Name: הפרעות RNA בפרזיטואיד ביצה, Trichogramma dendrolimi Matsumura (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: למד שיטת RNAi בפרזיטואיד ביצה Trichogramma dendrolimi לחקירת תפקודי גנים. השיטה מספקת כלי חיוני לויסות גנים בזחלי דבורים קטנים המשמשים לבקרת מזיקים חקלאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי הפרויקטים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32172476, 32102275), התוכנית לחדשנות במדע חקלאי וטכנולוגיה (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108), וקרנות מרכזיות המנחות את פיתוח המדע והטכנולוגיה המקומי (XZ202301YD0042C).

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, המכשירים, התוכנה והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. איסוף ותחזוקת תרבות חרקים
<ol><li>הדביקו קבוצה של ~5,000 ביצים של Corcyra cephalonica (סטינטון) על כרטיס בגודל 9 ס"מ על 16 ס"מ באמצעות תמיסה של 1:5 (v/v) של אבקת גומי ערבי ומים25,26. הערה: הימנעו מהצמדת יותר מדי ביצי מארח לכרטיס מכיוון שהצפיפות הופכת אותו לבלתי מעשי עבור הליכי העברה ונתיחה הבאים.</li>
	<li>כדי למנוע בקיעה של ביצי מארח, יש להכפיף את כרטיסי הביצים של המארח ל-30 דקות של קרינה על-סגולה (UV) (איור 1-i). לאחר מכן, חתכו את הנייר עם ביצים לא פעילות לכרטיסי ביצים בעובי 1 ס"מ ובקוטר 8 ס"מ, שכל אחד מהם מכיל כ-300-500 ביצים (איור 1-ii)25,26,27.</li>
	<li>הכניסו קבוצה של 80-120 צרעות T. denrolimi לתוך צינור זכוכית בקוטר 2 ס"מ ובאורך 8 ס"מ. אוטמים את הצינור עם כותנה. הערה: שמרו על הצרעות בטמפרטורה של 25 ± 1 מעלות צלזיוס, עם מחזור אור/חושך של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך ושמרו על לחות יחסית של כ-75%.</li>
	<li>הציגו קלף ביצה מארחת לצרעות לצורך טפילות (איור 1-ii). הרשו לצרעות להפקיד את ביציהן בביצי הפונדקאי למשך 6 שעות, ולאחר מכן הוציאו מיד את הצרעות. הערה: הימנעו מהארכת תקופת הטפילות יתר על המידה מכיוון שהדבר עלול להוביל לצפיפות יתר של צאצאי T. denrolimi בתוך ביצה מארחת, וכתוצאה מכך לתמותת צרעות צאצאים מוגברת28,29.</li>
</ol>2. סינתזה של dsRNA
<ol><li>תכנון ערכות פריימר המכילות מקדם T7 לסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA). בחר קטע של 300-400 bp מגן המטרה (Ferhch) לסינתזה של dsRNA.</li>
	<li>לרכוש ערכות פריימר מסונתזות מסחריות לייצור dsRNA עבור הגן הממוקד ו- dsGFP לשימוש כבקרה שלילית.</li>
	<li>חלץ תוכן RNA מצרעות 100 T. denrolimi באמצעות הערכה המוזכרת בהתאם לפרוטוקולהיצרן 9. בדוק את איכות תוכן ה- RNA; המשך אם הערך של OD260/OD280 נע בין 1.8 ל- 2.09.</li>
	<li>לטהר את תכולת הרנ"א עם 2 μL של 5x buffer (1 U/50 μL), 1 μL של DNAse (1 U/50 μL), ו-6.5 μL של RNA (~100 ng/μL), 0.5 μL של H2O ב-42°C למשך 2 דקות.</li>
	<li>בצע תגובת שרשרת פולימראז שעתוק לאחור (RT-PCR) כדי ליצור תבנית cDNA עם 10 μL של RNA מטוהר (~ 100 ng/μL), 4 μL של 5x buffer (1 U/50 μL), 1 μL של Enzyme Mix I (1 U/50 μL), ו- 4 μL של H2O. בצע RT-PCR באמצעות ההגדרות הבאות: 37 ° C למשך 15 דקות, 85°C למשך 5 שניות. יש לאחסן את מוצר ה-cDNA בטמפרטורה של -4°C עד לשימוש.</li>
	<li>בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את רצפי ה-dsRNA בהתאם לתערובת האב הנזכרת (10 μL של Taq II [1 U/50 μL], 0.8 μL של פריימר קדמי [0.4 μM], 0.8 μL של פריימר הפוך [0.4 μM], 0.8 μL של תבנית DNA [40 ng/μL], ו-7.6 μL של H2O). בצע PCR באמצעות ההגדרות הבאות: 94 °C למשך 2 דקות; 35 מחזורים עם 94 ° C עבור 30 שניות, 60 ° C עבור 30 שניות, 72 ° C עבור 30; 72°C למשך 2 דקות.</li>
	<li>להעריך את האיכות של מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 2.0% 5,9 ולאשר את רצף המטרה באמצעות ריצוף Sanger.</li>
	<li>יש לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת מיצוי הג'ל בהתאם להנחיות היצרן 9,23.</li>
	<li>השתמש במערכת RNAi כדי לסנתז dsRNA עבור גן המטרה עם 10 μL של 2x buffer (0.02 U/μL), 8 μL של תבנית DNA (75 ng/μL), ו 2 μL של תערובת אנזימים (1 U/50 μL) עם ההגדרות הבאות: 37 ° C במשך 30 דקות, 70 ° C במשך 10 דקות, ו 25 ° C במשך 20 דקות. הצהירו את ה-dsRNA המסונתז עם 30 מיקרוליטר של מים נטולי Nuclease.</li>
	<li>הערך את האיכות של מוצר dsRNA על ידי הדמיה על 1.0% agarose ג'ל 5,9. לדלל את ה-dsRNA ל-7,000 ננוגרם/מיקרוליטר. בדוק את איכות מוצר ה-dsRNA; המשך אם הערך של OD260/OD280 נע בין 1.8 ל- 2.09. יש לאחסן את מוצר ה-dsRNA בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.</li>
</ol>3. השתלת גלמים T. denrolimi
<ol><li>טפחו את ביצי המאכסן הטפיליות במשך כ-8 ימים בטמפרטורה של 25 ± 1°C, תוך שמירה על מחזור אור של 16 שעות / 8 שעות חושך ולחות יחסית של ~75%. ביצי הפונדקאי הטפיליות יושחרו לאחר 5 ימים30 (איור 1-iv,v).</li>
	<li>מעבירים את כרטיס הביצית המארחת למיקרוסקופ מנתח. השתמשו בזוג מחטי טונגסטן (איור 1-vi) כדי להסיר בקפדנות את הכוריון מביצי הפונדקאי (איור 1-vii) ולשלוף את הגלמים מבפנים (איור 1-viii)5,17,18. הערה: קצה מחט הניתוח צריך להיות פחות מ 0.05 מ"מ.</li>
	<li>מכינים צלחת נקייה למצע. שפכו החוצה 10-15 מ"ל של תמיסת אגר בנפח 15 גרם/ליטר, ואפשרו לה להתקרר באופן טבעי (איור 2-i). הערה: ערבבו את תמיסת האגר עם 0.5 גרם סטרפטומיצין כדי לעכב את צמיחת המזהמים במבחנה.</li>
	<li>השתמשו בקבר שעבר חיטוי כדי לחרוט מספר חריצים בעומק 0.2-0.3 מ"מ וברוחב 0.4-0.8 מ"מ (איור 2-ii).</li>
	<li>השתמשו במברשת קטנה (איור 2-iii) כדי להשתיל גולם מביצת הפונדקאי שנותחה לאחד החריצים במצע האגר (איור 2-iv).</li>
	<li>חזרו על שלבים 3.4 ו-3.5, והשתילו 100-300 גלמים בנפרד לתוך החריצים בזה אחר זה (איור 2-v).</li>
</ol>4. הזרקה זעירה של dsRNA לתוך T. denrolimi pupa
<ol><li>השתמשו במושך מחטי זכוכית כדי למשוך נימי זכוכית (איור 3-i,ii). הגדירו את החום ל-280, את המהירות ל-170, את ההשהיה ל-250 ואת המשיכה ל-30 במושך מחטים (איור 3-iii). הכינו מחטי זכוכית נימיות מרובות למיקרו-הזרקה (איור 3-iv,v).</li>
	<li>שיקוע קצה מחט הזכוכית באמצעות צלחת שוחקת (איור 3-vi). הערה: ודא שקצה מחט ההזרקה נשאר חד; אחרת, זה עלול לגרום לתמותת גולמים או לעכב זרימת מגיבים דרך המחט (איור 3-vii).</li>
	<li>טען כ-2 μL של תמיסת הזרקת dsRNA עם 7,000 ng/μL לתוך מחט ההזרקה המוכנה באמצעות משאבת מיקרו-הזרקה (איור 3-vii).</li>
	<li>העבירו את מצע האגר המכיל מאות גלמים על משטח של מיקרוסקופ מורכב (איור 3-viii).</li>
	<li>הכניסו בזהירות את מחט ההזרקה לבטן של גולם T. denrolimi בזווית ~30° לבטן מתחת לעדשה (איור 3-ix).</li>
	<li>הזריקו בהדרגה ~5 nL של תמיסת ההזרקה (שלב 4.3) לתוך גולם T. denrolimi בעדינות ככל האפשר. הערה: גולם T. denrolimi עשוי להתנפח מעט כאשר תמיסת dsRNA מוזרקת. הזרקת כמות מוגזמת של תמיסה לגלמים או שימוש במחטים עם פתחים גדולים מדי עלולים לגרום למוות מוקדם של הגולם. החליפו את המחטים כאשר הן נסתמות לאחר הזרקת מספר עד עשרות גלמים.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.5 ו -4.6, הזרקת dsRNA לתוך 600 גלמים אחד אחד. הערה: לניתוח RT-qPCR אמין, יש לבודד את תכולת הרנ"א מלפחות 100 גלמים. הזריקו לפחות 600 גלמים עבור שלושה עותקים משוכפלים בטיפול dsRNA ושלושה משוכפלים בבקרה השלילית dsGFP 9.</li>
</ol>5. דגירה של T. denrolimi pupae
<ol><li>העבר את המצע המכיל גלמים מוזרקים לאינקובטור ב 25 ± 1 ° C עם מחזור אור / כהה 16 שעות / 8 שעות ו ~ 75% RH.</li>
	<li>יש לדגור על כ-700 גלמים מסוג T. denrolimi לכל טיפול למשך 24 שעות או 48 שעות. חלץ תוכן RNA מקבוצה של 100 גלמים לכל שכפול9. הערה: הסר את הגלמים המכווצים (הגלמים המתים) מהדגימות; אחרת, זה עלול לגרום לטעויות בזיהוי ביטוי גנים.</li>
	<li>לדגור ~50 T. denrolimi גלמים בכל טיפול עד שהצרעות מגיחות (איור 3-x). רשום את שיעור ההופעה ואת שיעור העיוות.</li>
</ol>6. איתור ביטוי גנים ממוקד
<ol><li>עצבו את ערכת הפריימר עבור גן היעד ואת גני הייחוס עבור RT-qPCR באמצעות כלי עיצוב. הערה: ודא שהרצפים של הפריימרים RT-qPCR אינם חופפים לאזור היעד של dsRNA.</li>
	<li>השתמש בתיבת מזלג הגן O (FoxO) כגן הייחוס בניתוח RT-qPCR; הפריימרים של FoxO דווחו בעבר9.</li>
	<li>השג ערכות פריימר מסונתזות מסחריות. בצע RT-qPCR עם 10 μL של Taq II (1 U/50 μL), 0.8 μL של פריימר קדמי (0.4 μM), 0.8 μL של פריימר הפוך (0.4 μM), 0.8 μL של תבנית (10 ng/μL) ו- 7.6 μL של H2O. בצע RT-qPCR באמצעות ההגדרות הבאות: 95 ° C עבור 30 שניות; 35 מחזורים עם 95 ° C עבור 5 שניות, 57 ° C עבור 30 שניות, 72 ° C עבור 30; 95 °C עבור 10 שניות; 60°C עבור 5 שניות, ו- 95°C עבור 5 שניות.</li>
	<li>חשב את ערך הביטוי של גן היעד באמצעות שיטת 2-ΔΔCt 9,25.</li>
	<li>להשתמש במבחן Kruskal-Wallis כדי לנתח את הביטוי של גן המטרה תחת השפעת טיפולים שונים (dsFerhch, dsGFP, ללא הזרקה). הערה: הימנע משימוש במבחנים פרמטריים (למשל, מבחן t) להשוואות פוסט-הוק מכיוון שההטרוסקדסטיות וחוסר הנורמליות של הנתונים עלולים להוביל למסקנות שגויות25.</li>
</ol>

