Name: שימוש בצבעים זולים כדי להמחיש הצטברות גליקוגן ושלמות המעי ב - Caenorhabditis elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: למדו שני מבחנים זולים ופשוטים ב-Caenorhabditis elegans להדגמת מטבוליזם של פחמימות ותהליכי הזדקנות. השיטות משתמשות בצביעת יוד וצבע כחול להערכת גליקוגן ושלמות המעי בנמטודות שקופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הערה: ניתן להשיג חיידקי Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) וזני בר מסוג Bristol N2 מ-CGC, אוניברסיטת מינסוטה, ארה"ב או מתרומה ממעבדת C. elegans . למען בטיחות החוקרים, חובה להשתמש בציוד מגן אישי. למרות שהריכוזים של ריאגנטים כמו היפוכלוריט ונתרן הידרוקסידי נמוכים, חיוני ללבוש את ה- PPE המומלץ, כפי שמודגש בכתב היד, כדי למזער את כל הסיכונים הפוטנציאליים הקשורים לכימיקלים אלה.
1. תכולת הגליקוגן
<ol><li>הכנת לוחיות בדיקה<ol><li>הכינו שש פלטות אגר NGM בגודל 60 מ"מ x 15 מ"מ20 (10 מ"ל של אגר מדיה לגידול נמטודות, NGM, כמתואר בטבלה משלימה 1) לכל זן תולעת ואפשרו להן להתייבש במשך יום אחד בטמפרטורת החדר. שמור את הצלחות סגורות כדי למנוע זיהום.</li>
		<li>הוסף 200 μL של תרבית נוזלית E. coli OP50 (עם צפיפות אופטית = 0.600, בערך באורך גל של 600 ננומטר) לכל צלחת כדי לחסן בסך הכל ארבעה לוחות NGM בגודל 60 מ"מ x 15 מ"מ לכל זן במכסה המנוע של הזרימה. יש לדגור על הצלחות הסגורות בטמפרטורה של 37°C למשך יום אחד לפני השימוש. הערה: הכינו שש צלחות (שלב 1.1) אך חסנו רק 4 בחיידקי E. coli OP50. שמרו את שתי הצלחות הנותרות בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר בעת הנחת התולעים בתנאי רעב. ניתוח זה עשוי להתבצע כפול.</li>
		<li>ביום הבדיקה, הוסף 200 μL של 0.025 M D-גלוקוז לשתי (6 מ"מ x 15 מ"מ) צלחות אגר NGM לכל זן שנזרעו בעבר עם חיידקי E. coli OP50. הניחו לצלחות להתייבש בטמפרטורת החדר במכסה המנוע. הערה: ניתן גם לייבש את צלחות האגר NGM המכילות חיידקי E. coli OP50 בסמוך למנורות אלכוהול כחלופה לשימוש במכסה מנוע.</li>
	</ol></li>
	<li>סנכרון<ol><li>כ-3 ימים לפני הסנכרון, מעבירים 3-4 גושים (3X3 ס"מ) מאגר NGM תחזוקה עם C. elegans Bristol N2 (סוג בר) בשלבים שונים (כ-500 תולעים לכל נתח) לצלחת חדשה (150 מ"מ x 90 מ"מ) שנזרעה בעבר עם חיידקי E. coli OP50.</li>
		<li>מניחים את הצלחת החדשה עם התולעים בסביבה מבוקרת בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ושומרים על לחות &gt;95% למשך 3 ימים (72 שעות מאפשרות לרוב התולעים להגיע לשלב הבוגר הגרביד). הערה: ייתכן שיהיה צורך לכוונן את טמפרטורת הגידול בהתאם לזני C. elegans הנמצאים בשימוש.</li>
		<li>באמצעות פיפטה פסטר, לאסוף את התולעים מן הצלחת מוכן עם מזוקק H2O ולהעביר אותם צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.</li>
		<li>המתן לשקיעת התולעים על ידי כוח הכבידה (כ -15 דקות) ולאחר מכן להסיר את supernatant. חזור על תהליך זה 3x כדי לחסל את החיידקים. לאחר הכביסה האחרונה, להפחית את נפח ל 5 מ"ל.</li>
		<li>מוסיפים 10 מ"ל של תמיסת הלבנה (טבלה משלימה 1) ומנערים נמרצות בעזרת הידיים במשך כ-6 דקות.</li>
		<li>מיד לאחר השלמת הרעידה, מלא את הצינורות לקיבולת של 50 מ"ל עם מאגר M9.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 1400 x גרם במשך 3 דקות, להסיר את supernatant עד 5 מ"ל ולאחר מכן להוסיף 45 מ"ל של חיץ M9 שוב. חזור על תהליך זה 4x.</li>
