שימוש במחשוף תחת מטרות ותיוג (CUT&Tag) בדיקה במחקר מיובלסטים עכבר
1 במרץ 2024
חוקרים חדשים בתחום האפיגנטי ימצאו את CUT&Tag חלופה קלה משמעותית למבחני ChIP. CUT&Tag הועילה מאוד למחקרים אפיגנטיים על אוכלוסיות תאים נדירות וראשוניות, והפיקה נתונים באיכות גבוהה ממעט מאוד תאים. פרוטוקול זה מתאר ביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&Tag על מיובלסטים של עכברים שבודדו משרירי הגפיים האחוריות של העכבר.
המחקר של הקבוצה שלנו מתמקד באופן שבו מבנה הגנום, והשעתוק, בתאי גזע של שרירי שלד בוגרים מווסתים ומתוחזקים, במיוחד במהלך שינויים סולפטים, כמו מחויבות תאי גזע, התמיינות וטינזיס. תאי גזע של שרירי שלד בוגרים, המהווים רק 1% מתאי מונו-גרעין ברקמת השריר, מהווים אתגר למחקרי תכונות כרומטין המשתמשים ב-High-C, ChIPs ו-ATAC seq, בשל מיעוטם בתרחיפים של תאים בודדים המתקבלים מעיכול שרירים. Chromatin immuno-precipitation, ChIP, היה כלי מפתח ליצירת פרופיל תכונות גנום.
טכניקת cut&tag פשוטה ויעילה יותר, שפותחה על ידי ד"ר סטיבן הניקוף, עולה לעתים קרובות על ChIP, במיוחד בחקר אפיגנטיקה באוכלוסיות תאים נדירות. קלות השימוש בו מרחיבה את הנגישות לחוקרים, כולל מומחים שאינם אפיגנטיים.
סקירה כללית
מאמר זה דן ביתרונות של טכניקת CUT&Tag על פני בדיקות ChIP מסורתיות לחקר אפיגנטיקה באוכלוסיות תאים נדירות, ובאופן ספציפי בתאי גזע של שריר שלד בבוגרים. הפרוטוקול מתמקד בביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&Tag במיובלסטים של עכברים שבודדו משרירי הגפיים האחוריות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אפיגנטיקה
- ביולוגיה של התא
- מחקר תאי גזע של השריר
רקע
- תאי גזע של שריר שלד בבגרות הם נדירים, ומהווים רק 1% מהתאים בעלי הגרעין הבודד ברקמת השריר.
- שיטות מסורתיות כגון ChIP ו-ATAC-seq ניצבות בפני אתגרים בשל הזמינות הנמוכה של תאים אלו.
- CUT&Tag היא טכניקה פשוטה ויעילה יותר לאפיון מאפייני כרומטין.
- שיטה זו משפרת את הנגישות עבור חוקרים, כולל כאלו שאינם מתמחים באפיגנטיקה.
מטרת המחקר
- להדגימה את יעילותו של CUT&Tag בחקר מודיפיקציות אפיגנטיות באוכלוסיות תאים נדירות.
- לספק פרוטוקול מפורט לביצוע בדיקות H3K4me1 CUT&Tag.
- להקל על המחקר בתחום האפיגנטיקה עבור קשת רחבה יותר של מדענים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בידוד מיובלסטים של עכבר משרירי הגפה האחורית.
- הכנת חרוזי Concanavalin A עבור בדיקת CUT&Tag.
- יישום פרוטוקול CUT&Tag לניתוח מודיפיקציות H3K4me1.
- איסוף נתונים וניתוח של מאפיינים אפיגנטיים.
תוצאות עיקריות
- שיטת CUT&Tag מספקת נתונים באיכות גבוהה ממספר קטן מאוד של תאים.
- הטכניקה מאפשרת מיפוי מוצלח של מודיפיקציות אפיגנטיות בתאי גזע של שריר.
- התוצאות מדגימות את היתרונות של CUT&Tag על פני שיטות מסורתיות.
- הממצאים תורמים להבנה טובה יותר של ויסות הגנום בתאי גזע של שריר.
