Name: כימות של Acanthamoeba spp. תנועתיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: חקור שיטות לכימות תנועתיות Acanthamoeba spp. באמצעות מיקרוסקופיה וניתוח תמונה מתקדם. מחקר זה מספק כלים חזותיים להבנת התנהגות האמבה ולשיפור היגיינת עדשות מגע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>מעקב ארוך טווח וכימות של תנועתיות מיני Acanthamoeba

<ol><li>Randag, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rising+incidence+of+Acanthamoeba+keratitis%3A+A+7-year+nationwide+survey+and+clinical+assessment+of+risk+factors+and+functional+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes.</a> PLoS One. 14 (9), e0222092(2019).</li>
<li>Szentmary, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+keratitis+-+Clinical+signs%2C+differential+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Curr+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba keratitis - Clinical signs, differential diagnosis and treatment.</a> J Curr Ophthalmol. 31 (1), 16-23 (2019).</li>
<li>Carnt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+keratitis%3A+confirmation+of+the+UK+outbreak+and+a+prospective+case-control+study+identifying+contributing+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba keratitis: confirmation of the UK outbreak and a prospective case-control study identifying contributing risk factors.</a> Br J Ophthalmol. 102 (12), 1621-1628 (2018).</li>
<li>Verani, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+outbreak+of+Acanthamoeba+keratitis+associated+with+use+of+a+contact+lens+solution%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">National outbreak of Acanthamoeba keratitis associated with use of a contact lens solution, United States.</a> Emerg Infect Dis. 15 (8), 1236-1242 (2009).</li>
<li>Tu, E. Y., Joslin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+outbreaks+of+atypical+contact+lens-related+keratitis%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Recent outbreaks of atypical contact lens-related keratitis: what have we learned.</a> Am J Ophthalmol. 150 (5), 602-608 (2010).</li>
<li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISO+14729%3A2001%2FA1.+Ophthalmic+optics-Contact+lens+care+products-Microbiological+requirements+and+test+methods+for+products+and+regimens+for+hygienic+management+of+contact+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22International+Organization+for+Standardization%22%5BJournal%5D)">ISO 14729:2001/A1. Ophthalmic optics-Contact lens care products-Microbiological requirements and test methods for products and regimens for hygienic management of contact lenses.</a> International Organization for Standardization. , Geneva, Switzerland. (2010).</li>
<li>ASC Z80, Parent Committee Meeting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf">https://www.thevisioncouncil.org/sites/default/files/ASCZ80_ParentCommitteeMinutes_February_27_2018_FINALMar19-2018.pdf</a> (2023).</li>
<li>Rayamajhee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba%2C+an+environmental+phagocyte+enhancing+survival+and+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba, an environmental phagocyte enhancing survival and transmission of human pathogens.</a> Trends Parasitol. 38 (11), 975-990 (2022).</li>
<li>Reverey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superdiffusion+dominates+intracellular+particle+motion+in+the+supercrowded+cytoplasm+of+pathogenic+Acanthamoeba+castellanii%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Superdiffusion dominates intracellular particle motion in the supercrowded cytoplasm of pathogenic Acanthamoeba castellanii.</a> Sci Rep. 5, 11690(2015).</li>
