Name: טרנספורמציה והתחדשות של שורשים שעירים ב-Arabidopsis thaliana וב-Brassica napus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: חקור פרוטוקול יעיל להתחדשות שורשים שעירים ב-Arabidopsis thaliana וב-Brassica napus. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר של תכונות גנטיות וקידום מחקר גנטיקה צמחית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ל-Jiří Macas (המרכז הביולוגי CAS, České Budějovice, צ'כיה) על אספקת הזן האגרובקטריאלי. מדעי צמחי מתקן הליבה של CEITEC MU מוכרים בזכות התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך, הנוער והספורט של הרפובליקה הצ'כית עם הקרן האירופית לפיתוח אזורי - פרויקט "SINGING PLANT" (לא. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) ופרויקט INTER-COST LTC20004.

השראת שורשים שעירים בתיווך אגרובקטריום והתחדשות בצמחים

<ol><li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+binary+vectors+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).</li>
<li>Christey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Ri-mediated+transformation+for+production+of+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Plant%22%5BJournal%5D)">Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-Mediated+Plant+Transformation%3A+the+Biology+behind+the+%E2%80%9CGene-Jockeying%E2%80%9D+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).</li>
<li>Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+transformed+roots%3A+from+plant+disease+to+biotechnological+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource.</a> Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).</li>
<li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+cultures%E2%80%94a+versatile+tool+with+multiple+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root cultures—a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).</li>
<li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+planta+hairy+root+transformation%3A+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044(2022).</li>
<li>Petit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+extension+of+the+opine+concept%3A+plasmids+in+Agrobacterium+rhizogenes+cooperate+for+opine+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation.</a> Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).</li>
<li>Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOzyigit%2C+II+%22Crop+improvement%22">Crop improvement</a>. , Springer. Boston, MA. (2013).</li>
<li>Jedličková, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR%2FCas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+%28Brassica+napus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290(2022).</li>
<li>Steinbauerová, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li>
<li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromeres+off+the+hook%3A+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li>
<li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22(2023).</li>
<li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+transgenic+kale+%28Brassica+oleracea+var.+acephala%29%2C+rape+%28B.+napus%29+and+turnip+%28B.+campestris+var.+rapifera%29+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li>
<li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+%28Brassica+oleracea+and+B.+campestris%29+via+Ri-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי המחקר נערך ללא כל יחסים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