קידום טכניקות RNAi ב - Trichogramma dendrolimi לניתוח תפקודי גנים

<ol><li>Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+control+with+Trichogramma+in+China%3A+History%2C+present+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Biological control with Trichogramma in China: History, present status and perspectives.</a> Annu Rev Entomol. 66, 463-484 (2020).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+clutch+size+for+quality+control+of+bisexual+and+Wolbachia-infected+thelytokous+lines+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+mass+reared+on+eggs+of+a+substitutive+host%2C+Antheraea+pernyi+Gu%C3%A9rin-M%C3%A9neville+%28Lepidoptera%3A+Saturniidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimal clutch size for quality control of bisexual and Wolbachia-infected thelytokous lines of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) mass reared on eggs of a substitutive host, Antheraea pernyi Guérin-Méneville (Lepidoptera: Saturniidae).</a> Pest Manag Sci. 76 (8), 2635-2644 (2020).</li>
<li>Li, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+the+biological+control+of+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+by+egg+parasitoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pest+Sci%22%5BJournal%5D)">Current status of the biological control of the fall armyworm Spodoptera frugiperda by egg parasitoids.</a> J Pest Sci. 96, 1345-1363 (2023).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+and+superparasitism+on+quality+and+characteristics+of+thelytokous+Wolbachia-infected+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+during+mass+rearing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature and superparasitism on quality and characteristics of thelytokous Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) during mass rearing.</a> Sci Rep. 9 (1), 18114(2019).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrance+during+Wolbachia-mediated+parthenogenesis+of+Trichogramma+wasps+is+reduced+by+continuous+oviposition%2C+associated+with+exhaustion+of+Wolbachia+titers+in+ovary+and+offspring+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Penetrance during Wolbachia-mediated parthenogenesis of Trichogramma wasps is reduced by continuous oviposition, associated with exhaustion of Wolbachia titers in ovary and offspring eggs.</a> Pest Manag Sci. 78 (7), 3080-3089 (2022).</li>
<li>Huang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+and+large-scale+releases+of+Trichogramma+promote+pesticide+decrease+in+maize+in+northeastern+China%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Long-term and large-scale releases of Trichogramma promote pesticide decrease in maize in northeastern China.</a> Entomol Gen. 40 (4), 331-335 (2020).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+Trichogramma+japonicum+as+a+vector+of+Beauveria+bassiana+for+parasitizing+eggs+of+rice+striped+stem+borer%2C+Chilo+suppressalis%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Performance of Trichogramma japonicum as a vector of Beauveria bassiana for parasitizing eggs of rice striped stem borer, Chilo suppressalis.</a> Entomol Gen. 41 (2), 147-155 (2021).</li>
<li>Ning, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+expression+pattern+of+the+sex+determination+genes+and+their+sex-specific+variants+in+the+egg+parasitoid+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The identification and expression pattern of the sex determination genes and their sex-specific variants in the egg parasitoid Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> Front Physiol. 14, 1243753(2023).</li>
<li>Huo, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+evaluation+of+RT-qPCR+reference+genes+for+expression+analysis+in+the+tiny+egg+parasitoid+wasp%2C+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Asia+Pac+Entomol%22%5BJournal%5D)">Selection and evaluation of RT-qPCR reference genes for expression analysis in the tiny egg parasitoid wasp, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae).</a> J Asia Pac Entomol. 25 (2), 101883(2022).</li>
<li>Leung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+biological+control%3A+the+need+for+integrating+genetics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">Next-generation biological control: the need for integrating genetics and genomics.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 95 (6), 1838-1854 (2020).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+an+essential+gene+involved+in+infestation+and+digestion+in+grain+aphid+through+plant-mediated+RNA+interference+generates+aphid-resistant+wheat+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Silencing an essential gene involved in infestation and digestion in grain aphid through plant-mediated RNA interference generates aphid-resistant wheat plants.</a> Plant Biotechnol J. 17 (5), 852-854 (2019).</li>
<li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> J Vis Exp. 130, e56990(2017).</li>
<li>Dalla Benetta, E., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pupal+and+Adult+Injections+for+RNAi+and+CRISPR+Gene+Editing+in+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis.</a> J Vis Exp. 166, e61892(2020).</li>
