Name: בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: למדו את שיטת בידוד תאי גליית גליה ראשוניים מרשתית העכבר באמצעות טריפסין ותרבית תאים. פרוטוקול זה מאפשר חקר תפקיד התאים במחלות רשתית ופיתוח מטרות טיפוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לעיניים (NEI), המכון הלאומי לעיניים (NEI) קרן R01 EY029751-04. ברצוננו להודות לד"ר סילביה ב. סמית מכיוון שפרוטוקול זה שונה בגרסה בהתבסס על הפרוטוקול שלה לבידוד תאי מולר.

כל הניסויים בבעלי חיים תאמו את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ונעשו בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים שלנו שאושר על ידי ועדת המכון לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ומדיניות אוניברסיטת אוקלנד (פרוטוקול מספר 2022-1160)
1. הכנת מדיה ופתרונות
<ol><li>הכן את תמיסת העיניים של תאי Müller על ידי השלמת Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, פרטים בטבלת החומרים) עם פניצילין/סטרפטומיצין בדילול של 1:1000. לדוגמה, עבור 10 מ"ל של DMEM, להוסיף 10 μL של פניצילין/סטרפטומיצין. הערה: זוהי מדיה פשוטה ללא סרום שהוכנה. כמו כן, חממו את המדיה המלאה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש בה לעבודות תרבית תאים.</li>
	<li>הכינו מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא על ידי תוספת DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS, מומת חום), ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לדוגמה (500 מ"ל של מדיה DMEM + 50 מ"ל של FBS + 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין).</li>
	<li>הכינו תמיסת טריפסין-EDTA 0.05% עם Collagenase IV בריכוז של 200 U/mL (טריפסין-EDTA משמש להמסת הכמות המחושבת של אבקת Collagenase IV כדי להגיע לריכוז הדרוש).</li>
</ol>2. חינוך
<ol><li>המתת חסד אתית של העכבר באמצעות שאיפת CO2 בהתאם להנחיות IACUC.<ol><li>בקצרה, הניחו את בעלי החיים בתא CO2 כדי להחדיר 100% CO2 בקצב מילוי של 30-70% מהנפח של התא עם CO2 כדי להשיג את המטרה של חוסר הכרה מהיר תוך 2-3 דקות עם מצוקה מינימלית לעכברים.</li>
		<li>מכיוון שהעכברים נמצאים בגיל צעיר (~10 ימים), בצעו פריקת צוואר הרחם כשיטה משנית כדי להבטיח המתת חסד נאותה.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר עיקור אזור העבודה עם 70% אתנול, הניחו את העכבר על כרית תחתונה סטרילית.</li>
	<li>חלץ את העיניים על ידי הנחת זרועות הפינצטה בחלק האחורי של העין, משיכה עדינה מאזור המסלול, והפעלת העיניים על ידי הפעלת לחץ עם פינצטה בסגנון 5/45 לאזור המסלול כדי לגרום לפרופטוזיס. הערה: יש לעקר את כלי הדיסקציה עם 70% אתנול ולאחר מכן מלח חיץ פוספט לפני הנתיחה.</li>
	<li>ודא כי עצב הראייה עדיין מחובר לעין על ידי enucleating העין לאט. הקפד למשוך את עצב הראייה (מזוהה חזותית כחוט לבן) מאחורי העין. הערה: שלב זה אינו חייב להתבצע תחת מיקרוסקופ, וניתן לבצע אותו על ספסל מעוקר.</li>
</ol>3. טיפול בעיניים הלומדות
<ol><li>כסו צינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל ברדיד אלומיניום ומלאו את הצינור ב-10 מ"ל של תמיסת העיניים של תא מולר.</li>
	<li>הניחו את העיניים המנותחות בצינור של 15 מ"ל המכיל תמיסת עיניים של תאי מולר ואפשרו להן לשבת למשך הלילה, או כ-18 שעות, בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר 18 שעות, לרוקן את תמיסת העיניים ולשטוף בקצרה את העיניים עם 2-3 מ"ל של מחומם (37 ° C) פוספט חוצץ מלוחים (PBS).</li>
	<li>דקרו את PBS והזיזו את העיניים לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה 10 מ"ל של תמיסת טריפסין. (הוכן בשלב 1.3). הערה: טריפסין משמש על כל העין enucleated, מתנהג כסוכן דיסוציאטיבי כדי להקל על הפרדת תאים משכבות הרשתית במהלך דיסקציה. ברשתית המנותחת יש תאים רבים, כולל תאי RPE, שהם דביקים ובעלי הסבירות הגבוהה ביותר לזהם את תרבית תאי מולר14. בדיקה מיקרוסקופית הראתה בבירור כי לאחר 5 ימי בידוד (במהלך שינוי המדיה הראשון), תאי RPE התנתקו מהצלחת ומתו13. המדיה המשמשת לבידוד RPE היא DMEM/F-12, בעלת הרכב שונה מ-DMEM (המשמש לבידוד תאי מולר), המכילה נתרן פירובט וגלוקוז נמוך.</li>
	<li>מניחים את המנה באינקובטור ודגרים במשך 1.5 עד 2 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.</li>
	<li>לאחר הדגירה, מעבירים את העיניים לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ המכילה כ-5 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא.</li>
</ol>4. דיסקציה
הערה: הליך זה חייב להתבצע בתוך הסביבה הסטרילית של מכסה המנוע. לפיכך, חיוני לעקר ביסודיות את משטחי מכסה המנוע עם 70% אלכוהול, יחד עם כל הכלים ומיקרוסקופ הדיסקציה. ראוי לציין כי הסרטון הוקלט מחוץ למכסה המנוע לצורך ראות טובה יותר ומטרות הדגמה ברורות יותר.
<ol><li>הניחו חתיכה קטנה של רקמה מעוקרת ברמת מעבדה בצלחת כדי לסייע בייצוב העיניים במהלך הנתיחה. הניחו את העיניים מתחת למיקרוסקופ מנתח כדי להתחיל את הדיסקציה. הערה: השימוש ברקמה ברמת מעבדה מאפשר תמרון של העיניים בכלי מלא נוזל (מדיה שלמה), ומבטיח דיסקציה מדויקת.</li>
	<li>השתמשו במספריים של Vannas ובפינצטה בסגנון M5S כדי להסיר את רקמת החיבור, השרירים החוץ-עיניים ועצב הראייה.<ol><li>תפסו את העין בפינצטה בסגנון M5S ובצעו חתך באזור האורה-סראטה בעזרת מספריים של Vannas או מחט של מזרק. הערה: קיים קו מעגלי בצבע תכלת בין החלק הקדמי והאחורי של העין הנקרא אורה סראטה (ora serrata), אשר יכול לשמש כנקודת ציון לכיווני מדויק במהלך הדיסקציה.</li>
		<li>אחזו את החתך בפינצטה בסגנון M5S ומשכו או קרעו את הקרנית מהחלק האחורי של העין. משכו פנימה במרווחים קטנים כדי להבטיח ששלמות הרשתית תישאר שלמה. הערה: שלבים אלה הם להסיר את החלק הקדמי של העין (קרנית, קשתית ועדשה) מהחלק האחורי של העין (רשתית עצבית ופיגמנטית).</li>
		<li>כדי לשמור על שלמות שכבות הרשתית, משוך בעדינות והסר את אפיתל פיגמנט הרשתית מהרשתית העצבית. הרשתית העצבית צריכה להיות נקייה מכל כתמים שחורים כדי להבטיח את טוהר הבידוד ככל האפשר, שכן שכבת RPE היא בדרך כלל דביקה ומחוברת לרשתית העצבית.</li>
		<li>חתכו את הרשתית העצבית המנותחת לחתיכות קטנות לפני שתאספו אותה בצלחת כדי להבטיח התפשטות הומוגנית של התאים בצלחת.</li>
	</ol></li>
	<li>לוחית את הרשתית העצבית בבקבוק T25 המכיל 4 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא.</li>
	<li>לבסוף, מניחים את הבקבוק באינקובטור ודגרים ב 37 ° C ו 5% CO2.</li>
</ol>5. גידול תאי גליה ראשוניים
<ol><li>אין להזיז את הבקבוק במשך 3-5 ימים כדי לקדם את צמיחת התאים.</li>
	<li>שנה את המדיה לאחר היום החמישי וכל יומיים לאחר מכן עד שהתאים יהיו 90% נפגשים.</li>
</ol>6. מעבר תאי גליה ראשוניים של מולר
<ol><li>שאפו את מדיית תרבית התאים של מולר, ואחריה 2 מ"ל שטיפה ב-PBS, ושאפו החוצה את PBS. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA (1x), או מספיק כדי לכסות את הצלחת.</li>
