Name: יצירת קו תאים RIP1 Knockout U937 באמצעות מערכת CRISPR-Cas9 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: למדו כיצד ליצור קו תאים U937 עם knockout ל-RIP1 באמצעות CRISPR-Cas9. שיטה זו מאפשרת חקירת תפקיד RIPK1 במסלולי תקשורת תאית וביולוגיה של התא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Gostimskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%E2%80%93Cas9%3A+A+History+of+its+discovery+and+ethical+considerations+of+its+use+in+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+%28Mosc.%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR–Cas9: A History of its discovery and ethical considerations of its use in genome editing.</a> Biochem (Mosc.). 87 (8), 777-788 (2022).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual+RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Redman, M., King, A., Watson, C., King, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dis+Child+Educ+Pract+Ed%22%5BJournal%5D)">What is CRISPR/Cas9.</a> Arch Dis Child Educ Pract Ed. 101 (4), 213-215 (2016).</li>
<li>Ebrahimi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+CRISPR+PX-LmGP63+vector+effect+on+pathogenicity+of+Leishmania+major+as+a+primary+step+to+control+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of CRISPR PX-LmGP63 vector effect on pathogenicity of Leishmania major as a primary step to control leishmaniasis.</a> Microb Pathog. 161 (Pt A), 105281(2021).</li>
<li>Ebrahimi, S., Alipour, H., Azizi, K., Kalantari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+px-lmgp63+using+crispr-cas9+as+primary+goal+for+gp63+gene+knockout+in+Leishmania+major+and+leishmanization%5BTitle%5D)+AND+%22Jundishapur+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction of px-lmgp63 using crispr-cas9 as primary goal for gp63 gene knockout in Leishmania major and leishmanization.</a> Jundishapur J Microbiol. 14 (1), 112965(2021).</li>
<li>Lim, J. M., Kim, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+and+clinical+applications+of+CRISPR-based+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Med+J%22%5BJournal%5D)">Basic principles and clinical applications of CRISPR-based genome editing.</a> Yonsei Med J. 63 (2), 105-113 (2022).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+delivery+to+hard-to-transfect+cells+via+membrane+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation.</a> Sci Adv. 1 (7), 1500454(2015).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+for+the+study+of+hematopoietic+cells+in+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models.</a> J Vis Exp. (152), e59977(2019).</li>
<li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 796991(2021).</li>
<li>Mccaig, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Dis. , 1-14 (2018).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+prime+the+hyperglycemic+shift+from+apoptosis+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS prime the hyperglycemic shift from apoptosis to necroptosis.</a> Cell Death Dis. 6 (1), (2020).</li>
<li>Deragon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+trafficking+of+MLKL%2C+Bak%2FBax%2C+and+Drp1+Is+mediated+by+RIP1+and+ROS+which+leads+to+decreased+mitochondrial+membrane+integrity+during+the+hyperglycemic+shift+to+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial trafficking of MLKL, Bak/Bax, and Drp1 Is mediated by RIP1 and ROS which leads to decreased mitochondrial membrane integrity during the hyperglycemic shift to necroptosis.</a> Int J Mol Sci. 24 (10), 8609(2023).</li>
<li>LaRocca, T. J., Sosunov, S. A., Shakerley, N. L., Ten, V. S., Ratner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemic+conditions+prime+cells+for+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemic conditions prime cells for RIP1-dependent necroptosis.</a> J Biol Chem. 291 (26), 13753-13761 (2016).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+and+its+role+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cytosolic+ATM%2FNEMO%2FRIP1+complex+recruits+TAK1+To+mediate+the+NF-%CE%BAB+and+p38+Mitogen-Activated+Protein+Kinase+%28MAPK%29%2FMAPK-activated+protein+2+responses+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A Cytosolic ATM/NEMO/RIP1 complex recruits TAK1 To mediate the NF-κB and p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/MAPK-activated protein 2 responses to DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 31 (14), 2774-2786 (2011).</li>
<li>Eng, V. V., Wemyss, M. A., Pearson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+RIP+kinases+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of RIP kinases in host-pathogen interactions.</a> Semin Cell Dev Biol. 109, 125-143 (2021).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+in+the+inflammatory+response+and+sepsis%3A+Recent+advances%2C+drug+discovery+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">RIPK1 in the inflammatory response and sepsis: Recent advances, drug discovery and beyond.</a> Front Immunol. 14, 1114103(2023).</li>
<li>Kowolik, C. M., Yee, J. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+transduction+of+human+hepatocytes+with+lentiviral+vectors+pseudotyped+by+Sendai+virus+F+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein.</a> Mol Ther. 5 (6), 762-769 (2002).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Keller, A. A., Maeß, M. B., Schnoor, M., Scheiding, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Transfecting Macrophages.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1784, 187-195 (2018).</li>
<li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THP-1+and+U937+cells.+The+impact+of+food+bioactives+on+health%3A+In+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22models%22%5BJournal%5D)">THP-1 and U937 cells. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo.</a> models. 159 (147), (2015).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 4 (4), 495-505 (2009).</li>
<li>Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+lentiviral+transduction+of+mouse+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (3), 441-450 (2008).</li>
<li>Swainson, L., Mongellaz, C., Adjali, O., Vicente, R., Taylor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+transduction+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Lentiviral transduction of immune cells.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 415, 301-320 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>מדיום DMEM מותאם</td><td>ג'יבקו</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>סיגמא</td><td>א 1593</td><td></td></tr><tr><td>ביסבנזמיד הוכסט 33342 טריהידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 בינוני שלם</td><td>סיגמא</td><td>₪1,200</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR NTC gRNA E.coli Strain</td><td>טרנס-אומיק</td><td>TELA1011</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR RIP1 gRNA E.coli זן</td><td>טרנס-אומיק</td><td>תה-1162203</td><td></td></tr><tr><td>מסובב מקצה לקצה</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי EVOS FL</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת GenElute Plasmid Maxiprep</td><td>סיגמא</td><td>PLX15</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן IgG נגד ארנב עיזים, (H+L) מצומד HRP</td><td>סיגמא</td><td>AP307P</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T תאים</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור שייקר</td><td>ניו ברונסוויק סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB אגר</td><td>ב.ד.</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>מרק LB</td><td>ב.ד.</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>תערובת אריזות LV-MAX Lentiviral</td><td>ג'יבקו</td><td>א43237</td><td></td></tr><tr><td>אדום MitoSOX</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-D1055</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר NanoDrop</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נקרוסטוטין-1</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-14622א</td><td></td></tr><tr><td>אופטי-מם</td><td>ג'יבקו</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>פורומיצין</td><td>סיגמא</td><td>עמ' 7255</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי אנושי RIP1 mAb</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>3493</td><td></td></tr><tr><td>ציוד SDS-PAGE ו-Western Blot</td><td>ביוראד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF ואלפא;</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P7058</td><td></td></tr><tr><td>U937 מונוציטים אנושיים</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת בדיקת התפשטות תאים WST-1</td><td>טקארה</td><td>MK400</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 מגיב טרנספקציה של DNA</td><td>רוש דיאגנוסטיקס</td><td>6365779001</td><td></td></tr><tr><td>z-VAD-FMK</td><td>APExBIO</td><td>א1902</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירת קו תאים rip1 knockout u937 באמצעות מערכת crispr-cas9