<li>Lynch, J. A., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+parental+RNA+interference+in+the+wasp+Nasonia+vitripennis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis.</a> Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).</li>
<li>Zhu, K. Y., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+Applications%2C+and+Challenges+of+Insect+RNA+Interference%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference.</a> Annu Rev Entomol. 65, 293-311 (2020).</li>
<li>Colinet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+RNAi+in+a+Drosophila+endoparasitoid+wasp+and+demonstration+of+its+efficiency+in+impairing+venom+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of RNAi in a Drosophila endoparasitoid wasp and demonstration of its efficiency in impairing venom protein production.</a> J Insect Physiol. 63, 56-61 (2014).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digestive+tract+expressing+%CE%B1-amylase+influences+the+adult+lifespan+of+Pteromalus+puparum+revealed+through+RNAi+and+rescue+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">A digestive tract expressing α-amylase influences the adult lifespan of Pteromalus puparum revealed through RNAi and rescue analyses.</a> Pest Manag Sci. 75 (12), 3346-3355 (2019).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia-infected+Trichogramma+dendrolimi+is+outcompeted+by+its+uninfected+counterpart+in+superparasitism+but+does+not+have+developmental+delay%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">Wolbachia-infected Trichogramma dendrolimi is outcompeted by its uninfected counterpart in superparasitism but does not have developmental delay.</a> Pest Manag Sci. 79 (3), 1005-1017 (2023).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+concentration+of+Wolbachia+during+the+early+embryogenesis+of+the+host+dynamically+shapes+the+tissue+tropism+of+Wolbachia+in+host+Trichogramma+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Posterior concentration of Wolbachia during the early embryogenesis of the host dynamically shapes the tissue tropism of Wolbachia in host Trichogramma wasps.</a> Front Cell Infect Microbiol. 13, 1198428(2023).</li>
<li>Lee, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Trichogramma+evanescens+Westw.+and+its+influence+on+the+embryonic+development+of+its+host%2C+Attacus+cynthia+ricini+Boisd%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Entomol+Sin+Z%22%5BJournal%5D)">The development of Trichogramma evanescens Westw. and its influence on the embryonic development of its host, Attacus cynthia ricini Boisd.</a> Acta Entomol Sin Z. 11 (1), 89-119 (1961).</li>
<li>Shen, Y., Chen, Y. Z., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+silencing+of+genes+in+the+brown+planthopper+Nilaparvata+lugens+affects+survival%2C+growth+and+female+fecundity%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag+Sci%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated silencing of genes in the brown planthopper Nilaparvata lugens affects survival, growth and female fecundity.</a> Pest Manag Sci. 77 (1), 365-377 (2021).</li>
<li>Wu, S., Yin, S., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+iron+trafficking+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Res+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of iron trafficking in Drosophila melanogaster.</a> Curr Res Insect Sci. 50, 100888(2022).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia-Driven+Memory+Loss+in+a+Parasitic+Wasp+Increases+Superparasitism+to+Enhance+Horizontal+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Wolbachia-Driven Memory Loss in a Parasitic Wasp Increases Superparasitism to Enhance Horizontal Transmission.</a> mBio. 13 (6), e0236222(2022).</li>
<li>Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradual%2C+temperature-induced+change+of+secondary+sexual+characteristics+in+Trichogramma+pretiosum+infected+with+parthenogenesis-inducing+Wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia.</a> PeerJ. 7, e7567(2019).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+Wolbachia+titers+cause+gradual+change+in+masculinization+of+intersex+individuals+of+thelytokous+Trichogramma+dendrolimi%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi.</a> Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parasitism%3A+A+promising+approach+to+simultaneously+produce+Trichogramma+chilonis+and+T.+dendrolimi+on+eggs+of+Antheraea+pernyi%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi.</a> Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Thelytokous+parthenogenesis-inducing+Wolbachia+on+the+fitness+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+in+superparasitised+and+single-parasitised+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts.</a> Front Ecol Evol. 9, 730664(2021).</li>
<li>Flanders, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notes+on+the+life+history+and+anatomy+of+Trichogramma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Entomol+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">Notes on the life history and anatomy of Trichogramma.</a> Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