<li>Thapa, S., Lukat, N., Selhuber-Unkel, C., Cherstvy, A. G., Metzler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+superdiffusion+of+polydisperse+vacuoles+in+highly+motile+amoeboid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Transient superdiffusion of polydisperse vacuoles in highly motile amoeboid cells.</a> J Chem Phys. 150 (14), 144901(2019).</li>
<li>Rudell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acanthamoeba+migration+in+an+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Acanthamoeba migration in an electric field.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (6), 4225-4233 (2013).</li>
<li>Fukaya, S., Aoki, K., Kobayashi, M., Takemura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+the+motility+of+giant+virus-infected+amoebae+using+phase-contrast+microscopic+images%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of the motility of giant virus-infected amoebae using phase-contrast microscopic images.</a> Front Microbiol. 10, 3014(2019).</li>
<li>Fukaya, S., Takemura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+Acanthamoeba+castellanii+infected+with+giant+viruses+quantitatively+revealed+process+of+morphological+and+behavioral+changes+in+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of Acanthamoeba castellanii infected with giant viruses quantitatively revealed process of morphological and behavioral changes in host cells.</a> Microbiol Spectr. 9 (1), 0036821(2021).</li>
<li>Cheng, H. J., Hsu, C. H., Hung, C. L., Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+for+cell+and+particle+tracking+on+microscopy+images+using+algorithms+and+deep+learning+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+J%22%5BJournal%5D)">A review for cell and particle tracking on microscopy images using algorithms and deep learning technologies.</a> Biomed J. 45 (3), 465-471 (2022).</li>
<li>Mathieu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+lens-free+imaging+of+cell+migration+in+diverse+physical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments.</a> Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).</li>
<li>Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+cell+tracks%3A+Quantifying+cell+migration+by+time+lapse+image+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis.</a> Cytometry A. 93 (3), 357-370 (2018).</li>
<li>Piltti, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+time-lapse+imaging+and+single-cell+tracking+of+in+vitro+cultured+neural+stem+cells+-+Tools+for+analyzing+dynamics+of+cell+cycle%2C+migration%2C+and+lineage+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell time-lapse imaging and single-cell tracking of in vitro cultured neural stem cells - Tools for analyzing dynamics of cell cycle, migration, and lineage selection.</a> Methods. 133, 81-90 (2018).</li>
<li>Campolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+real-time+motility+analysis+of+Acanthamoeba+reveals+sustained+movement+in+absence+of+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Continuous real-time motility analysis of Acanthamoeba reveals sustained movement in absence of nutrients.</a> Pathogens. 10 (8), 995(2021).</li>
<li>Campolo, A., Patterson, B., Lara, E., Shannon, P., Crary, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+recovery+of+Acanthamoeba+motility+among+surviving+organisms+after+contact+lens+care+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Complete recovery of Acanthamoeba motility among surviving organisms after contact lens care disinfection.</a> Microorganisms. 11 (2), 299(2023).</li>
<li>Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+affecting+the+recovery+of+Acanthamoeba+trophozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites.</a> Pathogens. 10 (2), 221(2021).</li>
<li>imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started">https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started</a> (2024).</li>