Generation of a RIP1 Knockout U937 Cell Line Using the CRISPR-Cas9 System

בעקבות ייצור אוכלוסייה משולבת של תאי U937 מוטנטיים RIP1 CRISPR, בוצעו ניתוח SDS-PAGE וכתמים מערביים. ניתוח הכתם המערבי שימש לקביעת היצירה המוצלחת של קו תאים מוטנטי RIP1 CRISPR על ידי הערכת אובדן רמות ביטוי חלבון RIP1. קביעה זו נעשתה על סמך התוצאה ההשוואתית של מונוציטים WT U937 ותאי NTC. באיור 2, הביטוי של RIP1 לא זוהה עבור תאי המוטציה של 5 מיקרוגרם/מ"ל puromycin RIP1 CRISPR , אך זוהה הן עבור תאי WT U937 והן עבור תאי NTC. תוצאה זו מדגימה כי פרוטוקול זה הוא שיטה אמינ...

יצירת קו תאים RIP1 Knockout U937 באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

This protocol outlines a procedure for knocking out the RIP1 gene using CRISPR/Cas9 in the human monocyte U937 cell line. The method utilizes designated ...

המחקר שלנו מתמקד במוות תאי יונקים, ובמיוחד בחקר האיזון בין אפופטוזיס לנקרופטוזיס בהקשר של היפרגליקמיה. לאחרונה, הוכח כי חלבון המוות התאי RIP1 קינאז מווסת את ביטוי הגנים במהלך נקרופטוזיס. האתגר הניסויי הנוכחי שלנו הוא מניפולציה גנטית של תאים חיסוניים הגדלים בתרחיף, במיוחד חיסול הגן ל-RIP1 קינאז באמצעות CRISPR-Cas9.הפרוטוקול שלנו מציע שני יתרונות ברורים. זה משפר את שיטות הטרנספקציה עבור תאים חיסוניים הגדלים בתרחיף על ידי שימוש ב-lentivirus, וזה מבטל את הצורך בשיבוט תא בודד במהלך תהליך יצירת נוקאאוט גנטי באמצעות CRISPR-Cas9, התוצאות שלנו סללו את הדרך לחקר תפקידו של RIP1 קינאז בשינוי ההיפרגליקמי בנקרופטוזיס. כדי להתחיל פס רבעוני, Escherichia coli המכיל את הווקטור הלנטי-ויראלי מנחה את ה-RNA על לוחות אגר לוריא-ברטאני או LB בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים עד שמושבות בודדות נראות באזור המדולל ביותר בצלחת. לאחר הדגירה, בעזרת לולאה סטרילית, בחר מושבה בודדת והוסף אותה לחמישה מיליליטר מרק LB, בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. אוורור והדביקו את מכסה הצינור.דגרו את הצינור בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד למשך שמונה שעות. בינתיים, הוסיפו 40 מיליליטר מרק LB, בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין לארבעה צינורות של 50 מיליליטר. לאחר הדגירה, העבירו 40 מיקרוליטר מהתרבות הגדלה לכל אחד מארבעת הצינורות.אוורור והדביק את מכסי הצינורות לפני הדגירה שלהם בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד למשך 12 עד 16 שעות. למחרת, צנטריפוגה את התרבויות ב -3, 220 x גרם ברוטור דלי מתנדנד למשך 20 דקות. שפכו את הסופרנטנטים לכוס פסולת ושלבו את כל ארבעת הכדורים ל-10 מיליליטר מרק LB, בתוספת אמפיצילין.צנטריפוגה של הכדורים המשולבים במהירות מקסימלית ברוטור דלי מתנדנד למשך 20 דקות כדי להשיג כדור בודד ולהשליך כמה שיותר מהסופרנטנטים לכוס הפסולת. זרע HEK293T תאים בריכוז של שלוש עד חמש פעמים 10 בחזקת שישה תאים לבקבוק T25 המכיל DMEM. דגרו את הבקבוק למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.