		<li>לאחר השטיפה האחרונה, הפחיתו את הנפח ל-15 מ"ל ושמרו עליו בטמפרטורה מבוקרת (20°C) ובלחות (&gt;95%) למשך כ-14 שעות. הערה: ניתן להחליף את תהליך הסנכרון על ידי קבלת ביציות באמצעות ביציות: העבירו כ-20 תולעים הרות בוגרות לצלחת NGM (6 מ"מ x 15 מ"מ) שנזרעה בעבר עם 200 μL של E. coli OP50. אפשר לתולעים להטיל ביצים במשך יום אחד. לאחר מכן, להסיר את התולעים ההרות ולחכות ביצים לבקוע.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת תולעים<ol><li>באמצעות פיפטה אוטומטית להוסיף 10 μL של התולעים המסונכרנות (שלב 1.2.8) לשקופית מיקרוסקופ ולספור את מספר התולעים. חשב כמה נפח צריך להיות pipeted כדי לקבל 500-1000 תולעים / μL.</li>
		<li>מעבירים 500-1000 תולעים מסונכרנות L1 (שלב 1.2.8) לצלחות אגר NGM (150 מ"מ x 90 מ"מ, טבלה משלימה 1) שנזרעו עם חיידקי E. coli OP50 כמקור מזון, עד שהם מגיעים לשלב 4 (L4) של הזחלים ב-20°C. הערה: ניתן להעביר תולעים באמצעות פיפטה אוטומטית. אם פיפטה אוטומטית אינה זמינה, השתמש בפיפטת פסטר זכוכית, וניתן לשלוט בנפחים באמצעות תוויות מיקרו-צינור או פיפטות מדורגות זכוכית.</li>
		<li>לאחר 48 שעות של סנכרון20: אספו את זחלי L4 מהלוחות בעזרת חיץ M9 (טבלה משלימה 1), בעזרת פיפטת פסטר מפלסטיק לצינור חרוטי נקי 50 מ"ל ושטפו אותם 3x עם חיץ M9 טרי או חזרו על השטיפות עד שכל חיידקי E. coli OP50 הנותרים יוסרו לחלוטין (בטמפרטורת החדר). הערה: שלב הכביסה חשוב מכיוון שתולעים מסוימות יחוו רעב במהלך ההליך.</li>
	</ol></li>
	<li>הפעלת הבדיקה<ol><li>העבר 500-1000 תולעי L4 (שלב 1.3.1) מכל אחד מלוחות אגר NGM החדשים (60 מ"מ x 15 מ"מ) שהוכנו בעבר (שלבים 1.1.2 ו- 1.1.3). שמור אותם ב 20 ° C במשך 48 שעות עד יום הבדיקה. לוח זמנים זה יביא לשלוש קבוצות ניסוי כדלקמן, בכפילות (איור 1): A- (רעב): תולעים יגדלו על צלחות אגר NGM רגילות ללא חיידקי E. coli OP50; B- (רגיל): תולעים יגדלו על צלחות אגר NGM רגילות שנזרעו עם חיידקי E. coli OP50; C- (גלוקוז גבוה): תולעים יגדלו על צלחות אגר NGM שנזרעו עם חיידקי E. coli OP50 ומכילים 0.025 M D-גלוקוז.</li>
		<li>ביום הבדיקה (לאחר 48 שעות): אספו את התולעים ובצעו שלוש שטיפות קצרות במאגר M9 (שלבים 1.2.2 ו-1.2.3) הערה: כאן, הכינו צלחות אגר NGM בתוספת D-גלוקוז (שלב 1.3) והניחו אותן בצד עד שהגיע הזמן להוסיף את התולעים.<ol><li>צביעת יוד: הכינו תמיסת יוד 5% (v/v) של לוגול (תמיסת יוד/אשלגן יודי) באמצעות חיץ M9 טרי. הערה: ניתן להשיג את תמיסת היוד של לוגול מספקי ריאגנטים מקומיים או מבתי מרקחת, ולכן הריכוז הראשוני עשוי להשתנות. במידת הצורך, חשב כדי לקבל פתרון של 5% (v/v).</li>
		</ol></li>
		<li>העבירו כ-100 מיקרוליטר של תולעים שטופות (שלב 4.2) מכל קבוצה למיקרו-צינור בנפח 1.5 מ"ל המכיל תמיסת לוגול מדוללת (5% v/v). שימוש בפיפט אוטומטי ביחס של 1:5 מעביר 100 מיקרוליטר תולעים ל-400 מיקרוליטר תמיסת לוגול, ולאחר מכן תסיסה עדינה במיקסר למשך 5 דקות. הערה: אם מיקסר אינו זמין, ניתן לנער את המיקרו-צינורות בזהירות בידיים.</li>
		<li>מיד לאחר 5 דקות אלה, צנטריפוגו את microtube 1.5 מ"ל (תולעים + תמיסת Lugol) ב 1400 x גרם במשך 3 דקות. הערה: אם בדיקה זו מבוצעת על תולעים משלב L4 ואילך, ניתן להשיג שקיעת כבידה במקום להשתמש בצנטריפוגה. השאירו את המיקרו-צינוריות פתוחות במתלים על הספסל למשך 10 דקות עד שכל התולעים התיישבו בתחתית המיקרו-צינור.</li>