פיתחנו פרוטוקול פשוט להתמרת שורשים שעירים והתחדשות לאחר מכן ב-B. napus וב-A. thaliana. תהליך זה כולל השראת שורש שעיר על בסיס הזרקה בהיפוקוטיל (B. napus) או בגזע התפרחת הראשוני (A. thaliana). השיטה של הזרקת hypocotyl עם זן אגרובקטריאלי C58C1 הנושא פלסמיד Ri היה יעיל גם במשפחת Fabaceae10,11, מלבד חברי Brassicaceae שהוצגו במחקר זה.
חלופה לשיטה מבוססת הזרקה היא טרנספורמציה מבוססת טבילה המורכבת מטבילה explant בתרחיף חיידקי, ואחריו טיפוח משותף של explant עם אגרובקטריה. היתרון של השיטה מבוססת ההזרקה על פני שיטת הטבילה הוא הזמן שנחסך על ידי היעדר כמה שלבי פרוטוקול: הכנת אקספלנט, בדיקת זמן הטיפוח המשותף, ותרבית על מדיום המכיל הורמון להשראת שורשים שעירים. למרות ששתי הגישות יעילות להשראת שורשים שעירים, יעילות טרנספורמציה גבוהה יותר נצפתה במינים מסוימים בשיטה מבוססת הזרקה בהשוואה לטבילה בצמח12,13. יתר על כן, טרנספורמציה מבוססת הזרקה שימושית גם ליצירת צמחים מרוכבים (שורשים שעירים טרנסגניים ונבטים מסוג בר). לאחר כריתת השורשים המקוריים של הצמח שעבר טרנספורמציה, שורשים שעירים תומכים בצמיחת הצמח, וניתן לחקור את הטרנסגן בהקשר של הצמח כולו.
השלב הקריטי של השראת שורש שעיר הוא הזרקת האינקולום לתוך ההיפוקוטיל או גזע התפרחת הראשוני. ההיפוקוטיל של B. napus ניתן לשבירה, וחיתוך ההיפוקוטיל כולו יכול לקרות בקלות. אותו הדבר ניתן לראות עם A. thaliana בגלל דקיקות גזע התפרחת. אם נדרשת השוואה של יעילות הטרנספורמציה של זנים / זנים שונים, אנו ממליצים לאדם אחד לבצע את כל הניסויים כדי למנוע את השגיאה הנגרמת על ידי מניפולציה ומיומנות בהזרקת הצמחים.
פיתחנו פרוטוקול יעיל להתחדשות שורשים שעירים ב-B. napus DH12075 וב-A. thaliana Col-0. מכיוון שהתחדשות היא תהליך משתנה מאוד, כמה שינויי פרוטוקול עשויים להיות מיושמים על מין או זן לפי בחירה. לדוגמה, הנבטים השעירים שמקורם בשורש יכולים להיווצר על ידי יחס אוקסין/ציטוקינין שונה (1:1) ב-B. oleracea14. לחלופין, ניתן להשתמש בציטוקינין תידיאזורון במקום BAP, כמו במקרה של B. campestris שורשים שעירים15.
החדרות מרובות של T-DNA פלסמיד Ri לגנום הצמח מייצגות מגבלה פוטנציאלית של מערכת הטרנספורמציה וההתחדשות של השורש השעיר. במקרים כאלה, צמחים ללא TL/TR מפלסמיד Ri אינם נחשפים לאחר ניתוח הפרדה של שתילי T1. לכן, אנו ממליצים ליצור מספר קווי שורש שעירים עצמאיים עבור כל טרנסגן.
תרביות שורשים שעירים הן כלי רב עוצמה למחקרים תפקודיים גנטיים בעיקר בגלל התבססותן המהירה ותחזוקתן הזולה (אין צורך בהורמונים באמצעי הטיפוח). פרוטוקול זה מכסה את השיטות להשראת שורשים שעירים והתחדשות ב- B. napus ו- A. thaliana, שניתן להשתמש בהן כדי לחקור את הטרנסגן המעניין ישירות בתרביות שורשים שעירים, בהקשר של הצמח כולו באמצעות צמחים מרוכבים, או לאחר התחדשות הצמחים הטרנסגניים.

טרנספורמציה של צמחים היא צוואר הבקבוק של כל מחקר גנטי בביולוגיה של הצמח. חיידק הנישא בקרקע, Agrobacterium tumefaciens, נמצא בשימוש נרחב כאמצעי להעברת גנים על ידי טבילת פרחים או תרבית רקמות ליצירת טרנספורמנטים. A. tumefaciens מדביק צמחים באתר פציעה וגורם לגידולים עקב העברה ואינטגרציה של T-DNA מפלסמיד גורם גידול (Ti) לגנום הצמח המארח. זני A. tumefaciens מהונדסים עם פלסמיד Ti שונה ללא T-DNA מסוג פראי ווקטור בינארי עם T-DNA מלאכותי ואתרי שיבוט להחדרת גן מעניין משמשים בדרך כלל כמערכת טרנספורמציה יעילה של צמחים1. עם זאת, מינים וגידולי מודל רבים עקשנים לטבילה פרחונית או התחדשות צמחים במבחנה או שיש להם מחזורי צמיחה ארוכים, מה שמשפיע על היעילות של מערכת טרנספורמציה זו.
קנה שורש אגרובקטריום גורם להיווצרות שורשים הרפתקניים, או שורשים שעירים, באתר הפציעה לאחר הדבקת צמח פונדקאי. בדומה ל- A. tumefaciens, A. rhizogenes מעביר T-DNA מפלסמיד השראת שורש (Ri) לגנום הצמח המארח, וגורם להתפתחות שורשים שעירים טרנסגניים. תהליך זה נשלט בעיקר על ידי הגנים השורשיים האונקוגניים (rol) 2,3. באמצעות זנים אגרובקטריאליים הנושאים הן את פלסמיד Ri והן וקטור בינארי מלאכותי המקודד גן מעניין, תרביות שורש שעירות שימשו לייצור חלבונים רקומביננטיים, ניתוח תפקודם של מקדמים או גנים, או עריכת גנומים באמצעות Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
הפרוטוקול שלנו משתמש בזן טרנס-מצומד Ti-less A. tumefaciens C58C1 הנושא את פלסמיד Ri pRiA4b7. T-DNA של פלסמיד Ri מורכב משני אזורים, T-DNA ימין ושמאל (TR-DNA ו- TL-DNA, בהתאמה), שיכולים להשתלב באופן עצמאי בגנום הצמח8. תוך ניצול מערכת זו, תהליך הטרנספורמציה הארוך של explant ב-Brassica napus DH12075 cultivar עבר אופטימיזציה9. הפרוטוקול המפורט להלן מאפשר התחדשות של קווי שורשים שעירים נבחרים וקבלת צמחי T1 הנושאים את הטרנסגן המעניין וללא גנים של רול תוך כשנה. ניתן להשתמש בטרנספורמציית שורש שעיר מבוססת הזרקה במינים אחרים של Brassicaceae, כפי שמוצג על ידי שינוי Arabidopsis thaliana Col-0. בעוד hypocotyl משמש כדי להפוך B. napus, A. thaliana מוזרק לתוך גזע התפרחת הראשוני.