בינתיים, הכינו את תערובת הטרנספקציה באמצעות יחס של 1:1:1:1 של פלסמידים ויחס של 3:1 של מגיב טרנספקציה ל-DNA פלסמיד עם מדיום סרום מופחת. מערבבים 75 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה, 2, 500 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ו-25 מיקרוגרם של DNA פלסמיד כולל. הניחו לתערובת לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות.לאחר מכן, פיפטה בזהירות את תערובת הטרנספקציה על תאי HEK293T המשולבים בבקבוק המכיל מדיה. סובבו בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח הומוגניזציה נאותה של התערובת ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר יומיים של דגירה, העבירו את המדיה מבקבוק התא HEK293T היצרן לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.צנטריפוגה את הצינור ב-800 x גרם למשך חמש דקות כדי לגלול את כל תאי HEK293T שנותרו. הסר בזהירות את כל הנגיף המכיל סופרנטנט מבלי להפריע לגלולה והעביר אותו לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. ספור וחשב את הנפח הנדרש של תרחיף התאים U937 כדי לקבל כדור של 2 x 10 בחזקת שישה תאים.לאחר מכן צנטריפוגה של תרחיף התא בשפופרת של 15 מיליליטר ב-400 x גרם למשך 10 דקות ושפכו את הסופרנטנט, והשאירו את כדור התא בצינור. השעו מחדש את כדור התא בנגיף המכיל סופרנטנט וצנטריפוגה את הצינור ב-290 x גרם למשך 60 דקות. לאחר צנטריפוגה, השתמש בפיפטה כדי להשעות מחדש את הגלולה עם הנגיף המכיל סופרנטנט בצינורית.הנח את הצינור על מסובב קצה מעל קצה למשך 60 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה של הצינור ב-400 x גרם למשך 10 דקות והשעיית הגלולה ביחס של 1:1 של הנגיף המכיל סופרנטנטים ומדיה מלאה של RPMI 1640, בתוספת FBS מושבת חום של 10%. מעבירים את תערובת התאים לבקבוק תרבית רקמה T25 חדש ומודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.לאחר הדגירה, צנטריפוגה את תאי U937 ב-400 x גרם למשך 10 דקות והוציאו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה עם מדיה מלאה של RPMI 1640, בתוספת FBS מושבת חום של 10% וחמישה מיקרוגרם למיליליטר של פורומיצין. העבירו את תרבית התאים לבקבוק T25.דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבועיים-שלושה, ובדקו את התאים כל יום עד יומיים לאיתור סימני גדילה. ניתוח כתמים מערביים אישר את אובדן ביטוי חלבון RIP1 בתאי מוטציה RIP1 CRISPR ללא אות הניתן לזיהוי בהשוואה לאות החזק בתאי ביקורת מסוג בר ולא מטרה. הטיפול ב-TCZ גרם למוות משמעותי של תאים נקרופטוטיים בתאי ביקורת מסוג בר ולא מטרה, אשר התהפך על ידי טיפול בנקרוסטטין-1.לעומת זאת, תאי נוקאאוט RIP1 CRISPR הראו מוות תאי נמוך משמעותית בהשוואה לתאי ביקורת מסוג פרא ולא מטרה ללא השפעה של נקרוסטטין-1, מה שמעיד על אובדן תפקוד RIP1. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים הראתה עלייה משמעותית בייצור סופראוקסיד מיטוכונדריאלי בתאי ביקורת מסוג פרא ולא מטרה לאחר טיפול ב-TCZ, אשר הופחת עם הטיפול בנקרוסטטין-1. תאי נוקאאוט RIP1 CRISPR הראו ייצור מינימלי של סופראוקסיד מיטוכונדריאלי ללא השפעה ניכרת של טיפול בנקרוסטטין-1.

