Name: הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: חקור הדמיית סידן חיה באורגנואידים מעיים אנושיים נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על הפרעות בתקשורת תאית ותפוצת נגיפים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים R01DK115507 ו R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH). תמיכת המתאמנים ניתנה על ידי מענקי NIH F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) ו- F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). ברצוננו להודות למרכז הרפואי טקסס Digestive Diseases Enteroid Core על אספקת אמצעי תחזוקת האורגנואידים.

הדמיית סידן של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף

<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Danese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+as+a+result+of+calcium+signaling+modulation%3A+A+cancer-centric+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061(2021).</li>
<li>Harr, M. W., Distelhorst, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+autophagy%3A+Decoding+calcium+signals+that+mediate+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579(2010).</li>
<li>Barak, P., Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Ca2%2B+microdomains+from+store-operated+CRAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097(2020).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP%2C+a+family+of+single-fluorophore+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Evol+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators.</a> J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).</li>
<li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li>
<li>Nászai, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells%3A+Got+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells: Got calcium.</a> Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).</li>
<li>Barrett, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+chloride+secretion+in+the+intestinal+epithelium%3A+Significance+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation.</a> Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptor+regulates+intestinal+dipeptide+absorption+via+Ca2%2B+signaling+and+IKCa+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation.</a> Physiol Rep. 8 (1), e14337(2020).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genetic+knockout+human+intestinal+tissue%E2%80%93derived+enteroid+lines+by+lentivirus+transduction+and+single-cell+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).</li>
<li>Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+dissect+gastrointestinal+virus-host+interactions%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned.</a> Viruses. 13 (6), 999(2021).</li>
<li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPbase%3A+a+community-editable+fluorescent+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li>
<li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-triggered+secretion+by+hydrocarbon-stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides.</a> Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+induces+intercellular+calcium+waves+through+ADP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling.</a> Science. 370 (6519), eabc3621(2020).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoctamin+1%2FTMEM16A+controls+intestinal+Cl%E2%88%92+secretion+induced+by+carbachol+and+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin.</a> Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+TMEM16A+control+luminal+chloride+secretion+in+a+NHERF1+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100912(2021).</li>
<li>Mroz, M. S., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+chronically+upregulates+Ca2%2B-dependent+Cl%E2%88%92+conductance+and+TMEM16A+expression+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells.</a> J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).</li>
<li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li>
<li>Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+as+a+key+for+pathogens+invasion+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (5), 2506(2021).</li>
<li>Samak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2FAsk1%2FMKK7%2FJNK2%2Fc-Src+signalling+cascade+mediates+disruption+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+by+dextran+sulfate+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium.</a> Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+Ca2%2B+regulates+intestinal+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li>
<li>Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+host+cell+calcium+signaling+during+viral+infections%3A+Emerging+paradigm+with+high+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance.</a> Mol Aspects Med. 81, 101004(2021).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).</li>
<li>Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+disrupts+calcium+homeostasis+by+NSP4+viroporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity.</a> mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).</li>
<li>Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rotavirus+NSP4+viroporin+domain+is+a+calcium-conducting+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel.</a> Sci Rep. 7, 43487(2017).</li>
<li>Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+hijacked+through+viroporin-activated+calcium%2Fcalmodulin-dependent+kinase+kinase-%CE%B2+signaling+is+required+for+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).</li>
<li>Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPII+vesicle+transport+is+required+for+Rotavirus+NSP4+interaction+with+the+autophagy+protein+LC3+II+and+trafficking+to+viroplasms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms.</a> J Virol. 94 (1), e01341(2019).</li>
<li>Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+calcium+on+the+early+steps+of+Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection.</a> Virology. 295 (1), 190-200 (2002).</li>
<li>Hyser, J. M., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+consequences+of+calcium-conducting+viroporins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins.</a> Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).</li>
<li>Strtak, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovirus+NS1-2+has+viroporin+activity+that+induces+aberrant+cellular+calcium+signaling+to+facilitate+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication.</a> mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> J Vis Exp. (146), 59357(2019).</li>
<li>Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+intestinal+organoid+technology+and+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling.</a> Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).</li>
<li>Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+rotavirus+entry+and+release+from+differentiated+small+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells.</a> Virology. 499, 65-71 (2016).</li>
<li>Mirabelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Norovirus+efficiently+replicates+in+differentiated+3D-human+intestinal+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids.</a> J Virol. 96 (22), e0085522(2022).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), 28749075(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+NEMO+as+calcium+indicators+with+large+dynamics+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity.</a> Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