<table><tbody><tr><td>צינורות 1.50 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>125.215</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה של 10% של אקונומיקה מסחרית&nbsp;</td><td>SAVO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-חומצה נפתלינאצטית (NAA)&nbsp;</td><td>Duchefa</td><td>N0903</td><td>התחדשות יבלות בינוני</td></tr><tr><td>2.0 מ"ל צינורות</td><td>Eppendorf</td><td>108.132/108.078</td><td></td></tr><tr><td>3M קלטת מיקרופור</td><td>מיקרופור מיקרופור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine (BAP)&nbsp;</td><td>Duchefa</td><td>B0904</td><td>מדיום התחדשות יבלות, מדיום התארכות יורה&nbsp;</td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגר בקטריולוגי</td><td>HiMedia</td><td>RM201</td><td>LB</td></tr><tr><td>בינוני פפטון בקטריולוגי</td><td>אוקסואיד</td><td>LP0037</td><td>LB ו- YEB מדיה</td></tr><tr><td>תמצית בקר</td><td>Roth</td><td>X975.1</td><td>YEB בקבוקים</td></tr><tr><td>בינוניים</td><td>DURAN</td><td>L300025</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime נתרן</td><td>Duchefa</td><td>C0111</td><td>מדיום גידול שורש שעיר, מדיום התחדשות יבלות, מדיום התארכות יורה, מדיום אינדוקציה שורש</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Serva</td><td>3955301</td><td></td></tr><tr><td>CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide</td><td>Sigma</td><td>52365</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo) חומצה טטראצטית, מלח דיסודיום, דיהידראט</td><td>סיגמא</td><td>ES134-250G</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורציה קובטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופזיס אגר, peqGOLD אוניברסלי</td><td>VWR</td><td>732-2789</td><td></td></tr><tr><td>תא אלקטרופורזה</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קורא ג'ל אלקטרופורזה</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורטור GenePulser Xcell</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>קובטות אלקטרופורציה של AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser, פער של 0.2 ס"מ</td><td>BIO-RAD</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>Gene Ruler DNA Ladder mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0331</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ג'יברלית (GA3)</td><td>Duchefa</td><td>G0907</td><td>מדיום התארכות יורה&nbsp;</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (2-(4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיררזיניל)-אתנוסולפוניק</td><td>Merck</td><td>1101100250</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אינדול-3-בוטירית (IBA)</td><td>Duchefa</td><td>I0902</td><td>אינדוקציה שורש בינונית</td></tr><tr><td>קנמיצין מונוסולפט</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>קופסת גידול צמחים מג'נטה GA-7 עם מכסה</td><td>מדיה צמחית</td><td>V8505-100</td><td></td></tr><tr><td>צילינדר</td><td></td><td></td><td></td>מדידה</tr><tr><td>MES מונוהידראט</td><td>Duchefa</td><td>M1503</td><td>מדיום גידול שורש שעיר, מדיום התחדשות יבלות, מדיום התארכות יורה, מדיום אינדוקציה שורש, מדיום לנביטה, מדיום גידול צמחים</td></tr><tr><td>מדיום מוראשיג וסקוג (MS)</td><td>דושה</td><td>M0237</td><td>מדיום לנביטה, מדיום גידול צמחים</td></tr><tr><td>מדיום מוראשיג וסקוג (MS) + ויטמינים B5&nbsp;</td><td>Duchefa</td><td>M0231</td><td>מדיום גידול שורש שעיר, מדיום התחדשות יבלות, מדיום התארכות יורה, מחט בינונית אינדוקציה שורש</td></tr><tr><td>אגני 26 גרם x 1/2 - 0.45 x 13 מ"מ</td><td>מד</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>pH</tr> טרומו <tr><td>פיטגל</td><td>סיגמא</td><td>P8169</td><td>מדיום התחדשות יבלות, מדיום אינדוקציה שורש, מדיום לנביטה</td></tr><tr><td>PVP 40 (פוליוויניל פירולידון מר 40000)</td><td>סיגמא</td><td>9003-39-8</td><td></td></tr><tr><td>Redtaq DNA פולימראז, Taq עבור PCR שגרתי עם צבע אינרטי, 10X מאגר כלול</td><td>Sigma</td><td>D4309-250UN</td><td></td></tr><tr><td>Retsh mill</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Lachner</td><td>30093-APO</td><td>LB</td></tr><tr><td>בינוני מרובע פטרי צלחות</td><td>קורנינג</td><td>GOSSBP124-05</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פנטה</td><td>24970-31000</td><td>מדיום גידול שורש שעיר, מדיום התחדשות יבלות, מדיום התארכות יורה, מדיום אינדוקציה שורש, מדיום לנביטה, מדיום גידול צמחים</td></tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>קרל רוט</td><td>P666.1</td><td>מסנני מזרק רוטילבו 0.22 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>תרמו-מיקסר</td> בגודל נקבוביות <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ticarcillin דיסודיום</td><td>Duchefa</td><td>T0180</td><td>בינוני גידול שורש שעיר</td></tr><tr><td>Tris (hydroxymethyl) aminomethan</td><td>Serva</td><td>3719003</td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד</td><td>Millipore Milli-Q מים מטוהרים&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Duchefa</td><td>Y1333</td><td>LB בינוני</td></tr></tbody></table>

