Name: תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-20T18:40:00.000+00:00
Duration: 16 min 29 s
Description: למדו שיטה לתרבית נוירוני תאי שקית מ-Aplysia californica לדימוי ברזולוציה גבוהה של קונוסי צמיחה גדולים. פרוטוקול זה מאפשר חקר דינמיקת ציטוסקלט ותנועתיות נוירונלית בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות ריאן Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) עבור הצילומים ההליך שלנו רודני McPhail (מחלקת מדעי הביולוגיה, אוניברסיטת Purdue) לקבלת סיוע עם עריכת וידאו לנתיחה. מחקר במעבדה סוטר הוא נתמך על ידי מענקים מ-NIH (R01 NS049233) והמרכז Bindley Bioscience באוניברסיטת Purdue כדי DMS

פתרונות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L15-ASW תרבית תאים בינוניים (1 ליטר) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 שקית אבקת L15 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 800 מ&quot;ל של H 2 O ultrapure </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NaCl 400 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MgSO 4 27 mM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MgCl 2 28 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L-גלוטמין 4 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גנטמיצין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEPES 5 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל-pH 7.9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחר טיפה CaCl 2 9.3 מ&quot;מ (אם להפסיק משקעים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף H 2 O ultrapure כדי l 1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק osmolarity (950-1000 mmol / ק&quot;ג) עם (Wescor, לחץ אדים # 5520) osmometer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן 0.22 מיקרומטר באמצעות לחץ חיובי סינון יחידה (מסננים: SVGV010RS Millipore) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 בחודש </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולי-L-ליזין (70-150 KD) 200 מיקרוגרם / מניות פתרון מ&quot;ל סטרילי H 2 O ultrapure המשיך -20 o C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 מ MgCl 2 פתרון </li></ul> יום 1: Dissection של הגנגליון Aplysia בטן הכנת התמיסה דיסוציאציה האנזימטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 90-10 מ&quot;ג Dispase אנזים (וורטינגטון, חתול: LS02111) בצינור Eppendorf </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 900 μl של המדיום ASW-L15 התרבות, 100 μl של סטרילית H 2 O ultrapure </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים ומניחים בטמפרטורת החדר (RT) </li></ol> Dissection של הגנגליון בטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 50 מ&quot;ל עם 0.5 פתרון M MgCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח חיה אחת פגז מטנק, לטפל בעדינות כדי למנוע הגנה דיות של החיה התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Aplysia על צידו על לוח דיסקציה (קלקר board), בצד מקורי לצד, ממש הזנב שמאלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך החיה מאחורי הראש להזריק כל פתרון MgCl 2 לחלל הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשפשף בעדינות את החיה לפזר את הפתרון MgCl 2 בכל חלל הגוף, לחכות כמה דקות על החיה להיות מורדם לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פין ראש וזנב של החיה על קרש החיתוך עם שתי מחטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים להרים העור, לחתוך דרך העור שכבת השריר במספריים גדולים לכיוון הראש והזנב לעשות פתח גדול בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את הגנגליון בטן תחת מברשת השחלה דמוי. שימוש במלקחיים כדי להחזיק את העצבים על חיבור 1 ס&quot;מ מול הגנגליון בטן, לחתוך את העצבים במספריים לנתיחה מול עמדת מלקחיים מחזיק מאחורי הגנגליון הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגנגליון המקום לתוך הפתרון Dispase ו דגירה של 15-16 שעות ב 22 ° C בעזרת אמבט מים בטמפרטורה מבוקרת. </li></ol> יום 2: ציפוי של תאים Aplysia שקית הכנה מרובה ליזין מצופה coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת ספסל זרימה, להכין שלושה 35mm בצלחות פטרי כמו עבודה כלים לניתוח של הגנגליון, למלא אותם עם בינוני 4 L15-ASW מ&quot;ל כל אחד. מעבירים את הגנגליון בטן מפתרון dispase לאחד את הכלים לעבוד אחרי 15.5 שעות של מערכת העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים לקחת חומצה לניקוי # 1.5 coverslips (22x22 מ&quot;מ) לאחסן אתנול, להסיר אלכוהול לעקר coverslips ידי בוער להם בקצרה על מבער בונזן. תנו להם להתקרר בקצרה לפני הצבת coverslips לתוך הכלים תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ציפוי קצה מעוקל על ידי כיפוף קצה צהוב מעל מבער בונזן (להבה לזמן קצר בלבד, כדי למנוע התכה של פלסטיק!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הכמות המתאימה של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל פתרון מרובה ליזין על ידי דילול 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל מניות פתרון סטרילי עם H 2 O ultrapure. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי כל coverslip עם μl של 500 מיקרוגרם 20 / ml poly-ליזין דגירה במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל coverslip 3-5 פעמים עם 500 μl סטרילי H 2 O ultrapure כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מים coverslips; למלא צלחת עם כל 4 מ&quot;ל של מדיום L15-ASW תרבות. </li></ol> דיסוציאציה של תאים בשקית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לחתוך את הגנגליון בטן במחצית מספריים לנתיחה ו מלקחיים באמצעות ניקה בעבר עם אתנול 95% (איור 1 שורה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על חצי אחד של הגנגליון, לחתוך בין אשכול תיק התא בתאי hemiganglion (1 איור קו 2), לחתוך שלוחות העצבים שנותרו בצד השני של תאים שק (איור 1 שורה 3). עבודה על חצי אחד של גנגליון בכל פעם; לעזוב את החצי השני בצלחת ואילו תאים אשכול הראשונים הם להיות מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בשתי מלקחיים (או אחד מלקחיים ומספריים דיסקציה), תיק שחרור תא מצרר על ידי לחיצה בצד את מעטפת רקמת החיבור שסביב אשכול תא שקית. גזור משם רקמת חיבור במספריים לנתיחה במידת הצורך. היזהרו לא לסחוט ולגעת אשכול תא שקית יותר מדי במהלך תהליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר רוב רקמת החיבור מוסר, להעביר את bאשכול AG תא לצלוחית עבודה חדש עם קצה צהוב כפוף מוכן קודם לכן. היזהרו שלא להניח את האשכול תא שקית להיות לכוד בתוך קצה צהוב או תקוע ממשק האוויר / בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate אשכול עם קצה צהוב להסיר תאים תיק בודדים. לעשות זאת על ידי pipetting אשכול פנימה והחוצה של קצה. התחל עם כוחות גזירה נמוכים ולהגדיל כוח כנדרש. השתמש תמיד הכוח הנמוך ביותר הנדרש כדי להסיר את הנוירונים בלי להרוג תאים רבים מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 3-5 תאים בריאים שקית ולהעבירם צלחת עם coverslip poly-ליזין