		<li>הסר את supernatant ולשטוף את התולעים עם 1.0 מ"ל של חיץ M9 טרי. חזור על הכביסה עד שכל שאריות היוד יוסרו מהתמיסה (מינימום 3x).</li>
		<li>לאחר שלב השטיפה האחרון, הסירו את הסופרנאטנט למעט שאריות של כ-100 מיקרוליטר. השתמשו בו כדי להשהות מחדש בעדינות את התולעים ולאנליזה מיקרוסקופית.</li>
		<li>מעבירים כ-50 מיקרוליטר מתמיסת התולעת המרחפת לשקופיות מיקרוסקופיה ומכסים אותן בפתקי כיסוי. התבונן בתמונות השדה הבהיר באמצעות סטריאומיקרוסקופ (פי 1.5). הערה: אם סטריאומיקרוסקופ אינו זמין, ניתן להשתמש במיקרוסקופ רגיל, וניתן לצלם תמונות באמצעות מצלמת טלפון סלולרי (ברזולוציה של 3.4x) באמצעות מתאם. כדי למנוע שגיאות של אור/בהירות/חשיפה, חיוני שכל הגדרות המצלמה בטלפון הסלולרי יישארו עקביות עבור כל התמונות.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת נתונים<ol><li>נתונים כמותיים: חישוב תכולת הגליקוגן בהתבסס על צביעת יוד של תולעים.<ol><li>שמור תמונות מסטריאומיקרוסקופ המכיל לפחות 10 תולעים לכל קבוצה כקובץ .jpeg לעיבוד נוסף. הורד את תוכנת ImageJ בחינם כדי לעשות זאת. הפרטים מופיעים בקובץ משלים 1, תרשים משלים 1, תרשים משלים 2.</li>
			<li>פתח את תמונת .jpeg באמצעות תוכנת ImageJ (אותה ניתן להוריד בחינם https://imagej.nih.gov/ij/download.html). לחץ על קו מקוטע ומתאר את התולעת (תולעת אחת בכל פעם). לחץ על נתח ולאחר מכן בחר מדידה כדי לקבל את כימות הכתם. הנתונים יוצגו כממוצע בטבלה. ממוצע מציין את הנתונים המחושבים מצפיפות הצביעה לכל אזור תולעת.</li>
		</ol></li>
		<li>נתונים איכותיים: קבל תמונות מהסטריאומיקרוסקופ של כל קבוצה והשווה חזותית את צביעת התולעים. צור מערכת ניקוד, במידת הצורך, כדי לנתח את הצביעה: 0 חסר צבע; 1 מוכתם קלות; 2 מוכתמים ו-3 מוכתמים בכבדות. באמצעות הסטריאומיקרוסקופ, ספור ידנית כ -10 תולעים לכל קבוצה (מינימום) עם מונה יד.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig01.jpg"> איור 1: סכמת תכולת הגליקוגן הכוללת ב-C. elegans. סכמטי של הניסוי שבוצע כאן לביצוע בדיקת תכולת הגליקוגן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. הערכת חדירות המעי
<ol><li>הכנת תולעים<ol><li>כ-14 שעות לאחר הסנכרון (שלב 1.2.8), העבירו 500-1000 תולעים (שלב 1.3.1 ו-NOTE) בשלב הזחל הראשון (L1) לכל צלחת אגר NGM חדשה (60 מ"מ x 15 מ"מ) שהוכנה קודם לכן ושמרו אותן בטמפרטורה של 20°C עד ליום הבדיקה. לוח זמנים זה יוביל לשתי קבוצות ניסוי כדלקמן (איור 2): A- (צעיר): תולעים יגדלו על צלחות אגר NGM שנזרעו עם החיידק E. coli OP50 עד שלב הזחל 4 (L4); B- (ישן): התולעים יגדלו על צלחות אגר NGM שנזרעו עם החיידק E. coli OP50 עד היוםהשביעי לבגרות. הערה: יש לשטוף את התולעים המוחזקות עד היוםהשביעי לבגרות עם חיץ M9 מדי יום ולהעבירן לצלחות אגר NGM חדשות (60 מ"מ x 15 מ"מ) עם 200 μL של חיידקי E. coli OP50 שנזרעו בעבר לצורך החלפת מזון והסרת הצאצאים. תולעים צעירות יותר צפות במהלך הקנטה, וניתן להפריד ביניהן על ידי הסרת סופרנטנט. שיעור תולעי הדרדסים עולה עם הגיל. עם זאת, הערכה של חדירות המעי יכולה להתבצע בכל שלב וגיל, בהתאם למטרת המחקר.</li>
	</ol></li>