צרעות טריכוגרמה מוכרות כמדבירות ביולוגיות יעילות, במיוחד נגד מגוון מזיקים לפידופטרנים בחקלאות וייעור1. צרעות זעירות אלה עוברות את השלבים הלא בשלים שלהן בתוך הביצה המארחת, מאפיין המציב אתגרים בביצוע ניסויי RNAi 5,18. מחקר זה מציע מדריך חזותי מקיף לביצוע ניסויי RNAi ב- T. denrolimi. בהתחשב בתכונות הביולוגיות המשותפות בין מיני טריכוגרמה, ניתן להתאים את ההליך בקלות למחקרי RNAi או מיקרו-זריקות במינים אחרים של טריכ...

Trichogramma spp. הם קבוצה של טפילי ביצים שנעשה בהם שימוש נרחב כחומרי הדברה ביולוגיים יעילים ביותר נגד ספקטרום רחב של מזיקים לפידופטרנים במערכות אקולוגיות חקלאיות ויערות ברחבי העולם 1,2,3,4. היישום של טריכוגרמה בגידול המוני מספק גישה ידידותית לסביבה לניהול בר קיימא של מזיקים 5,6,7. הבנת הביולוגיה המולקולרית של צרעות טריכוגרמה מספקת תובנות חשובות לשיפור יעילות גידול המסה וביצועי השטח של חומרי הדברה ביולוגיים אלה 8,9 על ידי חקירת המתודולוגיה של בקרת גנים ועריכת גנום10.
מאז גילוי ההתערבות הגנטית הספציפית בתיווך RNA דו-גדילי (dsRNA) ב-Caenorhabditis elegans בשנת 1998, שיטת RNA-interference (RNAi) התפתחה לארגז כלים גנטי חיוני לחקר מנגנוני הבקרה של אורגניזמים על ידי דיכוי ביטוי של גני מטרה11. ניסויי RNAi הפכו למתודולוגיה סטנדרטית המיושמת באופן נרחב לחקר תפקוד גנים במינים רבים של חרקים 12,13. אף על פי כן, המניפולציה של RNAi מהווה אתגר עצום במינים טפיליים רבים, במיוחד בקרב אלה השייכים למשפחת הכלסידואידים האנדופרזיטיים 14,15,16. שיטת RNAi תועדה בלפחות 13 מיני טפילים 14,15,16,17,18,19. בין אלה, גישת RNAi בוצעה באופן מקיף בצרעות נסוניה והיא ישימה לאורך כל שלבי ההתפתחות, כולל עוברים, זחלים, גלמים ובוגרים 14,15,16. ראוי לציין כי צרעות נסוניה הן אקטופרזיטואידים, כאשר צאצאיהן מתפתחים בחלל הביניים בין הגלמים המארחים לבין הגולם, מה שמאפשר את גידולם במבחנה וגורם להם לסבול טיפולים מסוימים, כגון מיקרו-הזרקה. בניגוד לצרעות הנסוניה, פרטי טריכוגרמה עוברים את כל התפתחותם העוברית, הזחלית והגולמית בתוך הביצה המארחת. השכבה בשלבי העובר והזחל (העלולה לעכב חדירות dsRNA), פגיעות לנזקים, והקושי לשרוד במבחנה מהווים מכשולים אימתניים 20,21,22. בנוסף, גודלם הזעיר של פרטי טריכוגרמה, בערך ~0.5 מ"מ באורך בוגר או גולם, הופך אותם למורכבים ביותר למניפולציה של 20,21,22.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים הליך מקיף לביצוע ניסויים בהפרעות RNA (RNAi) ב- Trichogramma denrolimi Matsumura. הליך זה כולל את ההליכים הבאים: (1) תכנון וסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA), (2) מיקרו-הזרקה של גלמי T. denrolimi, (3) השתלה ודגירה חוץ גופית של גלמים אלה, ו-(4) זיהוי של הפלת גן מטרה באמצעות ניתוח RT-qPCR. גן המטרה שנבחר לניסוי ה-RNAi הוא הומולוגיה של שרשרת כבדה פריטין (Ferhch). FerHCH, חלבון קושר ברזל, מכיל מרכז פרוקסידאז שניחן ביכולות נוגדות חמצון, המקלות על חמצון Fe2+ עד Fe3+. הוא ממלא תפקיד חיוני בצמיחה והתפתחות של אורגניזמים שונים על ידי שמירה על שיווי משקל חיזור והומאוסטזיס ברזל. דלדול FerHCH יכול לגרום להצטברות יתר של ברזל, מה שמוביל לנזק בלתי הפיך לרקמות, ולעתים קרובות מגיע לשיאו בשינויים פנוטיפיים משמעותיים, כולל פגמים בגדילה, עיוותים ותמותה23,24. מחקר זה מציע מדריך שלב אחר שלב לביצוע RNAi ב- T. denrolimi, אשר יהיה רב ערך לחקר תפקודי הגן בהקשר הרחב יותר של צרעות טריכוגרמה.