	<li>דוגרים במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>ודא שהתאים מנותקים מהצלחת מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, אספו את תרחיף התא והוסיפו 4 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא שחומם מראש (37°C) (מוכן בשלב 1.2) לצינור האיסוף.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 7 דקות ב 300 x גרם. לאחר שאיפת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מצע גידול תאי מולר ראשוני מלא. מכיוון שמספר התא יכול להשתנות בהתאם למספר העיניים המנותחות, לכן, עדיף לספור את התאים לפני הזריעה והדגירה. צפיפות הזריעה המומלצת היא 3.0 x 106 תאים בצלוחית T75. הערה: ניתן להעביר תאים עד 4-5 פעמים. עם זאת, תוצאות הניסוי העקביות ביותר נמצאות לאחר 1-2 מעברים.</li>
</ol>7. Immunofluorescence
הערה: השתמש בפרוטוקול immunofluorescence כדי להכתים ולאמת את הספציפיות של תאי Müller. להלן סקירה קצרה של פרוטוקול immunofluorescent. שלב זה מבוצע לאחר הקטע הראשון12.
<ol><li>זרעו את התאים בשקופית תא תרבית תאים (30,000 תאים לבאר עבור שקופית של 8 בארות).</li>
	<li>תרבית את התאים המבודדים במשך 24-48 שעות בתווך תרבית תאי מולר שלם (מוכן בשלב 1.2) ב 37 ° C ו 5% CO2.</li>
	<li>שאפו החוצה את המדיה ושטפו את שקופית התא עם 250-300 μL של 1x PBS על כל באר כאשר התאים הם 80-90% במפגש.</li>
	<li>תקן את המגלשה למשך 10 עד 15 דקות ב 250-300 μL של 4% paraformaldehyde על כל באר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS / TX-100 (5 דקות כל אחד / 3x).</li>
	<li>הוסף מאגר חוסם למשך שעה אחת ב- 37°C (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>יש לשאוף את התמיסה החוסמת, ולאחר מכן להוסיף את הנוגדנים הראשוניים הספציפיים לתאי מולר כדי לאשר את טוהר התאים המבודדים באמצעות גלוטמין סינטטאז ווימנטין 5,12. דגירה במשך 3 שעות ב-37°C (באמצעות ריכוז נוגדנים של 1:100-1:200 בחיץ חוסם בנפח של 150-200 μL/slide). שטפו את המגלשה בשטיפות PBS/TX-100 (5 ו-10 דקות כל אחת). הערה: נוגדנים אלה נבחרו מכיוון שהם סימני היכר לזיהוי תאי מולר ולהבטחת ההצלחה והטוהר של תרבית תאי מולר.</li>
	<li>מוסיפים את הנוגדן המשני (עם ריכוז נוגדנים שנע בין 1:1000 בחיץ חוסם ב-150-200 מיקרוליטר/שקופית) ודגרים במשך שעה אחת ב-37°C. לאחר מכן, שטפו עם PBS/Triton X-100, שלוש פעמים (5-10 דקות כל אחת).</li>
	<li>החל טיפה של אמצעי הרכבה DAPI כדי לתייג את הגרעינים לפני כיסוי השקופית בכיסוי. הימנעו מבועות אוויר בעת הנחת הכיסוי.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק את השקופית וללכוד תמונות (ראה טבלת חומרים). הערה: תאים ממוקמים עם DAPI ב- ex/em 359/461 בהגדלה של 10x כדי לאתר תאים; הגדלה גבוהה יותר יכולה ללכוד תאים. אורכי גל אחרים יהיו תלויים בצבע הנבחר. צבע ירוק (GFP)- ex/em 488/510. צבע אדום (Cy3)- ex/em 555/569.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Wang, C., Su, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+signaling+in+m%C3%BCller+glia%3A+Progenitor+cells+for+regenerative+and+neuroprotective+responses+in+pharmacological+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophth%22%5BJournal%5D)">Cellular signaling in müller glia: Progenitor cells for regenerative and neuroprotective responses in pharmacological models of retinal degeneration.</a> J Ophth. 2019, 5743109(2019).</li>
<li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Dev Dyn. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>Kobat, S. G., Turgut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+M%C3%BCller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Beyoglu+Eye+J%22%5BJournal%5D)">Importance of Müller cells.</a> Beyoglu Eye J. 5 (2), 59-63 (2020).</li>
<li>Liu, X., Tang, L., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+M%C3%BCller+cell+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse Müller cell isolation and culture.</a> Bio Protoc. 7 (15), e2429(2017).</li>
<li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Ret+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Müller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Ret Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li>
<li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L. M., Schitine, C. S., de Mello, M. C. F., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina%3A+neurotransmitters+and+trophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochem Res. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li>
<li>Fischer, A. J., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+are+a+potential+source+of+neural+regeneration+in+the+postnatal+chicken+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Müller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina.</a> Nat Neurosci. 4 (3), 247-252 (2001).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+%28Danio+rerio%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J of Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> J of Vis Exp. (133), 56997(2018).</li>
<li>Sarthy, P. V., Bunt, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+isolated+glial+%28M%C3%BCller%29+cells+from+the+turtle+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of isolated glial (Müller) cells from the turtle retina.</a> Anat Rec. 202 (2), 275-283 (1982).</li>
<li>Shanmugam, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+membrane+component+1+%28PGRMC1%29+expression+in+murine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) expression in murine retina.</a> Curr Eye Res. 41 (8), 1105-1112 (2016).</li>
<li>Moustafa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12-HETE+activates+M%C3%BCller+glial+cells%3A+The+potential+role+of+GPR31+and+miR-29%5BTitle%5D)+AND+%22Prostag+Oth+Lipid+M%22%5BJournal%5D)">12-HETE activates Müller glial cells: The potential role of GPR31 and miR-29.</a> Prostag Oth Lipid M. 171, 106805(2024).</li>
<li>Pereiro, X., Ruzafa, N., Acera, A., Urcola, A., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+method+to+isolate+and+culture+adult+porcine%2C+rats+and+mice+m%C3%BCller+glia+in+order+to+study+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a method to isolate and culture adult porcine, rats and mice müller glia in order to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 14, 7(2020).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר כי הם רלוונטיים לתוכן מאמר זה.