שינויים ברמות Ca2+ ציטוסוליים יכולים להיות סיבה ותוצאה של פתולוגיות בתוך אפיתל 10,16,17. עלייה בסידן ציטוסולי יכולה לגרום ישירות להפרשה באמצעות הפעלת תעלת הכלוריד תלוית הסידן TMEM16A18,19. הפעלת TMEM16A בתגובה ל- Ca2+ מאפשרת זרימה אפית של כלוריד, ויוצרת שיפוע אוסמוטי המקדם הפרשת נוזלים20,21. יתר על כן, עליות Ca2+ בתוך תאים enteroendocrine לעורר את שחרורו של סרוטונין, אשר מגרה נוירונים חושיים afferent שיכול לווסת את הפעילות בתוך מערכת העצבים אנטרי22. אותות Ca2+ יכולים גם לווסת צמתים הדוקים כדי להשפיע על תפקוד המחסום23,24, ולווסת את ההתפשטות בתאי גזע במעי25. לכן, דיסרגולציה של Ca2+ יכולה להיות בעלת השפעות רחבות ומרחיקות לכת.
וירוסים רבים מבצעים מניפולציות ציטוסוליות Ca2+ כדי ליצור סביבה תאית שתורמת לשכפול26. Rotavirus הוא דוגמה מצוינת לכך בתוך אפיתל המעי27. Rotavirus non-structural protein 4 (NSP4) הוא ערוץ מוליך Ca2+ המאפשר זרימה של Ca2+ מהרשתית האנדופלסמית לתוך ציטוזול28,29. זה מגרה אוטופגיה ומסייע להרכבה של הקפסיד החיצוני 30,31,32. זיהום Rotavirus גם גורם לשחרור ADP, ומפעיל גלי Ca2+ בין-תאיים התורמים לפתוגנזה17. וירוסים אנטריים אחרים, כולל caliciviruses ו enteroviruses, מקודדים Ca2+ מוליך viroporins המפעילים חוסר ויסות דומה של Ca2+ בתוך תאים נגועים33,34.
הדמיה של תאים חיים Ca2+ של אורגנואידים במעיים אנושיים מציעה פלטפורמה רב-תכליתית לחקר איתות המושרה על ידי וירוסים בתוך האפיתל. עם זאת, עוצמת המסקנות העולות מנתוני ההדמיה תלויה, באופן בלתי נמנע, בבריאות ואיכות ה- HIOs, בפרמטרים מתאימים של הדמיה ובגישה אנליטית מבוססת.
התמרה לנטיויראלית יעילה היא לעתים קרובות השלב המגביל בעת הקמת קווי HIO חדשים, אך לנטיוירוס טיטר גבוה וטרנסדוקציות מרובות עוזרים להבטיח ביטוי טרנסגנים מספיק. חשוב לציין, זה יצטרך להיות מאוזן עם הפוטנציאל של מתח תאי משמעותי על התמורה. זה לרוב זמני ושוכך לאחר בחירה וקטעים מרובים. עם זאת, זה קריטי כי HIOs שהונדסו לבטא GECIs להציג צמיחה נורמלית והתפשטות לפני תחילת הניסויים. כמו כן, פיזור HIOs תלת-ממדיים והפיכתם לחד-שכבתיים גורם לעקה תאית. מומלץ לאפשר שלושה ימים או יותר לחד-שכבות להסתגל לאחר הציפוי. ציפוי הצלחות בקולגן IV הוא קריטי לשלמות חד-שכבתית35,36. שימוש בקולגן IV ואחסון בטמפרטורה של -80°C בין שימושים מסייע להבטיח היצמדות חד-שכבתית. קביעת צפיפות הזריעה האופטימלית עבור כל קו HIO יכולה גם לעזור לשפר את העקביות. לבסוף, הכללת הבקרות המתאימות, והשוואתם בין ניסויים, היא הכרחית כדי להבטיח שכל תצפית מייצגת תגובה למשתנה המדובר, ולא גורם מבלבל טכני.
בעוד ניקוד חד שכבתי יכול לגרום נזק לא רצוי לתאים, זה משפר מאוד זיהום RV של HIO 2D. איור 2 ממחיש זאת, מאחר שכמעט כל התאים הנגועים צמודים ישירות לשריטה. ראיות ניסיוניות מצביעות על כך ש- RV מדביק בצורה היעילה ביותר על פני השטח הבזולטרליים של תאי אפיתל המעי37. לפיכך, צפוי כי ניקוד חד שכבתי משפר את ההדבקה על ידי חשיפת המשטח הבזולטרלי. זיהום חד-שכבתי יעיל יכול להיות מושג גם על ידי ציפוי HIOs על ממברנות פוליקרבונט המרחפים בבארות המכילות מדיום תרבית, המאפשרים גישה למשטח הבזולטרלי. עם זאת, המרחק הגדול יחסית בין הצלחת לבין קרום הפוליקרבונט, קרום הפוליקרבונט עצמו ומשטח הפלסטיק בבסיס הבאר הופכים אותם ללא מתאימים להדמיית אפיפלואורסצנטיות. לפיכך, שיטת הניקוד המתוארת בפרוטוקול זה נותרה הגישה המועדפת. בהתחשב בכך שהניקוד עצמו עלול להוביל להפרעות איתות, הכללת בקרת הניקוד הלא נגועה היא קריטית לפרשנות. עבור וירוסים, כגון נורו-וירוס אנושי, המדביקים ביעילות דרך הממברנה האפיקאלית, ניקוד החד-שכבתי אינו נדרש38.
כמו בכל מערכת הדמיה חיה, פוטוטוקסיות יכולה בקלות לבלבל ניסויים המשתמשים בחד-שכבות HIO. במהלך ניסוי הדמיה, חשוב לעקוב אחר vacuolization בלתי צפוי, blebbing קרום, או אינדיקטורים מורפולוגיים אחרים של מתח39. אם אחד מהסימנים הללו מזוהה, יש להפחית את משך הזמן, התדירות או עוצמת העירור. הגדלת יחס האות לרעש באה לעתים קרובות על חשבון בריאות התא לטווח ארוך ולכן אופטימיזציה אמפירית של פרמטרים היא קריטית. הלבנה, כפי שמצוין על ידי ירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות הבסיסית לאורך זמן, היא מבשרת של לחץ תאי ויש להימנע ממנה.
הוויזואליות של נתוני הדמיה יכולה להוביל חוקרים להעדיף ניתוחים איכותיים, ולא כמותיים. עם זאת, כמו בכל מודאליות, מסקנות ניתנות לשחזור דורשות כימות. ניתוח תמונה כמותי מכיל הרבה יותר מורכבות ממה שניתן לכסות בכתב יד בודד, אך כדאי להדגיש כמה נקודות מפתח. ראשית, כימות עקבי דורש רכישה עקבית. צינור ניתוח שפותח עבור קבוצה נתונה של פרמטרי רכישה עשוי שלא להיות יעיל עבור תמונות שנרכשו בתדרים, זמני חשיפה, עוצמות לייזר או אורכי גל שונים. שנית, לריבוי הזיהומים יש השפעה עצומה על תדירות אותות הסידן הנגיפיים. לכן, חשוב להעריך את מספר התאים הנגועים בכל שדה ראייה ולהבטיח עקביות בין תנאי הטיפול. לחלופין, נרמול תדירות האות למספר התאים הנגועים לכל שדה ראייה יכול לסייע בהפחתת השגיאה. לבסוף, בעוד שאינדיקטור הסידן מבוסס mNG (NEMO) שפותח לאחרונה מציע גישה מבטיחה לקביעת ריכוזים מוחלטים של Ca2+ בתאים40, רוב הביו-חיישנים מעבירים רק מידע יחסי על מערכות ביולוגיות. לכן, חיסור רקע, נורמליזציה והשוואה לפקד הם קריטיים.
בעוד פרוטוקול זה מתמקד בהדמיית סידן במהלך זיהום נגיפי, הגישה הכללית ניתנת להתאמה בקלות. זיהום ויראלי יכול בקלות להיות מוחלף במצב טיפול חלופי, ויש מגוון הולך וגדל של biosensors כדי לפקח על מסלולים ותהליכים תאיים רבים ושונים. עם כל התאמת פרוטוקול, החוקרים חייבים לשמור על הניתוח בראש סדר העדיפויות, ולתכנן ניסויים עם תוצאות ברורות וניתנות לכימות.
בסך הכל, הדמיה חיה מספקת רזולוציית זמן ללא תחרות, ומשפרת את אפיון התהליכים הדינמיים ביותר. שילוב אורגנואידים בניסויי הדמיה חיים מאפשר תצפית על תהליכים אלה במודל נאמן לרקמה, רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אנו מקווים שהפרוטוקול המתואר כאן יאפשר תכנון ואופטימיזציה של ניסויים, ויעצים חוקרים לחשוף היבטים חדשים של איתות תאים ורקמות.