טרנספורמציה והתחדשות של שורשים שעירים ב-arabidopsis thaliana וב-brassica napus

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

טרנספורמציית שורשים שעירים מהווה כלי רב-תכליתי לביוטכנולוגיה של צמחים במינים שונים. זיהום על ידי זן אגרובקטריום הנושא פלסמיד השראת שורש (Ri) גורם להיווצרות שורשים שעירים באתר הפציעה לאחר העברת T-DNA מפלזמיד Ri לגנום הצמח. הפרוטוקול מתאר בפירוט את הליך השראת השורש השעיר מבוסס ההזרקה ב - Brassica napus DH12075 ו - Arabidopsis thaliana Col-0. השורשים השעירים עשויים לשמש לניתוח טרנסגן מעניין או מעובד ליצירת צמחים טרנסגניים. מדיום רגנרציה המכיל ציטוקינין 6-בנזילאמינופורין (5 מ"ג/ליטר) וחומצה אוקסין 1-נפתלנאצטית (8 מ"ג/ליטר) מעורר בהצלחה היווצרות נבטים בשני המינים. הפרוטוקול מכסה את הגנוטיפ והבחירה של רגנרנטים וצמחי T1 כדי להשיג צמחים הנושאים טרנסגן מעניין וללא T-DNA מפלסמיד Ri . מתואר גם תהליך חלופי המוביל להיווצרות צמח מרוכב. במקרה זה, שורשים שעירים נשמרים על הנבטה (במקום השורשים הטבעיים), מה שמאפשר לחקור טרנסגן בתרביות שורשים שעירים בהקשר של הצמח כולו.