מצופה. הימנע להרים תאים מתים (הם שחור / שקוף במרכז) ופסולת רקמת חיבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 6. מקום על 15-25 נוירונים חיים למרכז coverslip כל אחד. אם תאים מתים או פסולת מועברים גם להסיר את החומר לא רצויות על ידי מרים אותו או לפוצץ אותו הרחק תאים בריאים. תהליך זה לוקח בערך 2-3 שעות אשכולות שניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם סיים לשמור את הכלים תרבות על הספסל תזרים לפחות 2 שעות RT כדי לאפשר לתאים לצרף (לשמור על הספסל את זרימת מפוח כדי למנוע רעידות לא רצויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים לתוך באינקובטור ב 14 מעלות צלזיוס למשך הלילה, או עד לשימוש נוסף. קונוסים הצמיחה עשויה להתפתח 40-10 שעות. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="באיור 1. סכמטי של הגנגליון californica Aplysia הבטן. קווי צבע לציין היכן לחתוך כדי להשיג תא אשכולות שקית." /> באיור 1. סכמטי של הגנגליון californica Aplysia הבטן. קווי צבע לציין היכן לחתוך כדי להשיג תא אשכולות שקית. יום 3: הגדרת תא הדמיה חיה של תאים Aplysia שקית האסיפה של הדמיה קאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש בתאי שקית ניסויים הדמיה לחיות התא, לבדוק תאים על מיקרוסקופ כוח נמוך. אם התאים לא פיתחו קונוסים צמיחה בריאה, אספקת אמצעי לעזוב טריים ב RT במשך 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לספק צלחות עם המדיום L15-ASW טריים, להסיר וחצי (~ 2ml) של המדיום הישן עם קו ריק, ולהוסיף 2 מ&quot;ל חדש L15-ASW בינוני לכל צלחת פטרי. חשוב לא להסיר לחלוטין את כל מדיום מן המנה בבת אחת, כמו זה יהיה להסיר תאים coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה תא שקית, אנחנו להרכיב two coverslips ושני מפרידי הפלסטיק בתא כריך דמוי הדמיה. Coverslip העליון הכריך הוא חתך קצר יותר, כדי לאפשר חילופי קל בינוני ריאגנטים. במהלך האסיפה, coverslips עם תאים בתיק המצורף צריך להיות שקוע בינוני L15-ASW בכל עת כדי למנוע מתאי פירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את החדר, לחתוך ~ 2 מ&quot;מ מן הצד הימני של מ&quot;מ coverslips # 1 22x22 עם יהלום עט (חותך זכוכית) השליט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל, למרוח משחה ואקום גבוה לשני הצדדים של coverslip הקצר, ולצרף מפרידי פלסטיק לכל צד. למרוח משחה ואקום לחלק העליון של מפרידי שניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך coverslip והרכבה spacer, ואת המקום לתוך צלחת פטרי המכילה תאים תיק על coverglass. יישר ולחץ בעדינות עד מקל coverslip coverslip מלמעלה למטה עם סיום הפוכה של שני Q-טיפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים הרכבה כריך מתוך צלחת פטרי ללא המדיום דולף החוצה. יישור שתי coverslips, במידת הצורך, ולנגב את עודפי בינוני עם Kimwipe. מניחים את הכריך על החלק התחתון של מחזיק שקופיות מיקרוסקופ ולצרף את המכסה עם טיפול באמצעות קליפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את מרכז בצד העליון של כריך עם Q-טיפים טפחה על לניקוי זכוכית (Sparkle משמש לניקוי זכוכית). יבש במהירות את מנקה זכוכית עם השני, יבש Q-טיפ להימנע קווי פס. לעשות את אותו הדבר עבור coverslip התחתונה. Coverslips נקי ללא קווי פס חשובים הדמיה באיכות גבוהה. </li></ol> תיק תאים המיקרוסקופ מאז תא Aplysia שקית תרבויות עצביים נמצאים בצפיפות נמוכה, עדיף אם ההתקנה מיקרוסקופ שלך יש מיצוב הבמה פונקציות כדי להקל על המעבר בין התאים. תאים תיק יכולים להישמר בקלות במשך כמה שעות על הבמה RT במהלך הניסויים הדמיה. הבורסה בינוני מעת לעת, כדי למנוע אידוי.