<table><tbody><tr><td>2x ES Taq MasterMix (צבע)</td> <td>Cowin Biotech, סין</td><td>CW0690H</td><td>כדי להגביר את רצפי ה-dsRNA</td></tr><tr><td>20x PBS Buffer, DEPC מטופל (7.2-7.6)</td> <td>Sangon Biotech, סין</td><td>B540627-0500</td><td>לדלל dsRNA</td></tr><tr><td>Agar Strip</td><td>Shishi Globe Agar Industries Co., Ltd, סין</td><td>n/a</td><td>כדי להפוך את התרבות לבינונית</td></tr><tr><td>Ampicillin נתרן</td><td>סנגון ביוטכנולוגיה, סין</td><td>A610028</td><td>לעשות מדיום</td></tr><tr><td>תרבית Bioer אמבט מתכת בטמפרטורה קבועה </td><td>BIOER, סין</td><td>MB-102</td><td>לסינתזה</td></tr> של <tr><td>נימי זכוכית dsRNA בורוסיליקט </td><td>WPI, ארה"ב</td><td>1B100-4</td><td>כדי למשוך מחט זכוכית נימית</td></tr><tr><td>ספסל נקי </td><td>Airtech, סין</td><td>SW-CJ-1FD</td><td>להפקת</td></tr><tr><td>RNA מים מזוקקים כפולים</td><td>סנגון ביוטק, סין</td><td>A500197-0500</td><td>לדילול</td></tr><tr><td>תא בדיקות סביבתיות cDNA </td><td>פנסוניק, יפן</td><td>MLR-352H-PC</td><td>לתרבות T. denrolimi</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge </td><td>Eppendrof, גרמניה</td><td>5418R</td><td>לאחסון תכולת RNA</td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet 4i</td><td>Eppendrof, גרמניה</td><td>FemtoJet 4i</td><td>להזרקת T. denrolimi</td></tr><tr><td>Eppendorf צנטריפוגה מקוררת </td><td>אפנדרוף, גרמניה</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אתנול צנטריפוגה (75%, ללא RNase)</td> <td>אלאדין, סין</td><td>M052131-500 מ"ל</td><td>לחילוץ</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל</td> RNA <td>אומגה, ארה"ב</td><td>D25000-02</td><td>כדי לחלץ cDNA</td></tr><tr><td>GUM ערבית</td><td>Solarbio, סין</td><td>CG5991-500g</td><td>להכנת כרטיס ביצה</td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול אלאדין</td><td>, סין</td><td>80109218</td><td>לחלץ RNA</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה מבוסס לייזר </td><td>סאטר, ארה"ב</td><td>P-2000</td><td>למשיכת מחט זכוכית נימית</td></tr><tr><td>Microloader </td><td>אפנדרוף, גרמניה</td><td>20 ומיקרו; L</td><td>לטעינת dsRNA</td></tr><tr><td>מטחנת רקמות מרובת דגימות </td><td>LICHEN, סין</td><td>LC-TG-24</td><td>לטחינת T. denrolimi</td></tr><tr><td>מטחנת מחטים </td><td>סאטר, ארה"ב</td><td>BV-10-E</td><td>לטחינת מחט זכוכית נימית</td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>סנגון ביוטכנולוגיה, סין</td><td></td><td>לדילול RNA</td></tr><tr><td>OLYMPUS מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס, יפן</td><td>XZX16</td><td>כדי לצפות במכונת T. denrolimi</td></tr><tr><td>PCR </td><td>Bio-rad, ארה"ב</td><td>S-1000</td><td>להגברת DNA</td></tr><tr><td>PowerPac Basic</td><td>Bio-rad, ארה"ב</td><td>PowerPacTM Basic</td><td>לזיהוי איכות dsRNA </td></tr><tr><td>פריימר של dsGFP (קדימה)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] פריימר ACAAACCAAGGCAAGTAATA</td></tr><tr><td>של dsGFP (הפוך)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] פריימר CAGAGGCATCTTCAACG</td></tr><tr><td>של Ferhch for qPCR (Forward)</td><td></td><td></td><td>TGAAGAGATTCTGCGTTCTCTGCTCTCT</td></tr><tr><td>פריימר של Ferhch for qPCR ( הפוך)</td><td></td><td></td><td>CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT</td></tr><tr><td>פריימר של Ferhch עבור RNAi (הפוך)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG]AG פריימר TAGCCATCTTTCC</td></tr><tr><td>של Ferhch עבור RNAi(קדימה)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG</td></tr><tr><td>פריימר של FoxO עבור qPCR (קדימה)</td><td></td><td></td><td>CTACGCCGATCTCATAACGC</td></tr><tr><td>פריימר של FoxO עבור qPCR (הפוך)</td><td></td><td></td>ערכת ריאגנטים <td>TGCTGTCGCCCTTCCT</td></tr><tr><td>PrimeScript RT עם מחק gDNA (מושלם בזמן אמת)</td><td>TaKaRa, יפן</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>PCR כמותי בזמן אמת </td><td>Bio-rad, ארה"ב</td><td>CFX 96 Touch</td><td>לביצוע תגובת שרשרת פולימראז טרנסקריפטאז הפוך (RT-PCR) </td></tr><tr>כלי <td></td><td></td><td>עיצוב פריימר ובדיקות PCR בזמן אמת (TaqMan)</td><td>https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/</td></tr> <tr><td>T7 RiBoMAX Express RNAi System</td><td>Promega, ארה"ב</td><td>P1700</td><td>לסינתזה dsRNA   in vitro  </td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex TaqTM <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66250/66250eq01.jpg" style="margin: auto; "> (Til RnaseH Plus)</td><td>TaKaRa, יפן</td><td>RR820A</td><td>לביצוע RT-qPCR</td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>KESHI, סין</td><td>GB/T682-2002</td><td>כדי לחלץ RNA</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion, ארה"ב</td><td>15596018</td><td>כדי לחלץ את תכולת ה-RNA הכוללת מדגימות</td></tr><tr><td>מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד </td><td>Thermo, ארצות הברית</td><td>Forma 911</td><td></td></tr></tbody></table>