סידן הוא שליח שני שנשמר באופן נרחב וממלא תפקיד קריטי בוויסות הפיזיולוגיה התאית1. בהתחשב במטען החזק שלו, גודלו הקטן ומסיסותו הגבוהה בתנאים פיזיולוגיים, סידן הוא מניפולטור אידיאלי של קונפורמציה חלבונית. זה הופך את הסידן לאמצעי רב עוצמה להמרת אותות אלקטרוכימיים לשינויים אנזימטיים, שעתוק או לאחר שעתוק. שיפועי ריכוז הסידן המחמירים על פני הרשתית האנדופלסמית (ER) וקרומי הפלזמה יוצרים כוח מניע גבוה המאפשר שינויים מהירים בריכוז הסידן הציטוסולי. מנגנונים מרובים, כולל חציצה והובלה אקטיבית, שומרים בחוזקה על שיפוע זה. בעוד שהוא נחוץ לתפקודים תאיים תקינים, תחזוקה זו יקרה מבחינה אנרגטית, מה שהופך אותו לרגיש במיוחד במצבי לחץ 2.
לכן, חוסר ויסות של סידן בתוך ציטוזול הוא אות כמעט אוניברסלי של סוגים רבים של מתח תאי. הפרעות מטבוליות, רעלים, פתוגנים, נזק מכני והפרעות גנטיות יכולים כולם לשבש את איתות הסידן. ללא קשר לגירוי, ברמת התא כולו, עלייה מתמשכת ובלתי מבוקרת בסידן ציטוסולי יכולה לקדם אפופטוזיס ובסופו של דבר נמק 3,4. עם זאת, לשינויים ברמות הסידן הציטוסולי של משרעת נמוכה יותר או בתדירות גבוהה יותר, יש השפעות משתנות2. כמו כן, התוצאות של תנודות סידן עשויות להיות שונות בהתאם למיקרו-תחום המרחבי שבו הן מתרחשות5. ניטור רמות הסידן יכול אפוא להציע תובנה לגבי תהליכי איתות דינמיים, אך לשם כך נדרשת דגימה ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה יחסית.
מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs) הם כלים רבי עוצמה לדגימה רציפה במערכות תאים חיים6. חלק מה- GECIs הנפוצים ביותר הם חלבונים פלואורסצנטיים מבוססי GFP המגיבים לסידן הידועים בשם GCaMPs7. GCaMP הקנוני הוא מיזוג של שלושה תחומי חלבון נפרדים: GFP בעל תמורות מעגליות (cpGFP), קלמודולין ו-M136. תחום הקלמודולין עובר שינוי קונפורמציה עם קשירת הסידן, המאפשר את האינטראקציה שלו עם M13. האינטראקציה קלמודולין-M13 גורמת לשינוי קונפורמטיבי ב-cpGFP שמגביר את הפליטה הפלואורסצנטית שלו בעת עירור. לכן, עלייה בריכוז הסידן נמצאת בקורלציה עם עלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של GCaMP. חיישנים אלה יכולים להיות ציטוסוליים או ממוקדים לאברונים ספציפיים8.
בדומה לרוב הרקמות, סידן מווסת מגוון תפקודים בתוך אפיתל מערכת העיכול. אפיתל המעי הוא אינטגרלי לספיגת חומרים מזינים ונוזלים, אך גם חייב ליצור מחסום הדוק וממשק חיסוני הדוק כדי למנוע פלישת פתוגן או עלבונות רעילים. מסלולים תלויי סידן משפיעים כמעט על כל התפקודים החיוניים הללו 9,10,11. עם זאת, איתות סידן בתוך אפיתל המעי נותר גבול שלא נחקר מספיק עם פוטנציאל מבטיח כמטרה טיפולית. בעוד ניטור דינמיקת הסידן בתוך אפיתל המעי in vivo ממשיך להציב אתגרים, אורגנואידי מעיים אנושיים (HIOs) מציעים מערכת אקס ויו ניתנת להתאמה לניסויים12. HIOs הם ספרואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) שמקורם בתאי גזע אנושיים במעי, ועם התמיינותם, הם משחזרים חלק גדול מהמגוון התאי של אפיתל המעי המקומי12.
פרוטוקול זה מתאר שיטות מקיפות להנדסת HIOs המבטאים GECIs ולאחר מכן מכינים HIOs מהונדסים כמונו-שכבות להדמיית סידן בתאים חיים. הוא מציע זיהום ויראלי כדוגמה למניפולציה פתולוגית המשבשת את איתות הסידן ומספק גישה אנליטית לכימות שינויים אלה.