<ol><li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li>
<li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule%2C+apCAM%2C+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li>
<li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li>
<li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li>
</ol>

תא Aplysia נוירונים תיק לספק סרום ללא מערכת העצבית עם תרבית תאים לא עצביים תאים בודדים. נוירונים אלה מהווים קונוסים צמיחה גדול מאוד מתאים לכתובת מספר שאלות חשובות תא ביולוגי. תא עצב תיק יכול בקלות להיות מניפולציות צילמו בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM) אפשר כמותית לנתח את הפרמטרים השונים של אקטין-F ו פילמור microtubule ודינמיקה טרנסלוקציה. כלים אלה הדמיה יחד עם מידע שפורסמו לאחרונה הגנום Aplysia כמו גם טכניקות ביטוי משופר את הנוירונים האלה מערכת מודל עוצמה לחקר המנגנ...

<table><tbody><tr><td >זכוכית כיסוי #1, 22x22 mm</td><td >כלי</td><td >VWR international</td><td >48366067</td><td ></td></tr><tr><td >זכוכית כיסוי #1.5, 22x22 mm</td><td >כלי</td><td >Corning</td><td >2870-22</td><td ></td></tr><tr><td >צלח Petri diameters 35 mm</td><td >כלי</td><td >Falcon BD</td><td >353001</td><td ></td></tr><tr><td >מסננים לסינון מילה</td><td >כלי</td><td >EMD Millipore</td><td >SVGV010RS</td><td ></td></tr><tr><td >גריז לוואקום גבוה</td><td >כלי</td><td >Dow Corning</td><td >1597418</td><td ></td></tr><tr><td >אוסמומטר</td><td >כלי</td><td >Wescor</td><td >5520</td><td ></td></tr><tr><td >שימסים מפלסטיק</td><td >כלי</td><td >Small Parts, Inc.</td><td >SHSP-200</td><td ></td></tr><tr><td >Calcium chloride</td><td >ריאגנט</td><td >Fisher Scientific</td><td >C79-500</td><td ></td></tr><tr><td >Gentamicin</td><td >ריאגנט</td><td >Invitrogen</td><td >15750-060</td><td ></td></tr><tr><td >HEPES</td><td >ריאגנט</td><td >Sigma-Aldrich</td><td >H4030</td><td ></td></tr><tr><td >מילה L15</td><td >ריאגנט</td><td >Invitrogen</td><td >41300-039</td><td ></td></tr><tr><td >L-glutamine</td><td >ריאגנט</td><td >Sigma-Aldrich</td><td >G8540</td><td ></td></tr><tr><td >Magnesium chloride</td><td >ריאגנט</td><td >Mallinckrodt Baker Inc.</td><td >5958-04</td><td ></td></tr><tr><td >Magnesium sulfate</td><td >ריאגנט</td><td >Mallinckrodt Baker Inc.</td><td >6070-12</td><td ></td></tr><tr><td >Poly-L-lysine (70-150 kD) </td><td >ריאגנט</td><td >Sigma-Aldrich</td><td >P6282</td><td ></td></tr><tr><td >Sodium chloride</td><td >ריאגנט</td><td >Mallinckrodt Baker Inc.</td><td >7581</td><td ></td></tr><tr><td >פרוטאזה ניטרלית (Dispase)</td><td >ריאגנט</td><td >Worthington Biochemical</td><td >LS02111</td><td ></td></tr></tbody></table>

תא תרבויות העצבית מ aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

קונוסים הצמיחה העצבית הם מבנים ניעתי מאוד בקצה של אקסונים כי ניתן לזהות רמזים הדרכה הסביבה transduce מידע זה לתנועה כיוונית לכיוון תא היעד המתאים. כדי להבין כיצד מידע והדרכה מועבר מתא השטח לרשתות הבסיסית cytoskeletal דינמי, צריך מערכת מודל מתאים הדמיה תא חי של הדינמיקה חלבון ברזולוציה של זמן ומרחב גבוהה. טיפוסית גביעי צמיחה חוליות קטנים מדי כדי לנתח באופן כמותי F-אקטין ודינמיקה microtubule. נוירונים של ארנבת ים Aplysia californica לפעמים 5-10 גדול יותר נוירונים החוליות, יכול בקלות להיות כל הזמן בטמפרטורת החדר הם תאים חזקים מאוד המיקרומניפולציה מדידות biophysical. קונוסים הצמיחה שלהם הגדירו מאוד אזורים cytoplasmic ומערכת היטב תיאר cytoskeletal. גופי התא העצבי יכול להיות microinjected עם מגוון רחב של בדיקות לחקר חרוט צמיחה תנועתיות והדרכה. בפרוטוקול הנוכחי אנחנו מדגימים נוהל דיסקציה של הגנגליון הבטן, תרבות של נוירונים תא שקית והקמת תא הדמיה הדמיה תא חי של קונוסים צמיחה.

Aplysia נוירונים californica לפתח קונוסים צמיחה גדול בתרבות כי הם מעולה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צמיחה חרוט והדרכה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה ו ציפוי של תא עצב Aplysia התיק, כמו גם להקמת תא הדמיה תא חי.

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

קונוסי גדילה עצביים הם מבנים בעלי ניידות גבוהה הנמצאים בקצות האקסונים, המסוגלים לזהות רמזי הדרכה בסביבה ולהעביר מידע זה...

