאים חיים בשני צבעים. שיטה זו מאפשרת מעקב מדויק בזמן אמת ותומכת בפיתוח תרופות לטיפול במחלות דלקתיות.

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

גלה סרטונים נוספים