<li>Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Gaussianity%2C+population+heterogeneity%2C+and+transient+superdiffusion+in+the+spreading+dynamics+of+amoeboid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells.</a> Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&frac14; צלצול" s solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BR0052G</td><td>טבליות פתרון טבעות אוקסואידים. עקוב אחר ההוראות כדי ליצור רבע חוזק במקום צלצול בעוצמה מלאה.&nbsp;</td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L פיפטה</td><td>אפנדורף מחקר</td><td>3123000039</td><td>2 ומיקרו; L-20 ומיקרו; L ערוץ יחיד</td></tr><tr><td>10 ומיקרו; קצות פיפטה L</td><td>נפטון סיינטיפיק, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב</td><td>BT10.N</td><td>10 ומיקרו; L קצה מחסום אוניברסלי</td></tr><tr><td>48 צלחת</td><td>באר Millipore Sigma, &nbsp;</td><td></td><td>CLS3548 Corning Costar TC-Treated TC צלחת בארות מרובות: צלחת פוליסטירן, בארות תחתונות שטוחות, סטריליות, עם מכסה</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים (1 לכל דגימה, 1 לכל מעבר 2 דגימה)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>Falcon 352098</td><td>Falcon 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים בהירות גבוהה, צלחת פוליפרופילן</td></tr><tr><td>96 בארות</td><td>Millipore Sigma, ברלינגטון, MA, ארה"ב</td><td>CLS3596</td><td>צלחת בארות מרובות קורנינג קוסטאר TC: צלחת פוליסטירן, בארות תחתונות שטוחות, סטריליות, עם מכסה</td></tr><tr><td>Acanthamoeba&nbsp; </td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td><td>ATCC 30461</td><td>פרוטוקול זה אומת עבור ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 ו-PRA-411</td></tr><tr><td>Axenic Culture Media (AC6)</td><td>תוצרת בית</td><td>n/a</td><td>המכילה 20 גרם ביוזאט פפטון, 5 גרם גלוקוז, 0.3 גרם KH2PO4, 10 ומיקרו; גרם ויטמין B12, וכוס 1 5 מ"ג&nbsp; L-מתיונין לליטר מים מזוקקים נטולי יונים. התאם את ה-pH ל-6.6-6.95 עם 1 M NaOH וחיטוי ב-121 מעלות; C למשך 20 דקות, יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד 3 חודשים.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה ורוטור מתאים</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, ארה"ב</td><td>Sorvall ST 40R</td><td>כל צנטריפוגה ורוטור מקבילים מקובלים כל עוד הם יכולים לסובב צינורות חרוטיים של 50 מ"ל ב-500 x g למשך 5 דקות</td></tr><tr><td>כימוטקסיס וכלי</td><td></td><td></td> הגירה <td>תוכנה חינמית המבוססת על ImageJ, זמינה ב-https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td> <td>חד פעמיBulldog Bio, פורטסמות', ניו המפשייר ארה"ב</td><td>DHC-N01</td><td>Neubauer המוציטומטר חד פעמי משופר בעל 2 שבבים, תוכנת ImageJ לא פירוגנית ארוזה בנפרד</td></tr><tr><td>עם תוסף Trackmate (פרוטוקול זה נכתב עם Trackmate גרסה 6.0.2.)</td><td></td><td></td><td>תוכנה חינמית שפותחה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, זמינה ב-imagej.net. תוסף Trackmate זמין ב</td></tr> <tr><td>https://imagej.net/plugins/trackmate/ מיקרוסקופ, רצוי עם שלב נע אוטומטי</td><td>ניקון, טוקיו, יפן</td><td></td> נעשה <td>שימוש במיקרוסקופ Nikon Eclipse Ti-U במחקר זה והשלב הנייד האוטומטי שימש כדי להיות מסוגל להקליט תמונות במספר בארות בו זמנית.</td></tr><tr><td>תוכנת NIS-Elements</td><td>פיפטה סרולוגית ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק, המפטון, ניו המפשייר ארה"ב</td><td>BrandTech 26331</td><td>BrandTech accu-jet pro בקר פיפט</td></tr><tr><td>קצות פיפטה סרולוגיות</td><td>VWR</td><td>5 מ"ל: 76201-710 10 מ"ל: 170356 25 מ"ל: 89130-900 50 מ"ל: 75816-088</td><td>VWR פיפטה סרולוגית,</td></tr><tr><td>תא זרימת שידור אלומיניום סטרילי לא פירוגני</td><td>Biosurface Technologies Corporation, בוזמן, MT, ארה"ב</td><td>FC 81-AL</td><td>תא זרימת שידור חד ערוץ מאלומיניום אנודייז עם טביעת רגל של 96 בארות לשימוש עם מיקרוסקופ הפוך</td></tr><tr><td>צלוחיות T75</td><td>VWR, רדנור, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>734-2316</td><td>בקבוק תרבית רקמות VWR, 182.5 ס"מ, מטופל פני השטח, מכסה אטם תקע, סטרילי</td></tr></tbody></table>

