בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גליית הרשתית מעיני עכבר. הפרוטוקול מתחיל באינקולציה ודיסקציה של עיני עכבר, ואחריו בידוד, זריעה וטיפוח של תאי מולר.

תאי מולר הם תאי הגליה העיקריים של הרשתית. הם ממלאים תפקיד חשוב מאוד בשמירה על הנוירונים הפעילים מאוד מבחינה מטבולית של הרשתית. המעבדה שלנו הקימה טכניקה לבידוד תאי מולר מעיני עכברים. טכניקה זו תאפשר לחקור את תפקידם של תאי מולר במחלות רשתית שונות, להבין את הפתוגנזה של מחלות וכן לפתח מטרות טיפוליות.

[קריין] המתת חסד אתית של העכבר על פי השיטות המאושרות של המוסד שלך. גרעין את העיניים על ידי לחיצה על פינצטה בסגנון 5/45 על אזור המסלול כדי לגרום לפרופטוזיס, ולאחר מכן חילוץ העין על ידי מיקום זרועות הפינצטה בחלק האחורי של העין, ולאחר מכן משיכה עדינה מאזור המסלול. הניחו את העיניים ב-10 מ"ל של תמיסת העיניים של תאי מולר והניחו להן לשבת למשך הלילה, או כ-18 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר 18 שעות, יש לשפוך את תמיסת העיניים על ידי שפיכתה מהשפופרת להשלכה. שטפו את העיניים עם מי מלח מחוממים עם פוספט או PBS. שפכו שוב את ה-PBS על ידי שפיכתו מהצינור להשלכה. לאחר מכן הניחו את העיניים בצלחת פטרי בגודל 100 מילימטר המכילה 10 מ"ל של תמיסת הטריפסין. מניחים את המנה בחממה ומדגרים למשך שעה וחצי עד שעתיים בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% CO2. לאחר הדגירה, העבירו את העיניים לצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר המכילה כחמישה מ"ל של מצע גדילה ראשוני שלם של תאי מולר. ראוי לציין כי הסרטון הוקלט מחוץ למכסה המנוע לצורך ראות טובה יותר והדגמה ברורה. עבור ניסויים בפועל, הם צריכים להתבצע במכסה זרימה למינרי כפי שמוצג. הניחו את העיניים מתחת למיקרוסקופ מנתח והתחילו לנתח. השתמש בפינצטה בסגנון M5S ובמספריים של Vannas כדי להסיר רקמת חיבור, שרירים חוץ עיניים ועצב הראייה. כאן, עצב הראייה נחתך במספריים של ואנאס. תפסו את העין בפינצטה בסגנון M5S ובצעו חתך בקטע ora serrata בעזרת מספריים של Vannas או מחט של מזרק. אחוז בחתך עם שתי פינצטה בסגנון M5S והתחל למשוך או לקרוע את הקרנית מהחלק האחורי של העין. משוך במרווחים קטנים כדי להבטיח ששלמות הרשתית תישאר שלמה. הנה הדגמה כיצד להסיר את הקרנית מהחלק האחורי של גביעונית העין. לאחר חשיפת העדשה והרשתית העצבית, הסר את שכבת הפיגמנט של העין, שככל הנראה נדבקה אליה הקשתית. לאחר מכן הסר את הרשתית העצבית מהעדשה. הסר כל רקמה פיגמנטית מהרשתית העצבית כדי לשפר את טוהר הבידוד. בהתחשב באופי הדביק של הרשתית העצבית, לא סביר שתסיר את כל הרקמה הפיגמנטית. אוספים את כל הרשתית העצבית וקורעים אותן לחתיכות קטנות יותר. צלחת את הרשתית העצבית בבקבוק T25 המכיל ארבעה מ"ל של מצע גדילה ראשוני שלם של תאי מולר. לבסוף, הניחו את הבקבוק באינקובטור ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. פאנל A מראה תרבית תאי מולר בריאה במעבר אפס ובמעבר הראשון. היעדר פיגמנט מעיד על היעדר תאי RPE, שהם המזהם העיקרי בבידוד. זה מחוזק בפאנל B עם RP65, סמן ספציפי ל-RP.