במעבדה הסימולטיבית, אנו מתרבים נוירונים של תאי גב מהרכיב הימי Plegia California car. נוירונים אלו מקימים קונוסי גדילה גדולים מאוד, מה שהופך אותם למערכת מודל טובה מאוד למחקרי רזולוציה גבוהה של ניידות והכוונה של קונוסי גדילה, ובמיוחד לניתוח דינמיקת השלד התאי. בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד לבצע דיסקציה של Plegia ותרבית של תאי גב.שלום, אני דניאל סוטר מהמחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת פורדו. היום נראה לכם את ההליך לביצוע דיסקציה, תרבית ודימוי של נוירונים מתאי הגיבייה של ה-spinal cord. נוירונים מה-hippocampus שימשו רבות למחקרי למידה וזיכרון.מכיוון של-Apia יש מערכת עצבים פשוטה ונוירונים גדולים המתאימים לאלקטרופיזיולוגיה, אנו משתמשים בנוירונים אלו במעבדה שלנו, כיוון שקונוסי הצמיחה שלהם גדולים ומתאימים מאוד לדימוי ברזולוציה גבוהה של דינמיקה של חלבונים הקשורה לניידות והנחיה של קונוסי צמיחה. הפרוצדורה המלאה כוללת את השלבים הבאים.ביום הראשון, בעל החיים מוקרב ומבוצע נתיחה כדי להוציא את הגנגליונים הבטניים. ביום השני, מוכנות פלטות תרבית. צבירי תאים מהגב מבודלים בנתיחה ונוירונים בודדים נזרעים בפלטה.ביום השלישי, נבנה תא דימות לצורך דימות של התאים בשיטת time-lapse באמצעות מיקרוסקופיית DIC (ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית), תוך הדגמה וקריינות. את ההליך היום תבצע iTune Lee, סטודנטית לדוקטורט במעבדתי. היא תראה לכם כעת כיצד להכין נוירונים של תאי רשת.נתחיל. נוירוני תאי השקיק (bag cell neurons) הם חלק מהגנגליון הבטני של מערכת העצבים של ה-plegia, לכן נבצע דיסקציה של הגנגליון הבטני כולו לצורך עיכול אנזימטי. לאחר מכן נפריד את שני צבירי תאי השקיק משאר הגנגליון.הגנגליון הבטני יעבור עיכול בתמיסת שלב שני זו למשך 15 עד 16 שעות כדי לרכך את רקמות החיבור. כעת עלינו להכין מזרק גדול של 60 milliliter מלא ב-0.5 molar של magnesium chloride לצורך הקרבת בעל החיים, וכן להכין כלי ניתוח נקיים: פינצטה אחת לניתוח, מספריים ומספריים גדולים. אנו משתמשים ב-plegia California car מחופי קליפורניה, השוקלים כ-150 grams.אנו מחזיקים את בעלי החיים במיכל ללובסטרים למשך שלוש עד ארבעה שבועות לכל היותר. מזריקים לבעל החיים תמיסת מגנזיום כלוריד לחלל הגוף, באזור הראש. עיסוי של בעל החיים מסייע בפיזור התמיסה ומונע ממנו להתכווץ.הקבע את בעל החיים בראשו ובזנבו למשטח סטירופום באמצעות מחטי מזריק. הרם את שרירי דופן הגוף בעזרת פינצטה אחת וגזור את חלל הגוף בעזרת מספריים גדולים. לאחר מכן, גזור את דופן הגוף לאורכה מהראש ועד הזנב והקבע את השריר למשטח.בשלב הבא, יש לאתר את הגנגליון הבטני מתחת לשחלה, שהיא איבר צהבהב דמוי מברשת. ניתן למצוא את הגנגליון הבטני. נתק את הגנגליון על ידי חיתוך העצבים בעזרת מספרי הניתוח בצד הקדמי ובצד האחורי של הגנגליון.לאחר מכן, העבירו את הגנגליון למבחנה המכילה 1 ml מהתמיסה שהוחלפה והניחו אותה במקלח מים בטמפרטורה של 22 °C למשך 15.5 שעות. במהלך אינקובציה זו, הרקמה החיבורית תתרכך עד לרמה שבה ניתן יהיה להסיר בקלות את מקבצי תאי הרקע. לפני תחילת תרבית תאי הרקע, נכין את לביבות הכיסוי שבהן יגודלו הנוירונים.אנו מתרבים נוירונים מהרשת התאית (cell neurons) על לוחות כיסוי מצופים בליונין בתוך צלחות פטרי של 35 מילימטר. לאחר מכן הם מוטבעים במצע L 15 A SW, שהוא מצע תרבית בעל ריכוז מלחים גבוה. עבור סוג זה של תאים, אנו מכינים בדרך כלל שמונה עד 10 צלחות פטרי עם לוחות כיסוי לכל בעל חיים.