בעבר ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול להשראת שורשים שעירים מבוססי הזרקה בשלושה זנים של Brassica napus, כלומר DH12075, Topas DH4079 ו-Westar9. כדי ליישם פרוטוקול טרנספורמציה זה על מין המודל A. thaliana, גבעולי התפרחת העיקריים של צמחים בני חודש הוזרקו עם חיסון אגרובקטריאלי. שורשים שעירים הופיעו במקום ההזרקה לאחר 2-4 שבועות. שורשים שעירים נכרתו וטופחו על התווך המוצק. השוואת השיטה בשני המינים האלה מתוארת באיור 1.
קווי שורש שעירים נבחרים הועברו למדיום ההתחדשות כדי לגרום להיווצרות נבטים. ב- A. thaliana, קלי צהוב הושרה תוך 14 יום בכל 10 קווי השורש השעירים שנבדקו. פרימורדיה ראשונית שנראתה ככתמים ירוקים כהים הופיעה תוך 3 שבועות לאחר העברתה למדיום ההתחדשות (איור 2). לאחר 4 שבועות של תרבית, הנבטים כיסו את השורשים השעירים ב-9 מתוך 10 קווי שורש שעירים (יעילות התחדשות של 90%). במקרים מסוימים, שורשים הרפתקניים נבעו מהיבלת (איור 2H). קו אחד לא התחדש גם לאחר 3 חודשים במדיום ההתחדשות (כל 4 שבועות הועברו השורשים השעירים למדיום טרי). לפיכך, יעילות ההתחדשות של שורשים שעירים A. thaliana דומה ליעילות של B. napus DH120759.
מחדשים שורשים שעירים של B. napus ו-A. thaliana מציגים פנוטיפ ננסי (איור 3), מאפיין אופייני של צמחים שמקורם בשורש שעיר2. ראינו גם מערכות שורשים צפופות, עלים מקומטים ושינויים בזמן הפריחה. הפנוטיפ הזה שנקרא שורש שעיר (או Ri) נגרם על ידי הגנים רול מפלסמיד Ri המוחדרים לגנום הצמח. החדרת ה-T-DNA של Ri והטרנסגן המקודד על וקטור בינארי עשויים להיות עצמאיים או מקושרים. לפיכך, ניתוח הפרדה של צאצאי T1 שנוצרו על ידי האבקה עצמית מסייע לזהות צמחים נטולי רול המבטאים את הטרנסגן המעניין. גנוטיפ של צמחי T1 מבוצע על ידי פריימרים PCR ספציפיים עבור ORFs של TL ו- TR ואת הטרנסגן של עניין. היעדר זיהום אגרובקטריאלי מאומת על-ידי היעדר מוצרי PCR של פריימרים virC (איור 1).
<img alt="דיאגרמת טרנספורמציה, PCR, אינדוקציה של שורשים שעירים, גנוטיפ של צמח T1, ניתוח טרנסגנים פונקציונליים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: סיכום ההליך ב-A. thaliana וב-B. napus. הזרקת Agrobacterium inoculum בגזע היפוקוטיל או תפרחת ראשונית גורמת להתפתחות שורשים שעירים. השורשים השעירים יכולים להחליף את השורשים המקומיים וליצור צמח מרוכב שיעבור גנוטיפ וינותח (חיצים כחולים). שורשים שעירים מתורבתים יכולים להתחדש לצמחי T0, להתפשט בצמחי T1 ולבצע גנוטיפ (חיצים ירוקים). השורשים השעירים יכולים גם להיות תת-תרבית לצורך ניתוח פונקציונלי (חץ שחור). מוצגות דוגמאות לתוצאות גנוטיפ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="שלבי גידול תרבית רקמות צמחים; תמונות מיקרוסקופ במשך ארבעה שבועות המראות שינויים מורפולוגיים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: התחדשות שורשים שעירים ב-A. thaliana. (A) תרבית שורשים שעירים יום אחד לאחר העברתה לצלחות. (ב, ג) קאלי התפתחה תוך שבועיים מהתרבית במדיום ההתחדשות. (ד, ה) Shoot primordia יצא לאחר 3 שבועות של תרבות. (ז, ח) יורה נוצרים לאחר 4 שבועות. (H) שורשים הרפתקניים התפתחו מהיבלת. (ג, ו, ט) קו שורש שעיר שאינו מתחדש. פסי קנה מידה מייצגים 1 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="השוואת התחדשות Arabidopsis ו-Brassica napus; צמחים מסוג בר לעומת צמחים שמקורם בשורש שעיר." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: תמונות מייצגות של צמחי בר מסוג B. napus ו-A. thaliana ומחדשים שמקורם בשורשים שעירים (צמחי T0). שימו לב לפנוטיפ Ri של הרגנרנטים. פסי קנה מידה מייצגים 2 ס"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

הפרוטוקול מתאר השראת שורשים שעירים באמצעות גבעולי תפרחת ראשוניים Arabidopsis והיפוקוטיל Brassica napus . ניתן לגדל את השורשים השעירים ולהשתמש בהם כצמחים להתחדשות צמחים טרנסגניים.