מסקנות
- CUT&Tag הוא כלי בעל ערך עבור חוקרים הלומדים אפיגנטיקה באוכלוסיות תאים נדירות.
- הפרוטוקול משפר את היכולת להפיק נתונים משמעותיים מדגימות מוגבלות.
- מחקר זה תומך ביישום רחב יותר של CUT&Tag בתחומי מחקר ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי מאפייני כרומטין באוכלוסיות תאים נדירות מהווה אתגר קריטי בשלבי הגילוי המוקדמים ובתיקוף מטרות, במיוחד במחקר של תאי גזע של השריר. בדיקת CUT&Tag מאפשרת מיפוי ברגישות גבוהה של פקטורים נקשרי כרומטין וסימני היסטון ממספר תאים מינימלי, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בזיהוי מטרות אפיגנטיות. יכולת זו מייעלת את תיעדוף הפורטפוליו ומפחיתה סיכונים בהשערות מכניסטיות בשלבים מוקדמים בביולוגיה של השריר ותאי הגזע.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מצב הכרומטין והבטרה שעתוקית באוכלוסיות תאים נדירות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מיפוי סימני היסטון וגורמי כרומטין בלוכוסים גנומיים ספציפיים.
- משפר את רמת הביטחון החזויה עבור מטרות אפיגנטיות על ידי הפחתת הטיות דגימה ורעשי רקע.
- מסייע במיון תיקי פיתוח באמצעות אספקת נתונים חסונים מחומר ביולוגי מוגבל.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות מאומתות למיפוי כרומטין עבור תהליכי סריקת תרכובות בהמשך הדרך.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של מודיפיקציות היסטונים וקישור של גורמי כרומטין.
- מאפשר סטנדרטיזציה וסקלאביליות של הבדיקה הודות לדרישות נמוכות לכמות תאי קלט.
- תומך בהערכה מהימנה של מודולטורים אפיגנטיים במסעות סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את תוצרי מיפוי הכרומטין למודלים של תאי גזע של שריר הרלוונטיים למחלה.
- שומר על רציפות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני של מנגנונים אפיגנטיים.
- מפחית את הסיכון בקבלת החלטות בנוגע להמשך התקדמות על ידי אספקת נתוני כרומטין רזולוטיביים ובלתי מוטים.
- תומך ביישור סממנים ביולוגיים (biomarkers) למחקרי התחדשות ודיפרנציאציה של שרירים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
בדיקת ה-CUT&Tag משתלבת ברצף הגילוי, החל מאישור יעדים מוקדם ועד למחקר פרה-קליני, במיוחד במקרים שבהם מחסור בתאים מגביל גישות מסורתיות המבוססות על ChIP.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים באוכלוסיות נדירות של תאי גזע שריריים.
- סריקה: מספקת פרופיל כרומטין הניתן לשחזור ומוכן לבדיקה לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני ריצוף כמותיים עם רקע נמוך להשוואה חסונה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מיפוי מצב הכרומטין למודלים של שרירים הרלוונטיים למחלה ולאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה ובעלת יישום רחב לפרופיל כרומטין בסוגי תאים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות אפיגנטיות.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימות העבודה באמצעות פחות שלבים, כמות תאים נמוכה יותר ורגישות גבוהה יותר מאשר ChIP.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ויעילות הונית על ידי אספקת נתונים חסונים מדגימות נדירות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות אפיגנטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של כרומטין ובניתוח רצף דור הבא (next-generation sequencing).
- נחושה גישה לתשתיות לטיפול בחרוזי מגנט, PCR וריצוף.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאמה לסוגי תאים שונים במידה וקיבוע באמצעות חרוזי Concanavalin-A הוא אפשרי.
- מוגבל על ידי הצורך בנוגדנים באיכות גבוהה וטיפול זהיר בדגימות כדי לצמצם הטיות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:15
Sequestration of Mouse Myoblasts onto Activated Concanavalin‐A Beads
3:08
Incubation of Mouse Myoblast‐Sequestered Concanavalin‐A Beads with Antibodies for CUT&Tag Assay
4:59
Genomic Purification and Library Preparation of Tagmented Mouse Myoblast DNA for Epigenetic Profiling