כעת נדון בכלים המשמשים לזריעת נוירוני תאי השקיק (bag cell neurons). לצורך דיסקציה של צבירי תאי השקיק, נזדקק לשלוש צלחות פטרי ללא לוחות כיסוי הממולאות ב-L 15 A SW, פינצטה עדינה ומספריים שעומסטרילו באלכוהול, וטיפ צהוב כפוף המחובר לפיפט P 20. הטיפ הצהוב נשרף על ידי העברה מהירה מעל להבת מבער בנזון, ולאחר מכן מכופף באמצעות פינצטה.היזהרו לא למעוך את החלק המכופף. אחרת, צביר תאי השקיקים של ה-plegia עלול להיתקע שם מאוחר יותר. ביצוע הדיסקציה והזריעה של תאי שקיקי ה-plegia נעשים בטמפרטורת החדר תחת מיקרוסקופ דיסקציה.כעת הסתיימה דגירה של האנזימים למשך 15.5 שעות, וניתן להעביר את הגנגליון הבטני (abdominal ganglion) ממרחב הדיסק לאחת מכלי העבודה המכילים מצע L 15 A SW. לפני שנראה כיצד מבודדים תאי שקיות (bag cells), נבחן תחילה את התרשים. כדי להמחיש כיצד מבוצע הניתוח של הגנגליון הבטני, נחתוך תחילה את הגנגליון הבטני דרך המרכז.כפי שניתן לראות מקו זה. לאחר מכן נבצע שני חתכים, אחד מלפנים ואחד מאחור. כך נוצר צביר, כפי שניתן לראות כאן.כעת, במבט דרך הסטראוסקופ, ניתן לראות כי הגנגליון הבטני חתוך במרכזו, ושני החתכים בוצעו לפני ואחרי צבר תאי השקיק (bag cell cluster). לאחר מכן, נשתמש בפינצטה כדי למצוא פתח ברקמת החיבור ונדחף בעדינות מטה את מעטפת רקמת החיבור העוטפת את צבר תאי השקיק. הסירו את רקמת החיבור מהצבר כחתיכה אחת במידת האפשר, באמצעות מספרי הניתוח.אך יש להיזהר לא לפגוע בצבר תאי השקיק. בעזרת מצע שנשאב לתוך טיפ כפוף, העבירו בעדינות את צבר תאי השקיק לכלי עבודה אחר. פזרו בעדינות את צבר תאי השקיק באמצעות טיפ צהוב כדי להפריד תאי שקיק בודדים מהצבר.כדי לעשות זאת, שאבו את הצביר לתוך קצה הפ pipette והוציאו אותו ללא יצירת בועות אוויר. העבירו תאים חיים מהצביר לצלחות המכילות לוחות כיסוי מצופים ב-poly. תאים מתים נראים שחורים במרכז, בעוד שתאים חיים נראים לבנים.חשוב למקם את התאים במרכז זכוכית הכיסוי לצורך מיקרוסקופיה ולהסיר כל שאריות תאים ותאים מתים בהקדם האפשרי. על ידי איסוף החומר הבלתי רצוי או נשיפתו, תאים בריאים ייצמדו במהירות לפלטת הפוליליזין. כ-15 עד 25 תאים על כל זכוכית כיסוי.לאחר שכל התאים מהצבר הראשון מומקו, מסירים את רקמת החיבור של הצבר השני וממשיכים באותו הליך זריעה של התאים. לאחר סיום העבודה עם כל הצלחות, יש להשאיב אותן בטמפרטורת החדר על השולחן למשך שעתיים לפחות כדי לאפשר לתאים להיצמד כראוי, תוך הימנעות מרעידות. לאחר מכן, מניחים את הצלחות על מגש קלקר או פלסטיק ומעבירים אותן לאינקובטור בטמפרטורה של 14 מעלות לפני השימוש הבא.בדרך כלל אנו מדמיינים את קוני הצמיחה של נוירונים יום או יומיים לאחר הזריעה. לצורך דימוי של דינמיקת קוני הצמיחה הנוירונליים לאורך זמן, אנו יוצרים תא דימוי קטן משתי זכוכיות כיסוי המופרדות על ידי מרווחים פלסטיים. על זכוכית הכיסוי התחתונה צמודים הנוירונים.לוחית כיסוי עליונה נחתכת לאורך קצר יותר באמצעות עט יהלום כדי לאפשר החלפה קלה של המדיום. עלבמת המיקרוסקופ, "סנדוויץ'" לוחות הכיסוי מונח בתוך מחזיק בהתאמה אישית לצורך התקנה על המיקרוסקופ. גריז ואקום גבוה המיועד לבמת מיקרוסקופ משמש להצמדת רכיבי התא ללא דליפה של המדיום. באמצעות מזרק קטן, מורח גריז ואקום גבוה על זכוכית הכיסוי העליונה, ולאחר מכן משתמשים בפינצטה למיקום המרווחים ומורחים מעט גריז ואקום מעליהם.