שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס
22 בדצמבר 2023
כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.
תאי עצב מסתמכים על הובלה דו-כיוונית של מטענים לאורך האקסון כדי לשמור על סינפסות תפקודיות וקישוריות עצבית. גירעונות בתחבורה נחשבים כתורמים קריטיים לפתוגנזה של מספר מחלות נוירודגנרטיביות. אנו שואפים לזהות מנגנונים שבאמצעותם שינויים הקשורים למחלות בחלבון טאו משבשים את ההובלה האקסונלית.
קבענו כי צורות פתולוגיות מרובות של חלבון טאו משבשות את התחבורה האקסונלית הנורמלית בתאי עצב של יונקים. השפעה זו תלויה בשינויים במסלולי איתות מבוססי זרחן המווסתים את ההובלה האקסונלית. שיבושים אלה מייצגים מנגנון פוטנציאלי של רעילות עצבית הנגרמת על ידי טאו במחלות.
צורות מהונדסות של חלבונים ספציפיים יכולות לשבש הובלה אקסונלית מהירה נורמלית על פני מספר מחלות נוירודגנרטיביות. עם זאת, איננו מבינים לגמרי את המנגנונים הבסיסיים של השפעות אלה. זה מספק פרוטוקול פשוט לשחזור כדי לזהות כיצד ביטוי של חלבונים הקשורים למחלות משפיעים על הובלה אקסונלית מהירה בנוירונים של יונקים.
פרוטוקול זה מספק בדיקה ניתנת לשחזור להובלה אקסונלית בנוירונים ראשוניים של יונקים, הניתנת לשינוי בקלות כדי לכלול חלבוני מטען שונים יחד עם ביטוי של חלבונים מעניינים עם שינויים פתולוגיים ספציפיים. זה גם מאפשר הפלות ממוקדות של רכיבי מסלול אחרים כדי לבדוק פרטים מכניסטיים מסוימים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים שילוב של טרנספקציה של נוירונים היפוקמפליים ראשוניים ממכרסמים יחד עם דימוי קונפוקאלי של תאים חיים, במטרה לבחון את ההשפעות של מודיפיקציות פתולוגיות בחלבונים על הובלה אקסונלית. המטרה היא לחשוף את המסלולים המכניסטיים המתווכים שיבושים הנגרמים על ידי מודיפיקציות בחלבון tau במחלות נוירודגנרטיביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- הובלה אקסונלית
- מחלות ניווניות של מערכת העצבים
רקע
- נוירונים מבצעים הובלה דו-כיוונית של מטענים לאורך אקסונים כדי לשמר את התפקוד.
- ליקויים בהובלה קשורים למספר מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- צורות שונות של חלבון tau משונה משבשות את מנגנוני ההובלה הרגילים.
- הבנת מנגנונים אלו עשויה לחשוף מסלולים של נוירוטוקסיות המושרה על ידי tau.
מטרת המחקר
- זיהוי מסלולי השיגנל שהשתנו כתוצאה ממודיפיקציות פתולוגיות של tau.
- ביסוס פרוטוקול לניתוח הובלה אקסונלית בנוירונים של יונקים.
- סיוע במיקוד של חלבונים שונים המשפיעים על מנגנוני הובלה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נוירונים היפוקמפליים ראשוניים עברו טרנספקציה ונלוו בניתוח באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאים חיים.
- הפרוטוקול כולל דיסקציה של רקמת היפוקמפוס מעוברית של עכבר ותרביות תאים בעקבות זאת.
- בטקסט המסופק לא מוזכרים ניתוחי מולטי-אומיקה (multiomics).
- שלבים קריטיים כוללים הכנת שקופיות, טרנספקציה של נוירונים ודימוג יומיים לאחר הטרנספקציה.
- פרטים מתודולוגיים מרכזיים כוללים שימוש בהגדרות דימוג ספציפיות להדמיית הובלה אקסונית.
תוצאות עיקריות
- צורות פתולוגיות של tau משבשות את הדינמיקה התקינה של ההובלה האקסונית.
- שיבוש ההובלה מקושר לשינויים במסלולי פוספורילציה.
- שיבושים אלו עשויים לתרום לניוון עצבי.