כימות של acanthamoeba spp. תנועתיות

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

כדי להשיג הצלחה באמצעות שיטה זו, ישנם מספר חלקים כלליים מכריעים שיש לקחת בחשבון. הראשון הוא ההתקנה הפיזית של האמבה והמיקרוסקופ, השני הוא ניצול נכון של תוכנת ההדמיה, והשלישי הוא ייצוא וניתוח נתוני ההדמיה בצורה משמעותית.
לפני תחילת ההקלטה המיקרוסקופית, חיוני לוודא שהאמבה ממוקדת כראוי בשלב המיקרוסקופ (איור 1). במקום להתמקד באמבה במישור Z האופטימלי ביותר עבור פרטים בודדים, כאן אידיאלי לראות אותן מעט מאוד מחוץ לפוקוס כך שהן יהפכו לנקודות שחורות מוצקות בניגוד למצבן השקוף כאשר מסתכלים עליהן בפירוט. צפייה בהם בדרך זו תאפשר לתוכנת ההדמיה ולתוכנת המעקב למצוא כל אמבה בודדת בקלות רבה יותר כאשר הקובץ מומר לבינארי (איור 2). הידיעה מה המטרה בתוכנת ההדמיה - כלומר, שכל אמבה תופיע כעיגול לבן מוגדר היטב, עשויה לעזור לקורא למצוא את המיקוד הנכון בעת צילום התמונות המקוריות בשדה בהיר. לאחר מכן, כאשר כל עיגול מוגדר בבירור, תוכנת המעקב תוכל לעקוב כראוי אחר התנועתיות של כל אמבה ולאסוף את מדדי התנועתיות האינדיבידואליים עבור כל אמבה.
לאחר ביצוע ההוראות שלב אחר שלב בפרוטוקול המפורט לעיל עבור תוכנת ההדמיה ותוכנת המעקב והפניה לווידאו המשויך כדי לסייע בשלבים הראשונים המכריעים של השימוש בתוכנת ההדמיה, הגיע הזמן לייצא את נתוני תוכנת ההדמיה לצורך כימות וניתוח נתונים. התפוקה הגולמית מתוכנת המעקב תהיה דומה למה שנראה באיור 3. כאן, חשוב לבדוק שמספר המקומות במסלולים שהוא ייצא נכון למצופה (למשל, אם מישהו ביקש ש-93% מהפריימים יהיו נוכחים בכל רצועה והיו לו 100 פריימים בסך הכל בסרטון, כל רצועה מיוצאת צריכה להיות גדולה או שווה ל-93 נקודות). אם הכתמים אינם תואמים את הדרישות, ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלבי תוכנת המעקב כדי להבטיח שהפרמטרים הנדרשים הוגדרו כראוי.
מהייצוא הגולמי, התחל לבנות את גיליון ניתוח הנתונים (איור 4). חשוב לזכור שכל רצועה מייצגת אמבה סינגולרית בתוך העתק יחיד. לכן, כפי שניתן לראות באיור 4, איור 5 ואיור 6, כל הרצועות עבור ערכת פריימים או נקודת זמן חייבות להיות ממוצעות (איור 4), ותהליך זה חייב להיעשות עבור כל קבוצת פריימים או נקודת זמן בסדרה שלמה (כלומר, אם מצלמים סך של 3 שעות וידאו ונקודות הנתונים מחולקות לפי שעה, לאחר מכן יהיו שלוש קבוצות פריימים / שעות לנתח לכל שכפול, איור 5). לבסוף, משילוב זה של ממוצעים בכל מסגרת בכל שכפול, יש לשלב את הנתונים הממוצעים מכל שכפול למרחב אחד, כך שניתן יהיה לנתח את הנתונים על פני מספר עותקים משוכפלים כדי לקבוע את הממוצע האמיתי וסטיית התקן לכל נקודת זמן (איור 6).