לאחר מכן אנו מרים את כל המכלול, הופכים אותו ולוחצים בעדינות על זכוכית הכיסוי כאשר התאים עדיין טבולים בצלחית. השתמשו במקלוני צמר גפן כדי ליישר את זכוכית הכיסוי וללחוץ על זכוכית הכיסוי העליונה מבלי לשבור אותה. לאחר מכן אנו מוציאים בזהירות את ה"סנדוויץ'" מהצלחית, מנגבים שאריות של מצע גידול ומניחים אותו על בסיס המחזיק.הנח את ה"סנדוויץ'" במחזיק מבלי לסדוק את זכוכית הכיסוי באמצעות לחץ. נקה את שתי זכוכית הכיסוי עם חומר ניקוי זכוכיות מסוג sparkle באמצעות מקלוני צמר גפן (Q-tip); אנו מעדיפים להשתמש ב-sparkle מכיוון שהוא משאיר פחות סימנים על הזכוכית. נקה את זכוכית הכיסוי בתנועות סיבוביות מהמרכז כלפי חוץ, ובמידי לאחר מכן העבר מקל צמר גפן יבש כדי למנוע סימנים.זכוכית מכוסה ונקייה היא חשובה מאוד להדמיה באיכות גבוהה, במיוחד עם אופטיקת DIC. תרביות נוירונים של תאי גב הם תרביות בצפיפות נמוכה, לכן זה יעזור מאוד אם למיקרוסקופ שלכם יש פונקציות מיקום של הבמה למעבר קל בין תאים שונים. כעת אנו מוכנים לצפות במורפולוגיית הגדילה ובניידות.אנו מדמיים את הצמיחה בהיבטי המורפולוגיה והניידות באמצעות דימוי רב-זמני (time-lapse) ברזולוציה גבוהה במיקרוסקופיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, DIC. דימויי DIC שימושיים ליישום זה מכיוון שהם מספקים מבט על פני השטח של מבנה קו הצמיחה בסרטון ה-DIC time-lapse זה. ניתן לראות בבירור את שלושת הדומיינים של קו צמיחה טיפוסי.הדומיין ההיקפי המורכב מ-affect enrich la mela podia, ו-op podia. אזור המעבר המאופיין בפעילות ruffling והדומיין המרכזי המכיל בעיקר microtubules ואורגנלות. כדי לחקור את מנגנוני הניווט של קונוס הצמיחה, פיתחנו את בדיקת ה-RBI (restrained bead interaction).מיקרו-חרו지를 מצופים בחלבוני artesian משמשים לחיקוי של תת-מנויים תאיים. בסרטון ה-DIC בשיטת time-lapse, החרוז מונח על הדומיין ההיקפי של קונו הצמיחה באמצעות מיקרו-מחט. ניתן להבחין באפקט רטרוגרדי ובזרימה באמצעות גלים הנעים באופן רטרוגרדי בדומיין המרכזי.אברונים נעים על גבי מיקרוטובוליים. לאחר תקופה ראשונית שבה לא חלים שינויים משמעותיים, ניתן להבחין בתנועה קדימה פתאומית של גבול הדומיין המרכזי לעבר החרוז המעוכב. ניתן להבחין בצמיחה של מקדימה (leading edge) ובעלייה במתיחות, שגורמות בנוסף להחלשת הזרימה ולהתארכות המיקרוטובוליים, ספציפית לאורך ציר האינטראקציה עם החרוד.כדי לנתח את הדינמיקה של השלד התאי בקוני גדילה, אנו משתמשים במיקרוסקופיית נקודות פלואורסצנטיות (fluorescent speckle microscopy). אנו מזריקים במיקרו-הזרקה גששים של טובולין ואקטין המסומנים בפלואורסצנציה אל גוף התא העצבי ומקליטים סרטי time-lapse. מתוך התנועות הדינמיות של השלד התאי, האקטין המוצג באדום נבנה לאורך הקצה המוביל, מועבר לאחור על ידי זרימה רטרוגרדית וממוחזר באזור המעבר.מיקרוטובוליים דינמיים המוצגים בירוק חקרו את פריפרית קו הגדילה באמצעות שילוב של התנהגות הרכבה ותעתוע. הכמות הנמוכה של הסימון גורמת לתבנית המנוקדת, המאפשרת לנו לנתח כמותית את הפרמטרים השונים של דינמיקת השלד התאי. הצגנו בפניכם כיצד לבצע דיסקציה של תאי פלגיה, תרבית והדמיה אם תרצו לבצע הדמיה ברזולוציה גבוהה של קוני גדילה עצביים.זוהי באמת המערכת המומלצת לשימוש בשל גודלם הרב של קוני הצמיחה, האזורים הציטופלזמיים המוגדרים והשלד התאי המתואר היטב. זהו כל השלב. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