	<li>הפעלת הבדיקה<ol><li>ביום הבדיקה, אספו תולעי L4 (יומיים לאחר שלב 2.1.1) ותולעי בגרות ביוםהשביעי (כעת ביוםהתשיעי לחייהם) עם חיץ M9 (טבלה משלימה 1) והעבירו למיקרו-צינוריות מסומנות של 1.5 מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 1400 x גרם במשך 3 דקות, להסיר את supernatant, להוסיף 1.0 מ"ל של M9, ומערבבים בעדינות. חזור על תהליך זה 3x כדי להסיר את החיידקים. לאחר הכביסה האחרונה, להפחית את נפח ל 500 μL.</li>
		<li>באמצעות פיפטה אוטומטית, להוסיף 10 μL של משקעי התולעת לשקופית מיקרוסקופ ולספור את מספר התולעים. חשב את נפח להיות pipeted כדי לקבל 100 תולעים/μL.</li>
		<li>צביעת דרדסים: הכינו תמיסת מלח דיסודיום אריוגלאוצין 25% (טבלה משלימה 1) במים מזוקקים. במידת הצורך, השתמש במערבולת למסיסות טובה יותר.</li>
		<li>במיקרו-צינוריות חדשות שזוהו בעבר, באמצעות פיפטה אוטומטית, הוסף את הנפח המכיל 100 תולעים, 100 μL של תמיסת מלח דיסודיום אריוגלאוצין 25%, 200 μL של E. coli OP50 והשלם עם חיץ M9 לנפח סופי של 500 μL. הערה: הכרכים של Erioglaucine disodium, E. coli ומספר התולעים קבועים. נפח מאגר M9 משתנה וניתן להשתמש בו כדי להביא את הנפח הסופי ל -500 μL.</li>
		<li>דוגרים במשך 3 שעות עם תסיסה במיקסר, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר. הערה: אם מיקסר אינו זמין, נערו את המיקרו-צינוריות בזהירות עם הידיים כל 15 דקות.</li>
		<li>לאחר 3 שעות, צנטריפוגו את מיקרו-צינור 1.5 מ"ל ב 1400 x גרם למשך 3 דקות. הסר 1.0 מ"ל של supernatant ושטוף את התולעים עם 1.0 מ"ל של חיץ M9.</li>
		<li>יש לחזור על השטיפות עד להסרת תמיסת מלח הדיסודיום אריוגלאוצין הנותרת מהתמיסה. לאחר שלב השטיפה האחרון, הסירו את הסופרנאטנט למעט שאריות של כ-250 מיקרוליטר. השתמשו בו כדי להשהות מחדש בזהירות תולעים ולעבד אותן לניתוח מיקרוסקופי.</li>
		<li>העבירו כ-50 תולעים של תמיסת תולעת תלויה לשקופיות מיקרוסקופיה וכסו אותן בפתקי כיסוי. דוגרים על שקופיות המיקרוסקופ במקרר בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לשתק את התולעים. הערה: חלופה נוספת לשיתוק התולעים היא להוסיף 10 μL של תמיסת הידרוכלוריד Levamisole (10 mM ; טבלה משלימה 1) וכסו אותם בפתקי כיסוי.</li>
		<li>התבוננו וספרו את המספר הכולל של התולעים והתולעים הצבועות לחלוטין באמצעות השדה הבהיר במיקרוסקופ סטריאוסקופי (פי 1.5). ניתן לקבל תמונות ממצלמת טלפון סלולרי (ב 3.4x) יחד עם מתאם. כדי למנוע שגיאות של אור/בהירות/חשיפה, חיוני שכל הגדרות המצלמה בטלפון הסלולרי יישארו עקביות עבור כל התמונות.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת נתונים<ol><li>נתונים איכותיים: קבל תמונות מסטריאומיקרוסקופ של כל קבוצה (L4ויום 7 לבגרות) והשווה חזותית את צביעת התולעים.</li>
		<li>ספרו את המספר הכולל של התולעים ואת מספר תולעי הדרדסים (תולעים כחולות) באמצעות סטריאומיקרוסקופ.</li>
		<li>ביטוי לתוצאות כאחוז תולעי הדרדסים על ידי השוואת התולעים הצעירות (L4, כקבוצת ביקורת) והתולעים הזקנות(היום השביעי לבגרות): A x X = 100 (%) x B X = 100 x B / A כאשר, A = המספר הכולל של תולעים B = מספר תולעי הדרדסים</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig02.jpg"> איור 2: סכמת בדיקת חדירות מעיים כוללת ב- C. elegans. (א) הכנת ג. אלגנס . (B) צביעה במלח דיסודיום אריוגלאוצין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת חילוף החומרים ודפוס ההזדקנות ב - Caenorhabditis elegans