הממוצעים מכל משוכפל ישמשו לניתוח נתונים, והממוצע המשולב וסטיית התקן או שגיאת התקן מכל המשוכפלים ישמשו לייצוג גרפי (כפי שניתן לראות בדוגמה באיור 7). אם מנתחים נתונים כפי שעשינו כאן, כלומר דגימות מרובות שנמצאות במעקב על פני נקודות זמן מרובות, הכי מתאים לנתח אותם באמצעות מדידה חוזרת דו-כיוונית ANOVA עם מבחן טוקי פוסט הוק. זה מאפשר לנו לקבוע את ההבדלים בין הדגימות בכל נקודת זמן וגם לקבוע את ההבדלים בתוך כל מדגם לאורך זמן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig01.jpg"> איור 1: אמבה מופיעה כצורות כהות אטומות במיקרוסקופ שדה בהיר. מוגדל בתמונה מייצגת של אמבה בהגדלה פי 4, מעט מחוץ למיקוד כדי להופיע כעיגולים כהים מוצקים. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig02.jpg"> איור 2: אמבה שצולמה במיקרוסקופ שדה בהיר שהומרה לבינארית ונמצאת במעקב. אמבה בהגדלה פי 4, בשדה בהיר (משמאל), הומרה לבינארית עם חפצים שהוסרו (באמצע), ולאחר מעקב, עם רצועות נבחרות המוצגות (מימין). שורה עליונה: תמונה שלמה היטב על ידי תפירת 4 תמונות יחד, סרגל קנה מידה = 1000 מיקרומטר. שורה תחתונה: גודל תמונה בודדת לפני התפירה, סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig03.jpg"> איור 3: פלט ניתוח נתונים מיידי מתוכנת ההדמיה והמעקב מכיל מגוון רחב של סוגי נתונים. הפלט המייצג מהמעקב מוצג באיור 2, שהוא סרטון יחיד. שים לב למספרי הדילוג על מספרי המסלולים (חץ אדום), המציינים שתוכנת המעקב הסירה כראוי רצועות שלא התיישרו עם הפרמטרים. בדוגמה זו, רק 71 מתוך 5385 מסלולים מזוהים תואמים לפרמטרים. יחס זה הוא נורמלי, בהתחשב בהנחיות קפדניות כאלה. מספר רצועות זה תואם גם את מספר האמבות המשמשות בפרוטוקול זה (לדוגמה, אם לוחית בת 96 בארות נזרעת עם 200 μL של 7.5 x 103 CFU/mL לכל באר, אז יש לצפות לכ-1,500 אמבות בבאר ובערך למספר זה הנראה בשדה ראייה של 4 תפרים. סביר להניח שיהיו הרבה יותר מסלולים מאשר אמבה כאשר אמבה הולכת על שדה הראייה ומחוצה לו, ומייצרת מסלולים חדשים). מספר מסלול זה ניכר שוב באיור 2, שם ניתן לראות רק מסלולים מעטים בהשוואה למספר רב של נקודות. בדוק תמיד את מספר המקומות במסלול (תיבה אדומה) כדי לוודא שרק אורכי המסלול הנכונים כלולים. לדוגמה, כאן, אנו כוללים יותר מ 93% של מסגרות, והיו 127 מסגרות בסעיף זה, כך שכל מספרי כתמים צריך להיות מעל 118. מודגשות בצהוב המדידות שהוזכרו בפרוטוקול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig04.jpg"> איור 4: הנתונים מאורגנים מחדש לפי הצורך לאחר פלט הנתונים הראשוני. ארגון הנתונים המבוקשים לאחר הייצוא. (A) המדידות הרלוונטיות שנבחרו לכימות הועתקו מייצוא תוכנת המעקב (איור 3) והודבקו בגיליון אלקטרוני חדש. (ב) לאחר ארגון המדידות הרצויות בגיליון האלקטרוני החדש, יש לחשב את הממוצע של כל רצועה. כך, בדוגמה מייצגת זו, המרחק הכולל, המרחק