יצירה וניתוח במורד הזרם של תעתיקים חד-תאיים וגרעינים בודדים באורגנואידים במוח
29 במרץ 2024
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירה וניתוח במורד הזרם של אורגנואידים במוח האנושי באמצעות ריצוף RNA חד-תאי וגרעין יחיד.
אנו מפתחים ומייעלים מודלים אורגנואידים על מנת ליישם אותם עבור מודלים של מחלות. מטרתנו היא להבין את המנגנון המולקולרי העומד בבסיס התפתחות המחלה והתקדמותה, ואנו עובדים בשיתוף פעולה הדוק עם מעבדת ניקולאוס רג'בסקי, המפתחת ומיישמת את הטכנולוגיות החד-תאיות והמרחביות כדי להבין כיצד הרנ"א מווסת את ביטוי הגנים בבריאות ובחולי. בשנים האחרונות, אורגנואידים במוח התפתחו כפלטפורמות ניסיוניות ותרגומיות לחקר מחלות ספציפיות לחולה.
לכן, אין זה מפתיע שרוב הפיתוחים האחרונים נועדו לשפר את המורכבות של מודלים אורגנואידים במוח. לדוגמה, כיום אנו מסוגלים לייצר אורגנואידים ספציפיים לאזור המוח וגם להשתמש באורגנואידים במוח עבור הרכבות מרובות אורגנואידים. כמו כן, שיטות שונות יושמו כדי להחדיר כלי דם ותאים חיסוניים לתוך אורגנואידים במוח.
כיום, אחת הטכנולוגיות המתקדמות ביותר במחקר שאנו משתמשים בהן במעבדה זו היא שעתוק מרחבי, המאפשר הערכה של ביטוי גנים בתוך רקמה שלמה. זה חיוני להבנת האופן שבו פרופילי ביטוי גנים של סוגי תאים שונים משתנים באזורים שונים ברקמה אחת. התקדמות נוספת שנעשתה לאחרונה היא מולטיומיקה של תא יחיד, המאפשרת ניתוח של מודולים מרובים של תא בודד, מה שנותן גישה הוליסטית יותר בניתוח תאים אלה.
אנו משתמשים באורגנואידים במוח ובשיטות שעתוק חד-תאי ומרחבי כדי להבין מנגנונים בסיסיים של מחלות אנושיות כגון תסמונת לי ודלקת המוח של הרפס סימפלקס. יתר על כן, פיתחנו שיטות תעתיק מרחבי ברזולוציה גבוהה וחסכונית הנקראות Open-ST. השווינו וביצענו אופטימיזציה של שיטת ריצוף הרנ"א של תא בודד וגרעין בודד כדי להבין עד כמה הם מתפקדים לגבי התאוששות סוג התא ברקמת אורגנואיד במוח.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף ליצירת אורגנואידים של מוח אנושי ולניתוחם באמצעות ריצוף RNA של תא בודד (single-cell RNA sequencing). המחקר שואף לשפר את מידול המחלות באמצעות טכניקות מתקדמות של אורגנואידים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- טכנולוגיית אורגנואידים
- ריצוף RNA
רקע
- אורגנואידים של המוח משמשים כפלטפורמות לחקר מחלות ספציפיות לחולה.
- התפתחויות אחרונות מתמקדות בהגברת המורכבות של מודלים של אורגנואידים.
- שיתוף פעולה עם המעבדה של Nikolaus Rajewsky משפר את ההבנה של ויסות RNA.
- ניתן לייצר אורגנואידים המייצגים אזורי מוח ספציפיים.
מטרת המחקר
- פיתוח מודלים של אורגנואידים לצורך מידול מחלות.
- חקירת מנגנונים מולקולריים של התפתחות והתקדמות מחלות.
- שיפור המורכבות של מודלים של אורגנואידים של המוח להשגת תוצאות מחקר טובות יותר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת אורגנואידים של מוח אנושי.
- ריצוף RNA של תא בודד לצורך ניתוח.
- שיתוף פעולה עם מעבדות מתמחות לטכניקות מתקדמות.
- הרכבות של מספר אורגנואידים למחקרים מקיפים.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של אורגנואידים ספציפיים לאזורי מוח.
