יצירת קו תאים RIP1 Knockout U937 באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

המחקר שלנו מתמקד במוות תאי יונקים, ובמיוחד בחקר האיזון בין אפופטוזיס לנקרופטוזיס בהקשר של היפרגליקמיה. לאחרונה, הוכח כי חלבון המוות התאי RIP1 קינאז מווסת את ביטוי הגנים במהלך נקרופטוזיס. האתגר הניסויי הנוכחי שלנו הוא מניפולציה גנטית של תאים חיסוניים הגדלים בתרחיף, במיוחד חיסול הגן ל-RIP1 קינאז באמצעות CRISPR-Cas9.

הפרוטוקול שלנו מציע שני יתרונות ברורים. זה משפר את שיטות הטרנספקציה עבור תאים חיסוניים הגדלים בתרחיף על ידי שימוש ב-lentivirus, וזה מבטל את הצורך בשיבוט תא בודד במהלך תהליך יצירת נוקאאוט גנטי באמצעות CRISPR-Cas9, התוצאות שלנו סללו את הדרך לחקר תפקידו של RIP1 קינאז בשינוי ההיפרגליקמי בנקרופטוזיס. כדי להתחיל פס רבעוני, Escherichia coli המכיל את הווקטור הלנטי-ויראלי מנחה את ה-RNA על לוחות אגר לוריא-ברטאני או LB בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.

דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים עד שמושבות בודדות נראות באזור המדולל ביותר בצלחת. לאחר הדגירה, בעזרת לולאה סטרילית, בחר מושבה בודדת והוסף אותה לחמישה מיליליטר מרק LB, בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. אוורור והדביקו את מכסה הצינור.

דגרו את הצינור בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד למשך שמונה שעות. בינתיים, הוסיפו 40 מיליליטר מרק LB, בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין לארבעה צינורות של 50 מיליליטר. לאחר הדגירה, העבירו 40 מיקרוליטר מהתרבות הגדלה לכל אחד מארבעת הצינורות.

אוורור והדביק את מכסי הצינורות לפני הדגירה שלהם בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד למשך 12 עד 16 שעות. למחרת, צנטריפוגה את התרבויות ב -3, 220 x גרם ברוטור דלי מתנדנד למשך 20 דקות. שפכו את הסופרנטנטים לכוס פסולת ושלבו את כל ארבעת הכדורים ל-10 מיליליטר מרק LB, בתוספת אמפיצילין.

צנטריפוגה של הכדורים המשולבים במהירות מקסימלית ברוטור דלי מתנדנד למשך 20 דקות כדי להשיג כדור בודד ולהשליך כמה שיותר מהסופרנטנטים לכוס הפסולת. זרע HEK293T תאים בריכוז של שלוש עד חמש פעמים 10 בחזקת שישה תאים לבקבוק T25 המכיל DMEM. דגרו את הבקבוק למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

בינתיים, הכינו את תערובת הטרנספקציה באמצעות יחס של 1:1:1:1 של פלסמידים ויחס של 3:1 של מגיב טרנספקציה ל-DNA פלסמיד עם מדיום סרום מופחת. מערבבים 75 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה, 2, 500 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ו-25 מיקרוגרם של DNA פלסמיד כולל. הניחו לתערובת לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות.

לאחר מכן, פיפטה בזהירות את תערובת הטרנספקציה על תאי HEK293T המשולבים בבקבוק המכיל מדיה. סובבו בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח הומוגניזציה נאותה של התערובת ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר יומיים של דגירה, העבירו את המדיה מבקבוק התא HEK293T היצרן לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה את הצינור ב-800 x גרם למשך חמש דקות כדי לגלול את כל תאי HEK293T שנותרו. הסר בזהירות את כל הנגיף המכיל סופרנטנט מבלי להפריע לגלולה והעביר אותו לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר. ספור וחשב את הנפח הנדרש של תרחיף התאים U937 כדי לקבל כדור של 2 x 10 בחזקת שישה תאים.

לאחר מכן צנטריפוגה של תרחיף התא בשפופרת של 15 מיליליטר ב-400 x גרם למשך 10 דקות ושפכו את הסופרנטנט, והשאירו את כדור התא בצינור. השעו מחדש את כדור התא בנגיף המכיל סופרנטנט וצנטריפוגה את הצינור ב-290 x גרם למשך 60 דקות. לאחר צנטריפוגה, השתמש בפיפטה כדי להשעות מחדש את הגלולה עם הנגיף המכיל סופרנטנט בצינורית.

הנח את הצינור על מסובב קצה מעל קצה למשך 60 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה של הצינור ב-400 x גרם למשך 10 דקות והשעיית הגלולה ביחס של 1:1 של הנגיף המכיל סופרנטנטים ומדיה מלאה של RPMI 1640, בתוספת FBS מושבת חום של 10%. מעבירים את תערובת התאים לבקבוק תרבית רקמה T25 חדש ומודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את תאי U937 ב-400 x גרם למשך 10 דקות והוציאו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה עם מדיה מלאה של RPMI 1640, בתוספת FBS מושבת חום של 10% וחמישה מיקרוגרם למיליליטר של פורומיצין. העבירו את תרבית התאים לבקבוק T25.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבועיים-שלושה, ובדקו את התאים כל יום עד יומיים לאיתור סימני גדילה. ניתוח כתמים מערביים אישר את אובדן ביטוי חלבון RIP1 בתאי מוטציה RIP1 CRISPR ללא אות הניתן לזיהוי בהשוואה לאות החזק בתאי ביקורת מסוג בר ולא מטרה. הטיפול ב-TCZ גרם למוות משמעותי של תאים נקרופטוטיים בתאי ביקורת מסוג בר ולא מטרה, אשר התהפך על ידי טיפול בנקרוסטטין-1.

לעומת זאת, תאי נוקאאוט RIP1 CRISPR הראו מוות תאי נמוך משמעותית בהשוואה לתאי ביקורת מסוג פרא ולא מטרה ללא השפעה של נקרוסטטין-1, מה שמעיד על אובדן תפקוד RIP1. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים הראתה עלייה משמעותית בייצור סופראוקסיד מיטוכונדריאלי בתאי ביקורת מסוג פרא ולא מטרה לאחר טיפול ב-TCZ, אשר הופחת עם הטיפול בנקרוסטטין-1. תאי נוקאאוט RIP1 CRISPR הראו ייצור מינימלי של סופראוקסיד מיטוכונדריאלי ללא השפעה ניכרת של טיפול בנקרוסטטין-1.