המרבי, הכליאה, המהירות הממוצעת והתזוזה של כל רצועה שמישה בסרטון יחיד זה הוערכו למספר יחיד עבור כל מדידה. שימו לב שוב כאן שבסך הכל 71 רצועות עמדו בפרמטרים של מסגרות 1-127. סביר להניח שיהיה מספר שונה של רצועות מתאימות מכל סרטון או ערכת פריימים שנותחו, כפי שניתן לראות באיור 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig05.jpg"> איור 5: מסגרות רציפות שהוגדרו לניתוח של סדרת תמונות או סרטון שלמים. זוהי תמונה מייצגת של הוספת סרטונים עוקבים לניתוח נתונים. בהנחה שפריימים 1-127 מהווים את שעה 1 של הסרטון (כאן, שעה אחת מורכבת מצילום תמונה אחת ל-28 שניות). מסגרות 128-254 יהיו שעה 2 של וידאו, ומסגרות 255-381 יהיו שעה 3 של וידאו. שלב את הנתונים המיוצאים (כפי שיוצאו באיור 3) מכל השעות לגיליון אחד כדי לעבוד איתם בבת אחת. כפי שנעשה באיור 4, הנתונים מכל המסלולים השמישים עבור כל ערכת פריימים יהיו ממוצעים. כל דבר באיור 5 הוא נתונים מהעתק אחד או מדגם אחד. אם יש 3 עותקים משוכפלים, אז יהיו 3 כרטיסיות גיליון אלקטרוני נפרדות זהות, והנתונים מהן יוזנו לכרטיסייה חדשה, כפי שמודגם באיור 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig06.jpg"> איור 6: נתונים מורכבים מכל האמבות בכל ערכת מסגרות המשמשות לייצוג שכפול יחיד. (A) יש לאסוף את כל הממוצעים מכל מסגרת שנקבעה באיור 5 במיקום מרכזי כדי שניתן יהיה להשלים את ניתוח הנתונים הסופי. בתמונה מייצגת זו מוצגים ממוצעי המרחק הכולל משלוש ערכות המסגרות (או השעות) הראשונות. יש לחזור על פעולה זו עבור כל דגימה/תנאי/שכפול שמופעל. לאחר מכן, יש לחשב את הממוצעים מכל מדגם מכל ערכת מסגרות (תיבה צהובה). זוהי נקודת הנתונים הסופית שממנה ניתן לחשב סטיית תקן ושגיאת תקן. הממוצעים הנפרדים מכל מדגם (כאן, המספרים ב- B3, B4 ו- B5 עבור מדגם המרחק הכולל 1; C3, C4 ו- C5 עבור מדגם מרחק כולל 2 וכו') ישמש להפעלת הניתוח הסטטיסטי. תהליך זה יחזור על עצמו בכל המדידות הנדרשות (מרחק מקסימלי, כליאה, מהירות ממוצעת, תזוזה וכו ') (B) כדי ליצור ייצוג גרפי של הכימות, השתמש במספרים בתיבה הצהובה כנקודות נתונים לשימוש עבור הגרף הסופי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig07.jpg"> איור 7: נתוני תנועתיות גולמיים עבור ATCC 30461 ו-ATCC 50370. נתונים גולמיים (המיוצגים כאן כממוצע ± SE עבור כל שעה) נאספו בעבר ולא פורסמו עבור מחקרים קודמים 18,19. כימות תנועתיות זה מדגים כי שתי אמבות אלה דומות ב-6 השעות הראשונות של תנועתיותן (כפי שנמדדו על ידי המרחק הכולל במיקרונים שנסעו באותה שעה) בתמיסת רינגר של 1/4 על משטח זכוכית. כל נקודת זמן מייצגת שלושה העתקים נפרדים, שכל אחד מהם מורכב מ-20-200 רצועות אמבה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כימות של Acanthamoeba spp. תנועתיות