<table><tbody><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>מתקדם 12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>0.05% טריפסין EDTA&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>0.05% טריפסין EDTA&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25300054 צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>Fisherbrand</td><td>5408137</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>25 מד מחט</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>DMEM מתקדם F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-מיקוציטיקה&nbsp;</td><td>גיבקו</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייה&nbsp;</td><td>תוסף גיבקו</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP1600100</tr><tr><td>CellView שקופית תרבית תאים, PS, 75/25 מ"מ, תחתית זכוכית, 10 תאים</td><td>גריינר</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>קולגן IV</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>פלואורובריט</td><td>גיבקו</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35050079 גורם גדילה אפידרמלי אנושי</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td> <td>(משתנה)</td><td></td></tr> <tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231/CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc תרבית תאים מטופלת 24 בארות צלחות</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>פוליברן</td><td>MilliporeSigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>אנזים TrypLE Express, ללא פנול אדום</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>וורת'ינגטון</td><td>ביוכימי NC9811754</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

איתות סידן הוא וסת אינטגרלי של כמעט כל רקמה. בתוך אפיתל המעי, סידן מעורב בוויסות פעילות ההפרשה, דינמיקה של אקטינים, תגובות דלקתיות, התפשטות תאי גזע ותפקודים תאיים רבים אחרים שאינם מאופיינים. ככזה, מיפוי דינמיקת איתות הסידן בתוך אפיתל המעי יכול לספק תובנה לגבי תהליכים תאיים הומיאוסטטיים ולחשוף תגובות ייחודיות לגירויים שונים. אורגנואידי מעיים אנושיים (HIOs) הם מודל בעל תפוקה גבוהה שמקורו בבני אדם לחקר אפיתל המעי ובכך מייצגים מערכת שימושית לחקר דינמיקת הסידן. מאמר זה מתאר פרוטוקול להתמרה יציבה של HIOs עם מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs), ביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי וניתוח נתוני הדמיה כדי לאפיין באופן משמעותי אותות סידן. כדוגמה מייצגת, HIOs תלת מימדיים הומרו עם lentivirus כדי לבטא ביציבות GCaMP6s, GECI ציטוסולי ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטי. לאחר מכן פוזרו ה-HIOs המהונדסים לתרחיף חד-תאי ונזרעו כחד-שכבות. לאחר ההתמיינות, חד-שכבות HIO נדבקו בנגיף הרוטה ו/או טופלו בתרופות הידועות כמעוררות תגובת סידן. מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד בתא הדמיה חי מבוקר טמפרטורה ולח איפשר הדמיה ארוכת טווח של חד-שכבות נגועות או מטופלות בתרופות. לאחר ההדמיה, התמונות שנרכשו נותחו באמצעות תוכנת הניתוח הזמינה באופן חופשי, ImageJ. בסך הכל, עבודה זו מקימה צינור מותאם לאפיון איתות סלולרי ב- HIOs.