<ol><li>Thorp, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChatGPT+is+fun%2C+but+not+an+author%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ChatGPT is fun, but not an author.</a> Science. 379 (6630), 313(2023).</li>
<li>Lemons, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inquiry-based+approach+to+study+the+synapse%3A+Student-driven+experiments+using+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+J+Undergrad+Neurosci+Educ%22%5BJournal%5D)">An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C.</a> elegans. J Undergrad Neurosci Educ. 15 (1), A44-A55 (2016).</li>
<li>Andersen, J., Krichevsky, A., Leheste, J. R., Moloney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+an+undergraduate+educational+tool+for+teaching+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as an undergraduate educational tool for teaching RNAi.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (6), 417-427 (2008).</li>
<li>Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+catch+a+smurf%3F+-+Ageing+and+beyond...+In+vivo+assessment+of+intestinal+permeability+in+multiple+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">How to catch a smurf? - Ageing and beyond... In vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms.</a> Bio Protoc. 8 (3), e2722(2018).</li>
<li>Ellingwood, S. S., Cheng, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+clinical+aspects+of+glycogen+storage+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and clinical aspects of glycogen storage diseases.</a> J Endocrinol. 238 (3), R131-R141 (2018).</li>
<li>Cori, C. F., Cori, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+formation+in+the+liver+from+d-and+l-lactic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Glycogen formation in the liver from d-and l-lactic acid.</a> J Bio Chem. 81 (2), 389-403 (1929).</li>
<li>Wosilait, W. D., Sutherland, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+epinephrine+and+glucagon+to+liver+phosphorylase.+II.+Enzymatic+inactivation+of+liver+phosphorylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The relationship of epinephrine and glucagon to liver phosphorylase. II. Enzymatic inactivation of liver phosphorylase.</a> J Biol Chem. 218 (1), 469-481 (1956).</li>
<li>Zhang, H., Ma, J., Tang, K., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+energy+storage%3A+roles+of+glycogen+metabolism+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Beyond energy storage: roles of glycogen metabolism in health and disease.</a> FEBS J. 288 (12), 3772-3783 (2021).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glycogen+molecular+structure+in+the+worm+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Characterization of glycogen molecular structure in the worm Caenorhabditis elegans.</a> Carbohydr Polym. 237, 116181(2020).</li>
<li>Cherkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+mapping+and+assessment+of+glycogen+in+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.Analyst%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular mapping and assessment of glycogen in C.</a> elegans.Analyst. 144 (7), 2367-2374 (2019).</li>
<li>Gusarov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+controls+Caenorhabditis+elegans+lifespan+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Glycogen controls Caenorhabditis elegans lifespan and resistance to oxidative stress.</a> Nat Commun. 8, 15868(2017).</li>
<li>Seo, Y., Kingsley, S., Walker, G., Mondoux, M. A., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+shift+from+glycogen+to+trehalose+promotes+lifespan+and+healthspan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Metabolic shift from glycogen to trehalose promotes lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (12), E2791-E2800 (2018).</li>
<li>Frazier, H. N. 3rd, Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+sugar+provisioning+controls+survival+of+C.+elegans+embryos+in+adverse+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive sugar provisioning controls survival of C. elegans embryos in adverse environments.</a> Curr Biol. 19 (10), 859-863 (2009).</li>
<li>da Silva, F. N., Zimath, P. L., do Amaral, T. A., Martins, J. R. N., Rafacho, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coadministration+of+olanzapine+causes+minor+impacts+on+the+diabetogenic+outcomes+induced+by+dexamethasone+treatment+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Coadministration of olanzapine causes minor impacts on the diabetogenic outcomes induced by dexamethasone treatment in rats.</a> Life Sci. 322, 121660(2023).</li>
<li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+at+the+crossroad+of+stress+resistance%2C+energy+maintenance%2C+and+pathophysiology+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Glycogen at the crossroad of stress resistance, energy maintenance, and pathophysiology of aging.</a> Bioessays. 40 (9), e1800033(2018).</li>
<li>Untersmayr, E., Brandt, A., Koidl, L., Bergheim, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier+dysfunction+as+driving+factor+of+inflammaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier dysfunction as driving factor of inflammaging.</a> Nutrients. 14 (5), 949(2022).</li>