הפרעות rna בפרזיטואיד ביצה, trichogramma dendrolimi matsumura

RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura

טפילי הביצה, Trichogramma spp, מוכרים כמדבירים ביולוגיים יעילים נגד מזיקים לפידופטרנים שונים בחקלאות וביערות. השלבים הלא בוגרים של צאצאי טריכוגרמה מתפתחים בתוך הביצה המארחת, ומפגינים זעירות יוצאת דופן (כ-0.5 מ"מ אורך בוגר). מתודולוגיית RNA-interference (RNAi) התפתחה ככלי חיוני להבהרת תפקודי גנים באורגניזמים רבים. עם זאת, מניפולציה של RNAi במינים מסוימים של טפילים קטנים, כגון טריכוגרמה, הציבה בדרך כלל אתגרים משמעותיים. במחקר זה אנו מציגים שיטת RNAi יעילה ב-Trichogramma denrolimi. ההליך המתואר כולל רכישה ובידוד של דגימות בודדות של T. dendrolimi מביצים מארחות, תכנון וסינתזה של RNA דו-גדילי (dsRNA), השתלת מבחנה וטיפוח של גלמי T. dendrolimi , מיקרו-הזרקה של dsRNA, והערכה לאחר מכן של הפלת גן המטרה באמצעות ניתוח RT-qPCR. מחקר זה מספק הליך מקיף ומפורט ויזואלית לביצוע ניסויי RNAi ב- T. dendrolimi, ובכך מאפשר לחוקרים לחקור את בקרת הגנים במין זה. יתר על כן, מתודולוגיה זו ניתנת להתאמה למחקרי RNAi או מיקרו-זריקות במינים אחרים של טריכוגרמה עם התאמות קלות, מה שהופך אותה להתייחסות רבת ערך לביצוע ניסויי RNAi במינים אנדופרזיטיים אחרים.

שיעור ההופעה של גלמי T. denrolimi שהוזרקו עם dsFerhch היה נמוך משמעותית מזה של אלה שהוזרקו עם dsGFP או אלה ללא הזרקה (טבלה 1). מבין הצרעות שהופיעו, 51.85% מצרעות T. denrolimi שהיו נתונות ל-dsFerhch פיתחו כנפיים קטנות מעוותות. הצרעות המעוותות לא נצפו בצרעות שהוזרקו להן dsGFP או ללא כל הזרקה (טבלה 1). יתר על כן, הבטן של גלמי T. denrolimi שהוזרקו עם dsFerhch הפגינו מלניזם שהוא הפנוטיפ של מטבוליזם ברזל חריג<sup class="xr...

המניפולציה של הפרעות RNA (RNAi) מהווה אתגר עצום במינים רבים של טפילים בעלי גודל זעיר, כגון צרעות טריכוגרמה . מחקר זה התווה שיטת RNAi יעילה ב - Trichogramma denrolimi. המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל חזק לחקר בקרת גנים בצרעות טריכוגרמה .

הפרעות RNA בפרזיטואיד ביצה, Trichogramma dendrolimi Matsumura

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and ...

