ניתוח כמותי של ייצוב קרום הרשתית האנדופלזמית (MAM) הקשור למיטוכונדריה במודל עצבי של מחלת אלצהיימר (AD)

אנו מנסים למדוד כמותית את היציבות של ממברנות ER הקשורות למיטוכונדריה בעוביים שונים או ברוחב פער שונה, מה שחשוב בוויסות הפתופיזיולוגיה של מספר מחלות ניווניות, כולל אלצהיימר. מחקרים אחרונים על ממברנות ER הקשורות למיטוכונדריה, הנקראות לעתים קרובות MAMs, תיארו אותן כאחד הגורמים המרכזיים בהתחלת פתולוגיה של עמילואיד בשלב המוקדם של אלצהיימר. הממצאים הובילו לפיתוח השערה חדשה הנקראת השערת MAM, המציעה כי אלצהיימר היא אך ורק מחלה הקשורה ל-MAM.

הפרוטוקול שלנו הוא הראשון שמספק כלי כמותי למדידת ייצוב MAM בתאים חיים, שנותר מאתגר עד כה. היתרון הגדול ביותר של הפרוטוקול שלנו הוא שהוא משתמש בתכונה הדינמית הפנימית של המיטוכונדריה כדי למדוד כמותית את השינויים בייצוב MAM בעת הידוק או התרופפות רוחבי פער MAM בתאים חיים.

ההתמקדות שלנו בעתיד המיידי היא לשפר ולהשתמש בטכניקה המתקדמת שלנו להדמיית תאים חיים וקימוגרפיה כדי לסנן סדרה של מודולטורים סינתטיים או טבעיים של מולקולות קטנות סינתטיות או טבעיות שאושרו על ידי ה-FDA של קולטן MAMs או קולטן סיגמא אחד הקשור ל-MAM, תוך שימוש בפלטפורמת סינון תרופות AD שפותחה לאחרונה ולהבין את מנגנון הפעולה שלהם.

[קריין] כדי להעביר את התאים עם מייצבי MAM, החלף את התערובת החד-גרעינית של מח העצם בשני מיליליטר של מדיום DMEM-F12 בטמפרטורת החדר בכל באר. שלב מגיב נוקלאופקטור עם תוסף אחד ביחס של 4.5 לאחד. הוסף לתערובת 100 מיקרוליטר של מגיב הנוקלאופקטור. ואז מערבל את תמיסת ה-DNA. הוסף 1 עד 5 מיקרוגרם של DNA לכל טיפול לצינורות מיקרו צנטריפוגה נפרדים של מיליליטר אחד לכל טרנספקציה. לאחר שאיבת המדיה הקיימת מהתאים, יש לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מיליליטר PBS. שאפו את ה- PBS והוסיפו מיליליטר אחד של אקוטאז ישירות לתאים. דגרו על התאים במשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הקש בעדינות על צד המנה כדי לעקור את התאים. במיקרוסקופ, ודא שהתאים משוחררים וזורמים בחופשיות. נטרלו את החומרים עם 10 מיליליטר של מדיום DMEM-F12 והעבירו את מתלה התאים לצינור נקי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, קח 10 מיקרוליטר מהתאים התלויים והוסף אותם לצד A של תא ספירת תאים. לאחר מכן הכנס את צד A של החדר המלא לחריץ הראשי בחזית דלפק התאים. לחץ על מדידה ורשום את מספר התאים למיליליטר. צנטריפוגה מספר התאים הנדרש ב -300 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט בזהירות והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של תערובת נוקלאופקטור לכל אלקטרופורציה. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים התלוי לאחד הצינורות המכילים DNA. מערבבים על ידי פיפטינג התמיסה מספר פעמים. לאחר מכן העבירו את תערובת תאי ה-DNA לקוביית אלקטרופורציה ואטמו אותה עם המכסה המצורף. בחר את תוכנית הגרעין המתאימה במכשיר. הוסף מיד כ -500 מיקרוליטר DMEM מצלחת שש בארות ממולאת מראש לקובט באמצעות פיפטות סטריליות. מערבבים בעדינות פעם אחת ומעבירים את התאים האלקטרופוטיים ואת המדיום לבאר המתאימה. כדי להתחיל, הנח את צלחת שש הבארות המכילה תאים בתא המיקרוסקופ והתאם את מיקוד המיקרוסקופ עד שהתאים נראים לעין. כדי ללכוד את אות החלבון הפלואורסצנטי האדום, עורר את הפלואורופור באמצעות לייזר של 594 ננומטר והגדר את הפליטה ל-570 עד 640 ננומטר. עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק, השתמש בלייזר של 488 ננומטר לעירור עם פליטה של 510 עד 540 ננומטר. חתכו את אזור הסריקה כך שיתאים סביב האקסון. שטח סריקה קטן יותר יקטין את זמן העיבוד ויפשט את יצירת הקימוגרפיה. הגדר את המרווח לפריים אחד לשנייה ואת משך הזמן הכולל ל-181 שניות. לחץ על הפעל כדי להתחיל בתהליך. המהירות האקסונלית של מיטוכונדריה קשורה ל-MAM 1X הופחתה ב-50% בהשוואה למיטוכונדריה חופשית ו-MAM 9X. 26.6% מהמיטוכונדריה של MAM 1X היו ניידים לעומת 53.82% מהמיטוכונדריה החופשית ו-44.79% מהמיטוכונדריה MAM 9X. התנועה לאחור הייתה נמוכה יותר עבור מיטוכונדריה MAM 1X מאשר מיטוכונדריה Mito-RFP ומיטוכונדריה MAM 9X. התנועה האנטרוגרדית של מיטוכונדריה MAM 1X הופחתה גם היא לעומת Mito-RFP. האחוז הנייח של מיטוכונדריה MAM 1X היה גבוה משמעותית מהמיטוכונדריה MAM 9X, מה שמשקף ירידה בתנועתיות, בעוד שהמהירות הכוללת של מיטוכונדריה MAM 1X הייתה נמוכה משמעותית מהמיטוכונדריה MAM 9X.