<li>Lin, P. Y., Stern, A., Peng, H. H., Chen, J. H., Yang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+and+metabolic+regulation+of+intestinal+barrier+function+and+associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Redox and metabolic regulation of intestinal barrier function and associated disorders.</a> Int J Mol Sci. 23 (22), 14463(2022).</li>
<li>Dambroise, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+phases+of+aging+separated+by+the+Smurf+transition+as+a+public+path+to+death%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two phases of aging separated by the Smurf transition as a public path to death.</a> Sci Rep. 6, 23523(2016).</li>
<li>Laranjeiro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swim+exercise+in+Caenorhabditis+elegans+extends+neuromuscular+and+gut+healthspan%2C+enhances+learning+ability%2C+and+protects+against+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Swim exercise in Caenorhabditis elegans extends neuromuscular and gut healthspan, enhances learning ability, and protects against neurodegeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (47), 23829-23839 (2019).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C.</a> elegans.WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>McGhee, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The C. elegans intestine.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2007).</li>
<li>McGee, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+intestinal+nuclei+and+intestinal+integrity+in+aging+C%5BTitle%5D)+AND+%22elegans.+Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of intestinal nuclei and intestinal integrity in aging C.</a> elegans. Aging Cell. 10 (4), 699-710 (2011).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS genetics. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Rera, M., Clark, R. I., Walker, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+links+metabolic+and+inflammatory+markers+of+aging+to+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (52), 21528-21533 (2012).</li>
<li>Zhang, G., Gu, Y., Dai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+bilberry+anthocyanin+extracts+on+dextran+sulfate+sodium-induced+intestinal+damage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Protective effect of bilberry anthocyanin extracts on dextran sulfate sodium-induced intestinal damage in Drosophila melanogaster.</a> Nutrients. 14 (14), 2875(2022).</li>
<li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genet. 12 (7), e1006135(2016).</li>
<li>Qu, M., Xu, K., Li, Y., Wong, G., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+acs-22+mutant+Caenorhabditis+elegans+to+detect+the+toxicity+of+nanopolystyrene+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Using acs-22 mutant Caenorhabditis elegans to detect the toxicity of nanopolystyrene particles.</a> Sci Total Environ. 643, 119-126 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו-צינורות&nbsp;</td><td>ספקים מקומיים-חממת</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>37 מעלות</td><td>KS 4000i&nbsp;</td><td>97014-816</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 50 מ"ל</td><td>ספקים מקומיים-6</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ס"מ צלחות פטרי&nbsp;</td><td>ספקים מקומיים-אגר</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>בקטריולוגי</td><td>Din&acirc; נציץ Qu&iacute; נציץ עכשווי; ניאה בע"מ</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans בריסטול N2 (סוג פראי)</td><td>המרכז הגנטי Caenorhabditis elegans (CGC, מינסוטה, ארה"ב)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>CaCL2</td><td>Din&acirc; נציץ Qu&iacute; נציץ עכשווי; ניאה בע"מ</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>סיגמא-אולדריץ' ברזיל בע"מ</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז נטול מים&nbsp;</td><td>ניאון</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>מזוקק H2O</td><td>ספקים</td> <td>מקומיים-מלח</td><td></td></tr> <tr><td>דיסודיום Erioglaucine</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>3844-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabditis elegans המרכז הגנטי (CGC, מינסוטה, ארה"ב)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Flow Hood</td><td>Mylabor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>חברת Panasonic Healthcare של צפון אמריקה, MIR-254-PA.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Din&acirc; נציץ Qu&iacute; נציץ עכשווי; ניאה בע"מ</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole hydrochloride</td><td>RIPERCOL L 150F-Lugol</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>solution</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>L6146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Synth</td><td>S1063-01-AH</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מיקרוצנטריפוגה</td><td>5425R Eppendorf SE, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Din&acirc; נציץ Qu&iacute; נציץ עכשווי; ניאה בע"מ</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Din&acirc; נציץ Qu&iacute; נציץ עכשווי; ניאה בע"מ</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma-Aldrich Brasil Ltda</td><td>N6261</td><td></td></tr><tr><td>פפטון בקטריולוגי</td> <td>וסביבתי; xodo cient&iacute; fica</td><td>91079-38-8</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica S8 Apo סטריאומיקרוסקופ (S&atilde; o פאולו, ברזיל)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין סולפט</td><td>אסטרפטומקס</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בצבעים זולים כדי להמחיש הצטברות גליקוגן ושלמות המעי ב - caenorhabditis elegans

Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans

בדיקת תכולת הגליקוגן מספקת שיטה חזקה ומהירה לסינון תנאי בדיקה שונים, כגון מחקרים השוואתיים של זנים שונים שעשויים להשפיע על סינתזת הגליקוגן או פירוקו. במחקר זה, תולעי L4 עברו שלושה תנאי בדיקה שונים: צום, האכלה וקבוצות מועשרות בגלוקוז. הבדיקה בוצעה שלוש פעמים, כאשר כל תנאי שוכפל פעמיים בכל בדיקה; תמונה מייצגת מוצגת באיור 3. לאחר כל בדיקה נצפו תולעים מוכתמות בתמיסת יוד של לוגול באמצעות סטריאומיקרוסקופ, ונערכה השוואה איכותית בין הקבוצות לגבי צביעת התולעים. במונחים של תצפית חזותית, תולעים בקבוצת הצום (רעב) הציגו כתם פחות עז בהשוואה לתולעים שניזונו עם E. coli OP50 (רגיל), כמו גם אלה שניזונו עם E. coli OP50 ו- D- גלוקוז (גלוקוז גבוה). בנוסף, התולעים שניזונו מאי-קולי OP50 ו-D-גלוקוז (גלוקוז גבוה) הציגו את הכתמים החזקים ביותר.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig03.jpg"> איור 3: תמונות מייצגות מבדיקת תכולת הגליקוגן. רמות הגליקוגן ב-C. elegans הוערכו באמצעות צביעת יוד. תמונות מיקרוסקופיות מציגות תולעים מייצגות של C. elegans הנתונים (A) לרעב, (B) רגילים או (C) לתנאי גלוקוז גבוהים במשך 48 שעות. התולעים הוכתמו על ידי טבילתן בתמיסה של חיץ יוד/M9 של לוגול (1%) למשך 5 דקות, בהתאם להליך המפורט בשלב 1.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
התוצאות של חדירות המעי מראות את ההבדל בהכתמה של תולעים צעירות (L4) עם מעי שלם ותולעים ישנות (היוםהשביעי לבגרות) עם קרומי מעי פגומים עקב הזדקנות (איור 4). המעי של C. elegans הוא רקמה בעלת חשיבות מרכזית לבריאות, שכן הוא ממלא תפקידים קריטיים בעיכול ובחילוף החומרים ומשמש כמרכז איתות לתגובת לחץ וויסות הזדקנות21. בתולעים צעירות, המעי של C. elegans מהווה מחסום חזק המונע דליפה של תוכן המעי. עם זאת, ככל שתולעים אלה מזדקנות, תפקוד מחסום המעי פוחת והופך רגיש יותר להפרעה עקב פירוק הדרגתי של תאים ומיקרווילי והצטברות חיידקים במעי המזדקן21,22. כאשר C. elegans צעירים בולעים את הצבע Erioglaucine disodium salt, המעי של הנמטודה מוכתם (איור 4A). מצד שני, אפשר לראות שתולעים ישנות הציגו אקסטרווציה של הצבע, שחדרה לכל גוף התולעת, מה שמעיד על נזק לקרום המעי (איור 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66084/66084fig04.jpg"> איור 4: תמונה מייצגת של C. elegans מכתים במלח דיסודיום Erioglaucine. התמונה המיקרוסקופית מראה C. elegans עם מעי שלם (שלב L4) ותולעים עם מעי קרוע (היוםהשביעי לבגרות). התולעים הוכתמו על ידי טבילה בתמיסת מלח דיסודיום אריוגלאוצין 25% למשך 3 שעות, לאחר שלב 2.2.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/66084fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: צילום מסך של ImageJ לבחירת קווי מתאר של C. elegans . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%201_RE.png" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 2: צילום מסך של ImageJ לחישוב ממוצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Figure%202_RE.png" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 1: מתכוני מדיה, חיץ ותרבות. הרכב של מדיות, מאגרים ותרבויות שונות המשמשים בפרוטוקול הנוכחי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: תיאור מפורט של תוכנת ImageJ לכימות תכולת הגליקוגן בתולעים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66084/Supplementary%20File%202_NEW.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