neuronal-cell-cultures-from-aplysia-for-high-resolution-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הכנת Aplysia חושי, מנוע תא תרבויות העצבית

בסרטון הזה אנחנו מדגימים להדמיה טרנסלוקציה של PKC בתאים חיים באמצעות PKCS מתויג fluorescently.

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

אנו מראים כיצד שינויים בריכוז התאי החופשיים הסיד ויעילות הסינפטית ניתן לפקח במקביל בהכנה של...

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; Aplysia</em

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

סרטון זה מדגים הערכה חוץ גופית של קריסת חרוט גדילה עצבי על ידי צברי עמילואיד-β (Aβ). טיפול בנוירונים עם אגרגטים Aβ גורם לערעור יציבות השלד הציטו-שלד, מה שמוביל לקריסת מדוכי צמיחה בקצה האקסונים. התאים המטופלים מושווים לתאי ביקורת כדי להעריך את מידת קריסת חרוט הגדילה.

הערכה חוץ גופית של β עמילואיד מצטבר על קריסת חרוט גדילה עצבי

אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת...

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

חילזון ימי Aplysia californica כבר בשימוש נרחב כמודל נוירוביולוגיה למחקרים על בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות. כאן מתוארת מתודולוגיה לחקר מערכת העצבים של Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים של מעגלים עצביים מזוהים.

אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

הליך זה מתאר כיצד במהירות ליזום, להרחיב ולחבר neurites מאורגן בתאי microfluidic באמצעות poly-D- ליזין מצופה חרוזים קבוע micropipettes כי מדריך התארכות neurite.

Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית

כאן, תיארנו פרוטוקול כדי לחקור כמותית את ההרכבה והמבנה של קטעים ראשוניים אקסון (AIS) של נוירונים היפוקמפוס חסר AIS מורכב מראש בשל היעדר ankyrin-G ענק.

שימוש בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי לחקור את ההרכבה של מקטעים ראשוניים של אקסון

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

למדו שיטה לתרבית נוירוני תאי שקית מ-Aplysia californica לדימוי ברזולוציה גבוהה של קונוסי צמיחה גדולים. פרוטוקול זה מאפשר חקר דינמיקת ציטוסקלט ותנועתיות נוירונלית בביולוגיה התפתחותית.

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

גלה סרטונים נוספים