איור 1A מראה כיפת BMM המכילה אורגנואידים תלת-ממדיים של המעי האנושי שהומרו לביטוי יציב של GCaMP6s. איור 1B מראה את אותו קו של אורגנואיד מצופה מחדש כמו חד-שכבתי ב-24, 48 ו-72 שעות לאחר הזריעה. כדי לאמת את הפונקציה של GCaMP6s, המונושכבה צולמה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כל 2 שניות במשך 4 דקות, ו- ADP של 100 ננומטר נוסף למדיה לאחר ~ 20 שניות. ADP מעורר שחרור סידן מהרשתית האנדופלסמית, ומגביר את הסידן הציטוסולי. עוצמת הפלואורסצנטיות שזוהתה בתעלה של 488 ננומטר בכל חשיפה מתוארת באיור 1C. המעקב מראה עוצמת פלואורסצנטיות יציבה בקו הבסיס ואחריה עלייה מהירה עם הוספת ADP, וחזרה הדרגתית לכיוון קו הבסיס. בקרת רכב נכללת כדי לוודא שהתגובה היא אירוע איתות אמיתי, ולא רק שינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות שעשוי לנבוע מהוספת מדיה.
ניקוד חד שכבתי HIO מגביר את היעילות של זיהום rotavirus. בעוד שטכניקות הניקוד משתנות, הכי קל לקבל זיהום עקבי באמצעות ניקוד יחיד לאורך השכבה החד-שכבתית, כפי שמוצג באיור 2A. בעת שימוש בזנים רקומביננטיים של נגיף הרוטה שמבטאים חלבונים פלואורסצנטיים, ניתן לאמת זיהום במהלך הדמיה חיה (איור 2B). בעת שימוש בזן שאינו מבטא סמן, ניתן לזהות זיהום על ידי immunofluorescence לאחר הדמיה. בהתחשב בתנועתיות התאים בחד-שכבות HIO, לעתים קרובות קשה לעקוב אחר תא נגוע יחיד לאורך זמן. במקום זאת, השתמשו בצביעת נקודות הקצה כשיטה לאמת את ההדבקה ולוודא שריבוי ההדבקה תואם בין שדות הראייה (איור 2C).
ניתן לצפות בגלי סידן בין-תאיים ב-HIOs באופן איכותי, כפי שמתואר באיור 3A. עם זאת, קביעת התדירות של גלי סידן בשדה ראייה נתון דורשת ניתוח כמותי. השלבים של פילוח מוצלח, כפי שמתוארים בשלב 6 של הפרוטוקול לעיל, מתוארים באיור 3A. האיור מראה את התמונה הגולמית (איור 3Ai), את התמונה לאחר הפחתת עוצמות הפיקסלים מהמסגרת הקודמת (איור 3Aii), ולאחר מכן את גל הסידן המקוטע (איור 3Aiii).
לאחר שגלי הסידן חולקו וכומתו עבור כל שדה ראייה במהלך ריצת ההדמיה, לעתים קרובות אינפורמטיבי להשוות את תדירות הגלים בחד-שכבות שנחשפו לתנאים שונים. תרשים הפסים באיור 3B מראה את המספר הכולל של גלי סידן לכל שדה ראייה בחד-שכבות מדומות ומחוסנות בנגיף רוטה. דוגמה זו כוללת שני זנים של RV: זן של נגיף רוטה אנושי (Ito HRV) וזן רקומביננטי של נגיף הרוטה סימיאן SA11 המבטא mRuby (SA11-mRuby). הבקרה הנגועה בדמה נלקחת כתדר גלי הסידן הבסיסי, החד-שכבות הנגועות בנגיף הרוטה שאינן מטופלות משמשות כבקרות חיוביות, והחד-שכבות הנגועות בנגיף הרוטה ומטופלות הן תנאי הניסוי. לאחר מכן ניתן להשוות חד-שכבות נגועות במוק ו-RV המטופלות בתרופות, כולל מעכב קולטן ADP, BPTU, לשני תנאי הבקרה על ידי ANOVA חד-כיוונית. הנתונים מצביעים על כך ש-BPTU מפחית ביעילות את התדירות של גלי סידן בין-תאיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig01.jpg"> איור 1: אימות ביטוי GCaMP6s באורגנואידים של מעיים אנושיים. (A) לאחר התמרה של לנטי-וירוס, ה-HIOs המבטאים GCaMP עברו סלקציה ומעברים מרובים, המוצגים כאן ב-7 ימים מאז הקטע האחרון. עם גירוי עם לייזר 488 ננומטר, ביטוי GCaMP6s ניכר ב- HIOs המומרים המצופים במטריצת קרום מרתף 15 μL כספרואידים תלת ממדיים (Ai). חשיפות של 50 מילישניות נרכשו בהספק לייזר של 50% באמצעות מטרה של פי 20, ולאחר מכן נתפרו יחד כדי להמחיש את כל כיפת המטריקס של קרום המרתף. תהליך דומה בוצע באמצעות 4 ms brightfield exposures (Aii). בתמונת השדה הבהיר, ה-HIOs הכהים במרכז הכיפה הם אינדיקציה לכך שהתרבויות מוכנות למעבר. (B) HIOs עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי, ואז צופו מחדש בצפיפות של 150,000 תאים לבאר (קוטר 5 מ"מ) של צלחת תחתית הדמיה מצופה מראש בקולגן IV. עד 72 שעות לאחר הזריעה, השכבה החד-שכבתית הייתה שוטפת ומוכנה ליישומים במורד הזרם. כדי לאמת את הפונקציה של GCaMP, התמונות נרכשו באמצעות מסנן 488 ננומטר עם חשיפות של 50 אלפיות השנייה בעוצמת לייזר של 50% כל 2 שניות למשך 4 דקות. (C) העקבות המוצגות כאן מייצגות את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל השדה שנורמלה לרכישה הראשונה במהלך ההדמיה. בסביבות 20 שניות (חץ), לאחר החשיפה העשירית, 100 ננומטר אדנוזין דיפוספט (ADP) נוסף כדי לעורר עלייה חדה בסידן ציטוסולי (אדום). התוספת של נפח שווה של 1x PBS לא עוררה תגובה משמעותית (כחול). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig02.jpg"> איור 2: ניקוד שכבה חד-שכבתית של HIO כדי להקל על זיהום RV. (A) האיור מדגים טכניקה מתאימה לניקוד חד-שכבתי באמצעות מחט 25G. (B) חד-שכבה של HIO נדבקה בזן רקומביננטי של RV המבטא את החלבון הפלואורסצנטי mRuby (מגנטה, חץ), המאפשר זיהוי תאים נגועים. לחלופין, בעת שימוש בזן טבעי של RV, ניתן לזהות תאים נגועים באמצעות immunofluorescence. (C) התמונות המוצגות הן מ-4 שכבות HIO שונות לאחר קיבוע, צביעת DAPI (כחול) ותיוג נוגדנים של אנטיגן רוטה-וירוס (מגנטה). שתי הטכניקות ממחישות את זיהום ה-RV המועדף ליד החלק המבקיע של החד-שכבתי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig03.jpg"> איור 3: פילוח וכימות של גלי סידן בין-תאיים הנגרמים על-ידי RV. חשיפות של 488 ננומטר של HIOs נגועים בקרוואנים המבטאים GCaMP6s נרכשו כל דקה למשך 16 שעות באמצעות הפרוטוקול. (A) האיור ממחיש את תהליך פילוח גלי הסידן הבין-תאיים. ראשית, ערכי הפיקסלים מהרכישה הקודמת (t-1) מופחתים מכל תמונה גולמית (Ai) כדי לכמת את השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות (Aii). לאחר מכן מוחל סף המבוסס על עלייה מינימלית אופטימלית בעוצמה מהמסגרת הקודמת. לאחר מכן התמונות מסוננות עבור אזור אות רציף מינימלי כדי לבחור עבור גלי סידן בין-תאיים (Aiii) ולא לכלול אותות סידן חד-תאיים. עיבוד זה מאפשר לכמת גלי סידן בכל שדה ראייה. בניסוי זה, חד-שכבות היו נגועות בדמה, נגועות בזן ITO של נגיף הרוטה האנושי (HRV), או נגועות בזן רקומביננטי של נגיף הרוטה סימיאן המקודד mRuby על מקטע גן 7, במורד הזרם של חלבון לא מבני 3 (SA11-mRuby). חד-שכבות נגועות טופלו במעכב קולטן ADP BPTU או נותרו ללא טיפול. לאחר מכן צולמו חד-שכבות ב-8 מיקומים שונים, וגלי סידן בכל שדה ראייה כומתו באמצעות הצינור המתואר בפרוטוקול זה. הנקודות בתרשים הרצועה מציינות את מספר גלי הסידן שזוהו בכל מיקום על גבי תרשים עמודות המסמן את הממוצע ואת SD. ANOVA חד-כיווני ואחריו הבדיקות של דנט מראות כי בעוד שכל זן של RV מגביר את התדירות של גלי סידן בין-תאיים מעל זו של הקבוצה הלא נגועה, טיפול BPTU מונע את העלייה בתיווך RV בתדירות גלי הסידן. **p<0.01, ***p<0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מגיב</td>
			<td>התמרה</td>
			<td>לשלוט</td>
		</tr><tr><td>Y-27632 (מלאי של 1 מיליון)</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>פוליברן (1 מ"ג/מיקרוליטר מלאי)</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>לנטיוירוס</td>
			<td>משתנה*</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HighWnt-WRNE *ראה הערות</td>
			<td>עד 400 μL</td>
			<td>עד 400 μL</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: מדיום התמרה של לנטיוירוס. הכן את מדיית ההעברה ואת אמצעי הבקרה על ידי שילוב הריאגנטים באמצעי האחסון המצוינים בעמודה השנייה והשלישית, בהתאמה. יש לשאוף לריבוי זיהומים (MOI) של 10 יחידות התמרה של לנטי-וירוס לכל תא. עבור LV ארוז בבית, זה בדרך כלל דורש ~ 25-50 μL של LV מרוכז. הטיטר של רוב LV ארוז מסחרית יסופק עם תעודת הניתוח.
קובץ קידוד משלים 1: סקריפט מאקרו ImageJ כדי לאפשר כימות גלי סידן על ידי עיבוד אצווה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/Wave_counter.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר גישה לביצוע הדמיית סידן באורגנואידים של מעיים אנושיים נגועים בנגיף, ומציע גישה לניתוח.