הבידוד של אפיתל פיגמנטי רשתית ראשוני (RPE) מעכברים תועד בעבר על ידי המעבדה שלנו. כתב יד זה מתאר פרוטוקול הדגמה מפורט לבידוד תאי מולר ראשוניים. הליך זה כולל חינוך, טיפול, נתיחה, איסוף, זריעה, תרבית ואפיון של תאי מולר שבודדו מעיני עכבר. הוא מבוסס על פרוטוקול מוצלח בעבר שנמצא בפרסומים קודמים ועל הפרוטוקול המתוקן שלנו שבו השתמשנו בפרסום האחרון1 2,13. בעוד השלבים פשוטים, בידוד מוצלח של תאי מולר דורש עמידה במגבלות ספציפיות ובדרישות חיוניות. לאחר ניסיונות ניסוי וטעייה רבים לייעל פרוטוקול זה, זוהו גורמים רבים המשפיעים על הצלחתו.
גיל העכבר האידיאלי, כפי שנצפה בניסויים שלנו, נמצא בין 5-11 ימים על מנת לגדל את התאים המבודדים עד ארבעה מעברים. התרבות מושפעת גם מכמות העיניים המבודדות והתרבותיות. עבור בידוד יחיד, נדרשות לפחות שתי עיניים כדי להשיג מספר מספיק של תאים כדי להיות מסוגלים לגדול ולהתרבות. היבט חשוב נוסף הוא משך הזמן בין האינקולציה לציפוי; לכן, שלב זה צריך להתבצע במהירות יחסית. נצפה כי למניפולציה ממושכת של רקמת העין יש השפעה מזיקה על יכולתם של התאים להיצמד לבקבוק ולהתרבות. כדי לוודא שהקרבה של תאים מבודדים קרובה מספיק כדי לעודד התפשטות, אנו ממליצים להשתמש בצלוחית T25. לאחר ביצוע המעבר הראשון, ניתן לצפות את התאים על T75. כמו כן, אין להפריע לתאים לאחר בידוד וזריעה על ידי הסרת בקבוק תרבית הרקמה מהאינקובטור או על ידי החלפת המדיה למשך 5 ימים לפחות. לבסוף, תאים יכולים לעבור רק כארבע פעמים לפני שהם מפסיקים להידבק. למרות שהליך זה הוא פשוט וקל לביצוע, יש לו כמה מגבלות כולל גילאי העכברים, מספר מוגבל של מעברי תאים וכו '.
אין הרבה פרוטוקולים לבידוד תאי מולר, אבל יש כמה הבדלים בולטים בין פרוטוקול זה לפרוטוקולים הזמינים 5,14. ראשית, הזמן בין חינוך לבידוד שונה באופן משמעותי. פרוטוקולים אחרים מציעים דיסקציה זמן קצר לאחר ההאכלה, בדרך כלל תוך 10 דקות. בעוד שהפרוטוקול הנוכחי מציע תקופת מנוחה של לפחות 18 שעות, שכן זה סיפק את התוצאות הטובות ביותר לבידוד בפרוטוקול זה. הבדל משמעותי נוסף בין פרוטוקול זה לפרוטוקולים אחרים הוא הנקודה שבה העיניים מטופלות באנזימים. בפרוטוקול זה, העיניים מטופלות לפני ביצוע דיסקציה כלשהי, עוד לפני הסרת רקמת החיבור והשרירים החוץ-עיניים. בעוד פרוטוקולים אחרים מבודדים את הרשתית מהעין לפני הטיפול באנזים. יתר על כן, מתכון האנזים הוא גם שונה. בפרוטוקול זה, תמיסת האנזים מורכבת מטריפסין וקולגנאז מסוג IV. בפרוטוקולים דומים, פפאין ו- DNase משמשים לעיכול רקמות. בנוסף, כלי התרבית שונה, פרוטוקול זה מציע גידול על T25 ואז על T75 לאחר המעבר הראשון. בעוד פרוטוקולים אחרים משתמשים בצלחות פטרי או צלחות מרובות בארות. לבסוף, פרוטוקול זה מציע כי בקבוק לא צריך להיות מופרע (במשך 5-7 ימים) כדי לקדם את צמיחת התאים. בעוד שבפרוטוקולים אחרים שינוי מדיה מתבצע לאחר יום אחד.