- המחקר מבסס גישה הניתנת לשחזור לבדיקת שינויים בהובלה כתוצאה מחלבונים פתולוגיים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה לניתוח ההשפעות של חלבונים שעברו מודיפיקציה על הובלה עצבית.
- הבנת מנגנונים אלו מספקת תובנות לגבי תפקוד לקוי של נוירונים בהקשרי מחלה.
- הממצאים עשויים להעשיר את הידע על הובלה אקסונלית במצבים נוירודגנרטיביים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיבוש בהובלה אקסונלית הוא מנגנון משותף בפתוגנזה של מחלות נוירודגנרטיביות, המשפיע על תיקוף מטרות ועל הפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. דימוי של תאים חיים של נוירונים היפוקמפליים ראשוניים מאפשר הערכה כמותית של האופן שבו חלבונים פתולוגיים, כגון tau מוטנטי, משנים את דינמיקת המטען, ובכך תומך בביטחון תחזיתי במערכות הרלוונטיות למחלה. סבב עבודה הניתן לשחזור זה מסייע במיון הפורטפוליו ובתעדוף של מטרות בנוירודגנרציה על ידי הבהרת ליקויים מכניסטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה של מודיפיקציות חלבון הרלוונטיות למחלה על מנגנוני הובלה נוירונליים.
- תומכת בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כימות של פנוטיפים של שיבוש בהובלה.
- מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים לבחירת מטרות למחלות ניוון עצבי.
- מספקת פלטפורמה לבדיקת אסטרטגיות של השתקה גנטית או modulates של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מבסס בדיקה מתוקפת של תאים חיים לכימות של הובלה אקסונלית בנוירונים ראשוניים.
- מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור, כגון מהירות, תדירות עצירות וצפיפות מטען.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך סריקה של תרכובות או הפרעות גנטיות.
- תומך ביכולת הרחבה ובהתאמה לחלבונים נוספים הרלוונטיים למחלות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים עצביים הרלוונטיים למחלה לצורך חקירת ביומרקרים תרגומיים.
- מספק רצף מגילוי מכניסטי ועד לתיקוף פרה-קליני של פנוטיפי הובלה.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום תוכניות לניורודגנרציה בהתאם לסיכון.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
פרוטוקול דימוי תאי-חי זה משלב שלבים החל מגילוי מוקדם ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ותומך בבדיקת השערות מכניסטיות ובפיתוח בדיקות עבור מטרות של מחלות נוירודגנרטיביות.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת את ההשפעה של מודיפיקציות פתולוגיות של חלבונים על הובלה אקסונלית, ובכך מבהיר מנגנוני מחלה.
- סריקה: מספק קריאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור לסריקת תרכובות או סריקה גנטית בנוירונים ראשוניים.
- אנליטיקה: מייצר מדדים כמותיים (מהירות, תדירות עצירה, צפיפות מטען) להשוואה רהוטה בין תנאים.
- מחקר תרגומי: שומר על רלוונטיות למחלה על ידי שימוש במערכות נוירונליות ראשוניות ובתוצרי פנוטיפ.
- שימוש חוזר ארגוני: פרוטוקול הניתן להתאמה למגוון מטרות של חלבונים בניוון עצבי ולמחקרים מכניסטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של ניוון עצבי.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ולהרחבה, עבור דימות תאים חיים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) וניהול תיק נכסים יעיל מבחינה הונית.
- השפעה על תיק הנכסים: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום מטרות טיפוליות בניוון עצבי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות ראשוניות של נוירונים ובדימות קונפוקלית של תאים חיים.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיה מתקדמת ולכלים לניתוח כמותי של תמונות (למשל, KymoAnalyzer).
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאמה לחלבונים שונים הרלוונטיים למחלה ולשיבושים גנטיים.
- מוגבל למערכות של נוירונים ראשוניים in vitro; עשוי שלא ללכוד את כל המורכבויות של in vivo.
שאלות נפוצות בתחומי הביופרמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:30
Harvesting of Primary Hippocampal Neurons for Live‐Cell Imaging
4:06
Primary Hippocampal Neuron Dissociation and Plating for the Measurement of the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport
6:38
Live‐Cell Imaging of Primary Hippocampal Neurons for the Measurement of the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport