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

באמצעות עבודתנו, אנו שואפים להבין כיצד וירוסים משבשים את האיתות בתוך אפיתל המעי. אנו מתעניינים במיוחד בהבנת הדרכים שבהן תאים נגועים בנגיף מווסתים תאים לא נגועים שכנים כדי לתרום לפתוגנזה. לאחרונה גילינו כי תאים נגועים בנגיף הרוטה משחררים פולסים של ADP, אשר מווסת תאים שכנים לא נגועים ומאפשר התפשטות נגיפים ומחמיר מחלות.בעוד שהדמיית סידן פופולרית מאוד בתחומים כמו מדעי המוח, היא לא נמצאת בשימוש נרחב לחקר ביולוגיה אפיתל או וירולוגיה. פרוטוקול זה מציע גישה להתאמת טכנולוגיות קיימות ומערכות מודל לחקר איתות סידן ורקמת אפיתל חיה נגועה בנגיף. על ידי הנדסת אורגנואידים כך שיבטאו מדדי סידן מקודדים גנטית, הגישה שלנו מאפשרת הדמיה עקבית וניתנת לשחזור לטווח ארוך במערכת מודל המשחזרת את המגוון התאי של אפיתל המעי האנושי.אנו שואפים להבין את ההשפעות של איתות פורינרגי פרקריני המושרה על ידי וירוס הן עבור המארח והן עבור הנגיף. העבודה העתידית שלנו גם תקבע אם סוג זה של איתות נשמר באופן נרחב על פני וירוסים אחרים ואם ההשפעות דומות.