תאי מולר (MCs) הם תאי הגליה העיקריים והנפוצים ביותר הנמצאים ברקמת הרשתית. הם שחקני המפתח במתן שלמות מבנית ותפקודים מטבוליים בתוך הרשתית1. המבנה האסטרטגי של MCs מתפרש על פני כל עובי הרשתית, ובכך מספק תמיכה לרשתית. בנוסף לתכונות דמויות הפיגומים שלהם, יש להם פונקציות מטבוליות עבור נוירונים ברשתית, המספקים להם מצעי אנרגיה, כולל גלוקוז ולקטט. תפקודים אלה חיוניים על מנת לשמור על תפקוד עצבי בריא. דווח כי MCs לקויים תורמים למחלות רשתית שונות, כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל, רטינופתיה סוכרתית וגלאוקומה 2,3. MCs יכולים להיות מקורות תאיים אנדוגניים לטיפול רגנרטיבי ברשתית1. הם גם מהווים חלק משמעותי מהרשתית, וראיות חזקות מצביעות על כך שבכמה מינים, תאים אלה יכולים להיות מעוררים להחליף נוירונים חסרים2. הם משתפים פעולה באופן מועיל עם נוירונים, וכפות הרגליים הסופיות של תאי מולר המסתעפים בחרוט פותחות בצפיפות את כלי הדם ומחברות את המרכיבים העצביים של הרשתית. על מנת לשמור על התפתחות עצבית ופלסטיות עצבית, תאי מולר משמשים כמצע רך לנוירונים, ומגינים עליהם מפני טראומה מכנית3. בנוסף, בנסיבות פתולוגיות, תאי מולר עשויים להתמיין לאבות עצביים או תאי גזע המשכפלים או מחדשים את הפוטורצפטורים והנוירוניםשאבדו 2,3,4. תאי מולר שומרים על המאפיינים של תאי גזע ברשתית, כולל רמות שונות של פוטנציאל להתחדשות עצמית והתמיינות 5,6. לתא הגליה של מולר יש שושלת רשתית משמעותית המייצרת גורמים נוירוטרופיים, סופגת וממחזרת מוליכים עצביים, חוצצת יונים מרחבית ושומרת על מחסום הדם-רשתית על מנת לשמור על הרשתית בהומאוסטזיס 7,8,9. זה מדגיש את הפוטנציאל של תאי מולר ככלי מבטיח בטיפולים מבוססי תאים לטיפול במחלות הקשורות לניוון הרשתית. תאי מולר הם תאי הגליה העיקריים המפוזרים ברחבי הרשתית, ומתחברים הן לנוירונים והן לכלי הדם. הם ממלאים תפקיד הגנה חיוני, ומספקים תמיכה מבנית ומטבולית חיונית לשמירה על הכדאיות והיציבות של תאי הרשתית. למרבה הצער, מעט מאוד פרוטוקולים נמצאים בספרות לבידוד תאי מולר ראשוניים מהרשתית10,11.
אנו מציגים גישה משופרת לבידוד וטיפוח אמינים של תאי מולר ראשוניים של עכברים. פרוטוקול זה שימש בקבוצה שלנו כדי לבודד תאי מולר מעכברי בר מסוג C57BL/6 ועכברים טרנסגניים12,13. עכברים בגילאי 5 עד 11 ימים, ללא העדפת מין, משמשים לפרוטוקול זה. תאים עברו עד 4 פעמים; עם זאת, ב P4 הם מפסיקים לדבוק צלוחיות, וזה הופך להיות קשה לגדל תרבות בריאה. התרבית מזוהמת לעתים קרובות בתאי אפיתל פיגמנטי רשתית (RPE), ולכן יש להעביר את התאים לפחות פעם אחת לפני ביצוע ניסויים נוספים בקו התא. המעבר מאפשר בידוד נוסף ממזהמים. לכן, הפרוטוקול שהוצג מציע דרך מהירה ויעילה לבודד תאי מולר עכבר, אשר לאחר מכן יכול לשמש פלטפורמה אמינה לחקר מטרות טיפוליות והערכת טיפולים פוטנציאליים למחלות רשתית14.