- הבנה מעמיקה יותר של תפקיד ה-RNA בביטוי גנים.
- פיתוח מערכות של מספר אורגנואידים למידול מחלות מורכבות.
- תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים של מחלות.
מסקנות
- אורגנואידים של המוח הם בעלי ערך רב לחקר מנגנוני מחלה.
- מודלים מתקדמים של אורגנואידים יכולים להוביל להבנה טובה יותר של מחלות.
- שיתוף פעולה ושילוב טכנולוגי הם מפתחות להקדמה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
טרנסקריפטומיקה של תא בודד וגרעין בודד באורגנואידים של המוח מאפשרת מיפוי ברזולוציה גבוהה של הגיוון התאי והביטוי הגנטי, ובכך תומכת ישירות במידול מחלות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בנוירוביולוגיה. גישות אלו מספקות ביטחון חיזוי עבור תיקוף מטרות ובדיקת מסלולים בשלבי הגילוי המוקדמים, במיוחד עבור רקמות מורכבות והטרוגניות. שילוב של שיטות אלו בתהליכי מו"פ מאיץ תובנות טרנסלטוריות וקבלת החלטות בתיקי פיתוח מותאמות סיכון לגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מסלולים רלוונטיים למחלה והטרוגניות תאית במודלים של מוח ממקור אנושי.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי הפרדה של סוגי תאים עצביים ולא-עצביים ברזולוציית תא בודד.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי קישור פרופילים של ביטוי גנים לפנוטיפים של מחלה.
- משפר את רמת הוודאות החיזויית עבור קידום מטרות במסלול הגילוי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות אורגנואידים שעברו תיקוף עבור סריקת תרכובות המשך וגנומיקה פונקציונלית.
- מסטנדרט את פרוטוקולי הדיסוציאציה והבידוד של הגרעינים כדי להבטיח הדירות ותוצאות כמותיות.
- מאפשר תהליכי הכנת ספריות וריצוף ניתנים להרחבה לצורך ניתוח בספיקה גבוהה.
- מספק מערכי נתונים חסונים להערכה מהימנה של התערבויות מועמדות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מבצע התאמה בין פרופילים טרנסקריפטומיים של אורגנואידים לבין סמנים ביולוגיים רלוונטיים למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- תומך במידול של הפרעות במערכת העצבים המרכזית (CNS) הספציפיות לחולה ולאזור בהקשרים פרה-קליניים.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי קידום מבוסס התאמה לסיכון, על ידי קישור מנגנונים מולקולריים לתוצאות פנוטיפיות.
- מאפשר שילוב של מולטי-אומיקה (multi-omics) וטרנסקריפטומיקה מרחבית לצורך מידול מקיף של מחלות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
טרנסקריפטומיקה של תא בודד וגרעין בודד ממצבת את האורגנואידים של המוח כגשר השובר את הדרך מגילוי ראשוני, דרך זיהוי מועמדים פוטנציאליים, ועד לתיקוף פרה-קליני במחקר של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי פענוח ביטוי גנים ספציפי לסוג התא.
- סריקה: מספק פלטים טרנסקריפטומיים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות ותיעדוף תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מערכי נתונים רב-ממדיים לצורך ניתוח השוואתי של תנאי ניסוי ומודלים של מחלות.
- מחקר תרגומי: מתאים חתימות מולקולריות באורגנואידים לביומרקרים קליניים לשיפור הרלוונטיות התרגומית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר למודלים מגוונים של מחלות CNS ומחקרים מכניסטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של פרוטוקולים לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מחקר.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וניהול תיק פרויקטים יעיל מבחינת הון.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום תוכניות CNS.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות אורגנואידים, דיסוציאציה ותהליכי ריצוף של תא בודד או גרעין בודד.
- דורש גישה לפלטפורמות ריצוף מבוססות מיקרופלואידיקה ותשתית אנליטית מתקדמת.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולים בין צוותים כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- עשוי לדרוש התאמה עבור מודלים שונים של אורגנואידים או הקשרי מחלה שונים.
- תלוי בהכנת דגימות באיכות גבוהה כדי להבטיח ניתוח איתן בשלבים הבאים.