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential ...

quantification-of-acanthamoeba-spp-motility

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Assay מסלול תנועתיות phagokinetic הוא שיטה המשמשת כדי להעריך את התנועה של תאים. באופן ספציפי, assay מודד chemokinesis (תנועתיות תאים האקראיות) לאורך הזמן באופן כמותי. Assay מנצל את יכולתם של תאים ליצור מסלול למדידת התנועה שלהם על coverslips colloidal מצופה זהב.

הערכה כמותית של נדידת תאים על ידי Assay כושר תנועת המסלול Phagokinetic

מקור: Morales-Soto, N. et al., הכנה, הדמיה וכימות של מבחני תנועתיות פני השטח של חיידקים. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים בדיקת נחיל באמצעות חיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לצפות בתנועתיות פני השטח על אגר רך. הדמיית זמן-lapse לוכדת התרחבות מתואמת והיווצרות קנוקנות, ומדגישה את תנועתיות פני השטח של החיידקים.

בדיקת נחיל להמחשת תנועתיות פני השטח של חיידקים

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפילים במקרופאגים שמקורם במח עצם (BMM). תאי המקרופאגים נגועים בשלבים הפולשניים התנועתיים והלא תנועתיים של לישמניה, פרומסטיגוטים מטאציקליים ואמסטיגוטים, בהתאמה. הטפילים פולשים למקרופאגים, מופנמים לחלל טפילי ומתרבים בפנים. צמיחת הטפיל התוך-תאי מכומתת באמצעות מיקרוסקופ על צביעה פלואורסצנטית של גרעיני המקרופאגים והטפילים.

בדיקה חוץ גופית לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפיל במקרופאגים

תנועתיות הנחיל מושפעת מגורמים פיזיקליים וסביבתיים. אנו מתארים פרוטוקול דו-שלבי והנחיות לעקיפת האתגרים הקשורים בדרך כלל להכנת בדיקת נחילים ואיסוף נתונים. נעשה שימוש בטכניקת הדמיה מקרוסקופית כדי לקבל מידע מפורט על התנהגות נחיל שאינו מסופק על ידי טכניקות הניתוח הנוכחיות.

הכנה, הדמיה, וכימות של מבחני תנועתיות Surface בקטריאלי

חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

פרוטוקול זה מתאר שתי בדיקות רגישות להפלות בין ליקויים מוטוריים קלים, בינוניים וחמורים בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב, עם תועלת כללית לזני C. elegans , עם תנועתיות שונה.

הערכה של ליקוי מוטורי בדגמי C. elegans של טרשת אמיוטרופית לרוחב

כאן, אנו מתארים את השימוש בלוחות הדרגתיים ממריצים כדי להעריך את תנועתיות נחיל החיידקים ובו זמנית להשיג תגובות ריכוז מרובות.

כימות תנועתיות נחיל משטח חיידקי על לוחות הדרגתיים ממריץ

קינסין-5 Cin8 המיטוטי הדו-כיווני מצטבר באשכולות המתפצלים ומתמזגים במהלך תנועתיותם. הצטברות באשכולות משנה גם את המהירות והכיווניות של Cin8. כאן מתואר פרוטוקול לבדיקות תנועתיות עם Cin8-GFP מטוהר וניתוח תכונות תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8.

תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של קינסין-5 Cin8 דו-כיווני מטוהרים מתאי S. cerevisiae

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר כוכבי שביט אקטין על פני השטח של חרוזים תוך שימוש ברכיבי חלבון זמינים מסחרית. מערכות כאלה מחקות את המבנים הבולטים הנמצאים בתאים, וניתן להשתמש בהן כדי לבחון מנגנונים פיזיולוגיים של ייצור כוח בצורה פשוטה.

שחזור של תנועתיות מבוססת אקטין עם חלבונים זמינים מסחרית

פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה ויעילה לזיהוי גורמים גנטיים המעורבים בסוגים שונים של תנועתיות ב-Pseudomonas aeruginosa.

שיטה בעלת תפוקה גבוהה להתבוננות בפנוטיפים של תנועתיות ב-Pseudomonas aeruginosa

חקור שיטות לכימות תנועתיות Acanthamoeba spp. באמצעות מיקרוסקופיה וניתוח תמונה מתקדם. מחקר זה מספק כלים חזותיים להבנת התנהגות האמבה ולשיפור היגיינת עדשות מגע.

כימות של Acanthamoeba spp. תנועתיות

גלה סרטונים נוספים