<table><tbody><tr><td>: 100 מ"ל</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז IV&nbsp;</td><td>וורת'ינגטון&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS004188 פיפטות העברה חד פעמיות מדורגות: 3.2 מ"ל סטרילי</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media תגדל M&uuml; תאי לר&nbsp;</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>למדיה מלאה של תרבית תאים מולר</td></tr><tr><td>איתות</td><td>תאים גלוטמין סינתאז</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>מזרק Luer-Lok עם מחט מחוברת 21 גרם x 1 1/2 אינץ', סטרילי, לשימוש חד פעמי, 3 מ"ל</td><td>B-D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>309577 צינור מיקרו צנטריפוגה: 2 מ"ל</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>עבור M&uuml שלם; ller תקשורת תרבית תאים</td></tr><tr><td>מלח מאגר פוספט (PBS)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>J62851. </td><td></td></tr><tr><td>פינצטה לפעולה חיובית AP, סגנון 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס סטנדרטי ישר 11.5 ס"מ</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall St8 צנטריפוגה</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי, #11, נירוסטה</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית השעיה 60 מ"מ x 15 מ"מ צלחת</td> תרבית <td>רקמות בסגנון קורנינג</td><td>430589</td><td></td></tr><tr>: צינורות <td>טורנדו 353003 קורנינג</td><td></td><td></td><td>בסגנון 100x20 מ"מ</td></tr>: צינורות טורנדו <tr><td>15 מ"ל</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>: פינצטה 50 מ"ל</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>5MS, 8.2 ס"מ, ישר, 0.09x0.05 מ"מ טיפים</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה סגנון פעולה חיובית 5, ביולוגי, Dumostar, גימור מלוטש, 110 מ"מ OAL</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית Sciences Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>רפידות תחתונות, בינוניות: 23 אינץ' x 36 אינץ'</td> <td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיציות - 2.5 מ"מ קצה חיתוך</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