שימוש בצבעים זולים כדי להמחיש הצטברות גליקוגן ושלמות המעי ב - Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a transparent, non-parasitic nematode with a simple biology, which makes it a great tool for biological sciences ...

using-low-cost-dyes-to-visualize-glycogen-accumulation-gut-integrity

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים שיטה לחזות לציפורן ב...

ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

כאן אנו מתארים טכניקה המשמשת לדמיון דנ"א גנומי בנמטודות קבועות ושלמות. הסרטון כולל פרוטוקול לדוגמה לספירת כרומטין בביציות C. elegans לא מופרות.

קיבוע אתנול וצביעת DAPI: שיטה להמחשת DNA ב- C. elegans

אנו מציגים שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות חזקות...

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

שריר שלד הוא חיוני לתנועה, והוא חנות החלבון העיקרית של הגופים. מדידות בריאות שרירים בתוך סי אלגנס מתוארות. שינויים פוטנציאליים למבנה שרירים ובתפקודם הוערכו באמצעות ה- GFP מקומי וצבעים קטיוני.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב C. elegans

מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור אובדן של חומציות lysosomal במעי של C. elegans באמצעות לצבוע חיוני רגיש pH 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate...

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

נתאר החילוץ בקנה מידה קטן שונה ואת מבחני ערכי צבע מוחלטים של ו לקטט פירובט ב תולעים נימיות C. elegans. כאשר ניצול מסחרי assay ערכות, פיתוח טכני של הרגישות והדיוק שלהם חשובה. חלבון משקעים החילוץ הוא השלב הקריטי ביותר של הקביעה כמותית של מטבוליטים תאיים.

ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.

גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר שיטה לגידול בקנה מידה גדול Caenorhabditis elegans במדיה מוצק. כחלופה תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מאפשר קבלת הפרמטרים של סולמות שונים המעובדים המבוסס על צלחת. פעולה זו מגדילה את comparability של תוצאות על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.

מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד חדירות המעי של האלגיה. שיטה זו מועילה למחקרים ביולוגיים בסיסיים על בריאות המעיים הקשורים לאינטראקציה בין בקטריה מעיים למארחים שלהם ולהקרנה כדי לזהות פרוביוטיקה וחומרים כימיים כדי לרפא תסמונת המעיים הדולף ומחלות המעי דלקתיות.

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

כאן, שיטה מוצגת לניתוח של קינטיקה הצטברות חלבון נמטודה Caenorhabditis elegans. בעלי חיים מאוכלוסייה מסונכרנת גיל הם בתמונה בנקודות זמן שונות, ואחריו ספירת הכללה חצי אוטומטית CellProfiler והתאמה למודל מתמטי באמילופיט.

ניטור הצטברות חלבונים קינטיקה ב Vivo באמצעות ספירת הכללה אוטומטית ב Elegans Caenorhabditis

למדו שני מבחנים זולים ופשוטים ב-Caenorhabditis elegans להדגמת מטבוליזם של פחמימות ותהליכי הזדקנות. השיטות משתמשות בצביעת יוד וצבע כחול להערכת גליקוגן ושלמות המעי בנמטודות שקופות.

שימוש בצבעים זולים כדי להמחיש הצטברות גליקוגן ושלמות המעי ב - Caenorhabditis elegans

גלה סרטונים נוספים