צרעות טריכוגרמה הן קבוצה של טפילי ביצים המשמשים להדברת מזיקים לפידופטרנים בחקלאות. החיידק התוך-תאי וולבכיה גורם לפרתנוגנזה תליטוקוסית בחלק מצרעות הטריכוגרמה. אנחנו מנסים לענות על המנגנון של וולבכיה ומערכות קביעת מין בצרעות טריכוגרמה.פיתחנו את שיטת התאבכות הרנ"א בצרעות טריכוגרמה. שיטה זו היא ארגז כלים גנטי חיוני לחקר תפקודי הגן של טריכוגרמה. השלבים הלא בשלים של צאצאי טריכוגרמה מתפתחים בתוך הביצית המארחת.גודל הגוף של טריכוגרמה הוא קטן ביותר ואורכו כ -0.5 מילימטר בבוגר. המניפולציה של כלים גנטיים כגון התערבות RNA ועריכת גנום מציבה אתגר עצום לצרעות הטפיליות הזעירות הללו. במשך עשרות שנים, תפקודי גנים בתוך כל סוג Trichogramma נחקרו רק לעתים רחוקות.המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל איתן לחקר בקרת גנים במהלך פעילויות התפתחותיות ופיזיולוגיות בצרעות טריכוגרמה.

rna-interference-egg-parasitoid-trichogramma-dendrolimi

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקות גן מציאה מבוססות התערבות RNA (RNAi) נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. כאן, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בcastaneum Tribolium. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה המספקת גישה מהירה לפנוטיפים פסד של פונקציה, המאפשר לחוקרים ללמוד פונקציות גן בהקשרים מגוונים.

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח, Tribolium castaneum

פרוטוקול זה מספק הנחיות להפעלת ביצה דחייה ניסויים: חלוקה טכניקות ציור ניסיוני ביצה מודלים כדי לחקות את הצבעים של ביצים טבעי ציפור, ביצוע עבודת שטח, וניתוח הנתונים שנאספו. פרוטוקול זה מספק שיטה אחידה עבור ניסויים דחייה ביצה דומות.

חיטוט מעבר לגבולות ביצים זיהוי באמצעות ניסויים דחייה ביצה לאורך מעברי צבע פנוטיפי

ב פרוטוקול זה, שיטות לעריכת נישואין בתוך המשפחה צלבים, להערכת ההצלחה של אלה צלבים, מתוארים על הנמלה Vollenhovia emeryi. פרוטוקולים אלה חשובים עבור ניסויים להבנת בסיס גנטי של סקס נחישות מערכות דבוראים.

אינדוקציה והערכה של נישואי קרובים צלבים באמצעות הנמלים, Vollenhovia Emeryi

אנו מציגים טכניקה פשוטה cytogenetic באמצעות 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי לקבוע את שיעור ההפרייה יחס העיקרי של המזיק פולשני haplodiploid כנימת עש הטבק.

קביעת שיעור הפריה הביצית של כנימת עש הטבק בטכניקה Cytogenetic

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפרעת רנ"א מתווכת אלקטרופורציה בחרקים מסדר אודונטה (שפיריות וסכרים) באמצעות הסכר הכחול זנב (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) ואתשפירית הרחפן pied (פסאודותמיס זונאטה: Libellulidae: אניסופטרה).

שיטת הפרעות RNA בתתיווך אלקטרופולציה באודונה

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שיטת הגידול של חרקים מזיקים טורטריים במעבדות. ההליכים להבחנה בין מין החרקים ולמיצוי חומצות גרעין לריצוף בתפוקה גבוהה נקבעים באמצעות שני מזיקים מומנטיים.

גידול המוני ומחקרים מולקולריים בחרקים מזיקים בטורטריים

פרוטוקול זה מתאר התאבכות RNA ובדיקת ChIP כדי לחקור את התורשה האפיגנטית של השתקה הנגרמת על ידי RNAi ושינויים כרומטינים הקשורים ב- C. elegans.

ניתוח תורשה אפיגנטית בין-דורית ב- C. elegans באמצעות כתב פלואורסצנטי ומשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת ארס מ Trichogramma dendrolimi באמצעות מארח מלאכותי שנוצר עם סרט פוליאתילן ותמיסת חומצות אמינו.

הפקת ארס מהצרעה הטפילית Trichogramma dendrolimi באמצעות פונדקאי מלאכותי

מוצג כאן פרוטוקול להעברת ננו-חלקיקים chitosan/dsRNA בזחלי בומביקס מורי תולעי משי כדי לגרום להשתקת גנים באמצעות בליעה.

התערבות RNA זחל בתולעי משי Bombyx mori באמצעות Chitosan/dsRNA אספקת ננו-חלקיקים

למד שיטת RNAi בפרזיטואיד ביצה Trichogramma dendrolimi לחקירת תפקודי גנים. השיטה מספקת כלי חיוני לויסות גנים בזחלי דבורים קטנים המשמשים לבקרת מזיקים חקלאיים.

הפרעות RNA בפרזיטואיד ביצה, Trichogramma dendrolimi Matsumura

גלה סרטונים נוספים