התא התומך העיקרי ברשתית הוא תא מולר גליית הרשתית. הם מכסים את כל פני הרשתית ונמצאים בסמיכות הן לכלי הדם ברשתית והן לנוירונים ברשתית. בגלל גדילתם, תאי מולר מבצעים מספר משימות חיוניות ברשתית בריאה, כולל ספיגה ומיחזור של מוליכים עצביים, תרכובות חומצה רטינואית ויונים (כמו אשלגן K+). בנוסף להסדרת זרימת הדם ושמירה על מחסום הדם-רשתית, הם גם מווסתים את חילוף החומרים ואת אספקת החומרים המזינים לרשתית. נוהל מבוסס לבידוד תאי מולר ראשוניים של עכבר מוצג בכתב יד זה. כדי להבין טוב יותר את התהליכים המולקולריים הבסיסיים המעורבים במודלים עכבריים שונים של הפרעות עיניים, בידוד תאי מולר הוא גישה מצוינת. כתב יד זה מתאר הליך מפורט לבידוד תאי מולר מעכברים. מהאינוקלציה ועד הזריעה, התהליך כולו נמשך כמספר שעות. במשך 5-7 ימים לאחר הזריעה, אין לשנות את המדיה על מנת לאפשר לתאים המבודדים לגדול ללא הפרעה. אפיון תאים באמצעות מורפולוגיה וסמנים אימונופלואורסצנטיים מובחנים הוא השלב הבא בתהליך. המעברים המרביים לתאים הם 3-4 פעמים.