טרנספורמציה והתחדשות של שורשים שעירים ב-Arabidopsis thaliana וב-Brassica napus

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

המחקר שלנו נועד לפתח פרוטוקול לשינוי יעיל ב Brassicaceae. באמצעות טרנספורמציה מבוססת שורש שיער, שיפרנו באופן דרמטי את יעילות השינוי ב- Brassica napus, שהיא חיונית למחקר שלנו. בדקנו את הפרוטוקול גם במין מודל Arabidopsis thaliana.ביצענו אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור זני אביב DH12075 ב-Brassica napus. האתגר הבא הוא לייעל את פרוטוקול הטרנספורמציה וההתחדשות של זני החורף ב-Brassica napus, כמו גם עבור Brassica rapa ו-Brassica oleracea. שורשים שעירים יכולים להתפשט בקלות, וצמיחתם המהירה מאפשרת ניתוח מהיר של הגן המעניין זמן קצר לאחר הטרנספורמציה.כתוצאה מכך, ניתן ליצור מחדש באופן סלקטיבי קווי שורש שעירים ספציפיים המציגים את התכונה הרצויה. לדוגמה, מוטציה גנטית שהוצגה על ידי CRISPR-Cas.

hairy-root-transformation-regeneration-arabidopsis-thaliana-brassica

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שינוי בתיווך Agrobacterium באמצעות שיטת פרחוני-מח ש יכול להיות מועסק בהצלחה כדי ליצור שורות הטרנסגניים יציב של המודל extremophyte Schrenkiella parvula. אנו מציגים פרוטוקול שונה מזו עבור תודרנית לבנה, בהתחשב גידול שונים והרגלי הפיזיולוגיות של extremophyte.

צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula

אנו מתארים שיטה של גרימת שורשים שעירים על ידי Agrobacterium ריזוגנים-שינוי מתווך של כוסמת טרארי (Fagopyrum tataricum). זה יכול לשמש כדי לחקור פונקציות גן וייצור של מטבוליטים משני ב כוסמת טרארי, להיות מאומץ עבור כל שינוי גנטי, או משמש צמחי מרפא אחרים לאחר שיפור.

שורש שעירים על ידי Agrobacterium ריזוגנים-שינוי מתווך בתוך הטאררי כוסמת (Fagopyrum טאטארנום)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של שורשים שעירים סויה מהונדסים.

טרנספורמציה של שורש סויה שעיר לניתוח תפקוד גנים

כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול המפורט של שיטת טרנספורמציה חד-שלבית בתיווך Agrobacterium tumefaciens לייצור צמחים מרוכבים.

שיטה יעילה וניתנת לשחזור לייצור צמחים מרוכבים על ידי טרנספורמציית שורשים שעירים מבוססי קנה שורש אגרובקטריום

אנו מציגים פרוטוקול יעיל ואופטימלי לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריה של מין דו-חיים אל-מיני, Rorippa aquatica, ללא הליכים עתירי משאבים של תרבית רקמות סטריליות. באמצעות סמן טרנספורמציה חזותי וצינור התחדשות של הכדורים נוצרו בהצלחה טרנספורמנטים קרובים לשיבוטים, ובכך קידם את המחקרים העתידיים של הסתגלות הצמח לסביבה התת-ימית.

טרנספורמציה יעילה בתיווך אגרובקטריה מבוססת רגנרציה של מין דו-חיים א-מיני, Rorippa aquatica

וידאו זה מציג את נוהל בידוד protoplasts שלם מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס. בהתחשב בכך protoplasts מבודדים נותרו על כנן לפחות 96h והם מבודדים שתילים במקום אחד בן חודש צמחים בוגרים, הליך זה מזרז מבחני המחייב protoplasts ללא פגע.

בידוד של Protoplasts מרקמות של 14 יום בן שתילים של ארבידופסיס thaliana</em

הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

מאמר זה ממחיש את הפרחים, טובלים...

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

הרכב תמציות השומנים הקוטב הרכב חומצות שומן של glycerolipids הפרט נקבעים ניסוי פשוט חזקים פרופיל השומנים. לענין זה, glycerolipids מבודדים על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה נתונה transmethylation של קבוצות acyl שלהם. Methylesters acyl שומן הם לכמת ידי כרומטוגרפיה גז נוזלי.

Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח...

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

חקור פרוטוקול יעיל להתחדשות שורשים שעירים ב-Arabidopsis thaliana וב-Brassica napus. השיטה מאפשרת ניתוח מהיר של תכונות גנטיות וקידום מחקר גנטיקה צמחית.

טרנספורמציה והתחדשות של שורשים שעירים ב-Arabidopsis thaliana וב-Brassica napus

גלה סרטונים נוספים