generation-rip1-knockout-u937-cell-line-using-crispr-cas9

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

CRISPR/Cas9 היא מערכת חזקה ליצירת שיבוש של גנים ואלמנטים גנטיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירה יעילה של מחיקות גנומיות בשורות תאים של יונקים באמצעות CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

כלי עריכת גנום כגון מערכת CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) שיפרו מאוד את יעילות מיקוד הגנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs). כתב יד זה מתאר פרוטוקול ליצירת מדווח hiPSC ספציפי לשושלת באמצעות רקומבינציה הומולוגית בסיוע מערכת CRISPR/Cas.

דור יעיל של כתבים במכות ספציפיים Lineage hiPSC עצבי באמצעות CRISPR / Cas9 ומערכת Nickase זוגי Cas9

ההתקדמות האחרונות ביכולת לתמרן גנטית קווי תאים סומטיים להחזיק פוטנציאל גדול עבור מחקר בסיסי ויישומי. כאן, אנו מציגים שתי גישות עבור CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוט הייצור והקרנה שורות תאים יונקים, עם וללא שימוש סמנים לבחירה.

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שינוי גנטי ראשי או מורחב האנושי הטבעיים (NK) תאים הרוצח באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). באמצעות פרוטוקול זה, אנו להפיק תאי NK אדם חסר צורה של קולטן גורם גדילה – b 2 (TGFBR2), hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את ההליכים הטכניים ליצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לרקמת שומן חומה (BAT) הממנפים מערכת משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו- ADENO-associated virus (AAV) Single Guide RNA (sgRNA). השלבים המתוארים כוללים את התכנון של sgRNAs, הכנת חלקיקי AAV-sgRNA, ואת microinjection של AAV לתוך אונות BAT.

יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות מערכת RNA חד-מנחה משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-Adeno-Associated Virus

מאמר זה מדווח על בניית תאי נוקאאוט הקשורים לצנטרומר לחלבון-E (CENP-E) באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 ושלוש אסטרטגיות סינון מבוססות פנוטיפ. השתמשנו בקו תאי הנוקאאוט של CENP-E כדי לבסס גישה חדשנית לאימות הספציפיות והרעילות של מעכבי CENP-E, שהיא שימושית לפיתוח תרופות ולמחקר ביולוגי.

יצירת Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

קו התאים THP-1 נמצא בשימוש נרחב כמודל לחקירת התפקודים של מונוציטים/מקרופאגים אנושיים בתחומי מחקר שונים הקשורים לביולוגיה. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הנדסה יעילה מבוססת CRISPR-Cas9 ובידוד שיבוטים של תא יחיד, המאפשר ייצור של נתונים פנוטיפיים חסונים וניתנים לשחזור.

נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

למדו כיצד ליצור קו תאים U937 עם knockout ל-RIP1 באמצעות CRISPR-Cas9. שיטה זו מאפשרת חקירת תפקיד RIPK1 במסלולי תקשורת תאית וביולוגיה של התא.

יצירת קו תאים RIP1 Knockout U937 באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

גלה סרטונים נוספים