אימות הספציפיות, הטוהר ותפקוד המחסום של תאי מולר מבודדים כדי לאשר את הכדאיות, המורפולוגיה והתכונות הייחודיות של תאי מולר המבודדים, התאים נבדקו תחת מיקרוסקופ אור. תועדו תמונות P0 ו-P1 (איור 1A). כדי לבדוק את הזיהום של תאי מולר מבודדים בתאי RPE ולאשר את טוהרו, בוצעה צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) באמצעות נוגדנים ספציפיים לסמן תאי RPE, RPE65. תאי פיגמנט ברשתית האנושית (ARPE -19) שימשו כבקרה חיובית. תאי RPE מוכתמים RPE65 (אדום וכחול עבור צביעה גרעינית) מוצגים באיור 1B (פאנל תחתון). נוגדנים ספציפיים ל-RPE65 לא הכתימו את תאי מולר המבודדים (איור 1B, פאנל עליון). העובדה שה-RPE65 הכתים את תאי ARPE-19 (אדום) ולא הכתים את התאים המבודדים, מצביעה על כך שהתאים המבודדים אינם תאי RPE. נוכחות של פירובט גלוקוז נמוך בתקשורת קובע תנאים שליליים לצמיחה של תאי RPE. כתוצאה מכך, גם במקרה של זיהום תאי RPE, הם בסופו של דבר להתנתק מן הצלוחית.
יתר על כן, כדי לאשר את זהותם של תאים מבודדים, נעשה שימוש בצביעת אימונופלואורסצנטיות של תאי מולר עבור סמנים ספציפיים של תאי מולר כדי לאשר את הבידוד המוצלח של תאי מולר. חלבון נימה ביניים cytoskeleton שנקרא vimentin שימש12,13. נוסף על כך,נעשה שימוש גם בגלוטמין סינטטאז (GS), המזרז את התגובה של עיבוי גלוטמט ואמוניה ליצירת גלוטמין, כפונקציה מרכזית של תאי גליה מולר ברשתית.
באופן קולקטיבי, תאים מבודדים מוכתמים כשליליים עבור RPE65 (אדום, איור 1B), חיוביים עבור וימנטין (ירוק, איור 1C) ו-GS (ירוק, איור 1D). צביעת IF מאשרת בידוד מוצלח (טוהר וספציפיות) של תאי מולר המבודדים. איור 1E הוא בקרה שלילית עבור וימנטין (פאנל עליון) ו-GS (פאנל תחתון), מה שמאשר את הספציפיות של הנוגדנים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66237/66237fig01.jpg"> איור 1: אימות בידוד תאי מולר (טוהר וספציפיות). (A) תמונה במיקרוסקופ אור למעברים:מעבר אפס(P0) ו(P1)מורפולוגיה. (B) RPE65 immunostaining בשילוב עם צביעה גרעינית DAPI. (C) צביעה חיסונית של וימנטין עם צביעה גרעינית DAPI בהגדלה גבוהה. (D) GS immunostaining באותה הגדלה גבוהה. (E) בקרות שליליות כדי לאשר את הספציפיות של צביעת נוגדנים vimentin ו- GS. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66237/66237fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גליית הרשתית מעיני עכבר. הפרוטוקול מתחיל באינקולציה ודיסקציה של עיני עכבר, ואחריו בידוד, זריעה וטיפוח של תאי מולר.