live-calcium-imaging-virus-infected-human-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Reticulum endoplasmic ממלא תפקיד מרכזי ב biogenesis חלבון ו הומאוסטזיס הסידן. הקמנו מערכת ניסויית המאפשרת לנו כתובת תפקידו של ערוצי Ca2 + לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המתרברבים שלהם. מערכת זו כוללת בתיווך siRNA להשתקת הגן ואת תא חי Ca2 + הדמיה.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

סרטון זה מציג את המושגים מאחורי דימות סידן וכולל פרוטוקול לדוגמה להדמיית הילוך מהיר של תולעים הכלולות בבארות אגרוז יצוקות.

הדמיית סידן: שיטה להמחשת פעילות עצבית ב- C. elegans חי

מקור: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. באתרו ca2+{{}} הדמיה של מערכת העצבים המעי. J. Vis. exp.,  (2015){סרטון זה מדגים סידן הדמיה כדי להמחיש ולנתח את הפעילות של נוירונים מעיים וגליה בתכשירי מקלעת מיאנטרית של המעי הגס בעכבר.

הדמיית סידן של פעילות נוירונים מעיים וגליה במקלעת מיאנטרית של עכבר

מקור: Doser, R., et al. הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי in vivo. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של שטף סידן תת-תאי בנוירונים של חוט העצב הגחוני של זני Caenorhabditis elegans טרנסגניים. נעשה שימוש בשני מדדי סידן נפרדים: אינדיקטור ציטופלזמי בזן אחד ואינדיקטור מיטוכונדריאלי באחר. נוירונים נצפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנטר שינויים בזמן אמת בעוצמת הקרינה בתוך הציטופלזמה העצבית והמיטוכונדריה, המשקפים שטף סידן במהלך פעילות עצבית ספונטנית.

הדמיית דינמיקת סידן תת-תאית בתאי עצב של Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מסביר תרבות העיקרית Lgr5-positve organoid והביצועים הבאים של התמרה retroviral. זה מאפשר ביטוי יתר או מציאה Cre-מושרה של transgene נמסר ומאפשר מחקרים פונקציונליים להתבצע ברומן בorganotypic המבחנה   מערכת מודל.

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

מערכת העצבים המעי (ENS) היא רשת של נוירונים וגליה הממוקמת בדופן המעי ושולטת ברפלקסים של המעי. פרוטוקול זה מתאר שיטות לרישום הפעילות של נוירונים מעיים וגליה בתכשירים חיים של ENS באמצעות הדמיית Ca2+.

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שבו תאים בודדים מנוטרים לאירועים חריפים וזיהום HIV-1 פרודוקטיבי במכשיר ננופלואידי. נתוני דימות מגדירים אינטראקציות של קולטן מארח וירוסים ודינמיקה של מסלולי איתות. זוהי השיטה הראשונה עבור תרבות תא יחיד אורך תפוקה גבוהה ננופלואידית והדמיה ללמוד קינטיקה איתות ואינטראקציות מולקולריות.

אפיון תא יחיד של זרם סידן וזיהום HIV-1 באמצעות פלטפורמה אופטופלוידית רב-מפרקית

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

הדמות תאים חיים של איתות סידן משמשת בהרחבה לחקר מוביליזציה של סידן בקווי תאים יציבים שגדלים בשכבות מונולייריות. פרוטוקול זה מתאר הדמיית פלואורסצנציה של תאים חיים של איתות סידן באמצעות צבעי תאים חיים על רקמות ראשוניות מורכבות, ומשתמש גם בתוכנת למידת מכונה לכמת עוצמת הפלואורסצנציה של אלפי תאים בודדים בו-זמנית, ובכך מייעל את הניתוחים.

הדמיית סידן מבוססת פלואורסצנציה בתרביות אפיתל ראשוניות בדרכי הנשימה האנושיות באמצעות סגמנטציה אוטומטית של תאים

חקור הדמיית סידן חיה באורגנואידים מעיים אנושיים נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על הפרעות בתקשורת תאית ותפוצת נגיפים.

הדמיית סידן חיה של חד-שכבות אורגנואידים במעי אנושי נגועים בנגיף באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית

גלה סרטונים נוספים