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

isolation-of-primary-mouse-retinal-glial-mller-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה נדגים כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן אפיתל ריסי העין העכבר לגדל אותם בתרבית כדי ליצור כדורים רשתית משובט. התחומים כי הם מבודדים להחזיק את המאפיינים העיקריים של בתאי גזע: התחדשות עצמית multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

סרטון זה מדגים את הרבייה של תאי גליה מולר (MG) שבודדו מרשתיות עכבר. הרשתית מנותקת לתרחיף חד-תאי באמצעות אנזימי עיכול. לאחר מכן מגדלים תאים בתווך עם גורם גדילה המקדם התרבות תאי MG ותמותת תאים עצביים. תאי עצב מתים מוסרים תוך כדי מעבר, ותאי MG גדלים לניתוח נוסף.

הקמת תרבית תאי גליה מולר המתקבלת מרשתיות עכבר

מיליוני אנשים סובלים ממחלות ניוונית של הרשתית הגורמות עיוורון בלתי הפיך. מרכיב נפוץ של רבים ממחלות אלה הוא אובדן תאי הגנגליון ברשתית (RGCs). פרוטוקול מפורט זה מתאר את הבידוד של RGCs Murine העיקרי על ידי בחירה חיובית ושלילית עם cytometry הזרימה.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

כאן, אנו מתארים את ניתוקה של המעית-גלייה מ המעי-submucosa באמצעות incubations EDTA רציפים כדי chelate קטיונים דו ערכיים ולאחר מכן הדגירה ב פתרון שחזור תאים שאינם אנזימטיות. ציפוי התליה תא תוצאות על פולי-D-ליזין ו- laminin תוצאות בתרבות מועשר של תאי גליה submucosal לניתוח פונקציונלי.

בידוד תאי גליה המעית מן Submucosa פרופריה. מוסקולריס של העכבר למבוגרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוט לבידוד תאי אפיתל פיגמנטציה ברשתית (RPE) מעיני עכבר באופן מדורג. הפרוטוקול כולל אנוקליזציה ונתיחה של עיני עכבר, ולאחר מכן בידוד, זריעה והתרבות של תאי RPE.

בידוד של תאי אפיתל פיגמנטים ברשתית של עכברים ראשוניים

תרביות ראשוניות של Müller glia המתקבלות מרשתיות עכברים מייצגות כלי חזק ואמין מאוד לחקר המרת גליה לתאי אב רשתית לאחר טיפול במיקרו-רנ"א. ניתן לבדוק מולקולות בודדות או שילובים לפני היישום הבא של גישות in vivo .

תרביות תאים ראשוניות לחקר פוטנציאל ההתחדשות של מורין מולר גליה לאחר טיפול במיקרו-רנ"א

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידוד תאי מולר ראשוניים ברשתית מחולדות Sprague-Dawley (SD) יילודים. ההליך כולל הוצאת גלגלי העין, דיסקציה של רקמת הרשתית, מיצוי וזיהוי תאים, ושיקולים מרכזיים לתרבית תאים לאחר מכן.

בידוד ותרבית של תאי מולר רשתית ראשוניים מחולדות Sprague-Dawley (SD)

למדו את שיטת בידוד תאי גליית גליה ראשוניים מרשתית העכבר באמצעות טריפסין ותרבית תאים. פרוטוקול זה מאפשר חקר תפקיד התאים במחלות רשתית ופיתוח מטרות טיפוליות.

בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

גלה סרטונים נוספים