זרימת עבודה להערכה כמותית של המיקרוביום החיידקי האנדופיטי והאפיפיטי של קליפת הצפצפה

[מגישה] זרימת עבודה להערכה כמותית של המיקרוביום החיידקי האנדופיטי והאפיתטי של קליפת הצפצפה טריכוקרפה. כאן תכננו ובדקנו זרימת עבודה מפורטת כדי לחקור את המיקרוביום המתיישב ברקמות הפנימיות או במשטחי הקליפה של Populus trichocarpa. זרימת עבודה זו מתארת בפירוט את הדגימה של המיקרוביום האנדופיטי והאפיתטי של קליפת Populus trichocarpa, עיבוד חומרים שנאספו, מיצוי DNA גנומי, הגברת PCR של אזורי יעד, הכנת ספריות DNA וריצוף המיקרוביום החיידקי האנדופיטי והאפיתטי באמצעות טכנולוגיית ריצוף הדור הבא. אנו מספקים גם הליך אנליטי קצר לנתוני הריצוף המתקבלים. זרימת עבודה מוכחת זו תספק גישה יעילה לחקירה אמפירית של קהילות המיקרוביום האנדופיטי והאפיתטי של קליפת הצפצפה ומיני יער אחרים. גדל שתילי צפצפה טריכוקרפה בני שלושה חודשים בתא גידול, חתוך את קטעי הגבעול באורך 10 סנטימטרים של צפצפה טריכוקרפה משני עד 12 סנטימטרים מעל פני האדמה המעוקרים באמצעות גוזם מעוקר. מניחים את קטעי הגבעול בצלחת פטרי מרובעת מעוקרת. נגב שוב ושוב את האפידרמיס של הגבעול על צלחת הפטרי המרובעת המעוקרת באמצעות כותנה סטרילית עם 0.1%. טווין 20. אחסן כל פיסת כותנה המכילה מיקרואורגניזמים, דגימות אפיתטיות בצינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר ניגוב משטח הגבעול, חותכים את הקליפה בעזרת אזמל סטרילי, מקלפים את הקליפה ומניחים אותה בצלחת פטרי מרובעת. חותכים את הקליפה המופשטת מהגבעול לקטעים של כסנטימטר אחד בעזרת אזמל סטרילי. עקרו את משטחי הסגמנט על ידי השריית 70% אלכוהול למשך שתי דקות, ולאחר מכן השרו את הקטעים בנתרן היפוכלוריט עם 0.1%, טווין 80 למשך חמש דקות. לבסוף, יש לעקר את הקטעים ב-70% אלכוהול למשך 30 שניות. לאחר מכן שטפו את כל הדגימות שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים והניחו אותן על ספסל נקי לייבוש באוויר. אחסן כל דגימות אנדופיטיות של קליפת גזע מעוקרת בצינור צנטריפוגה סטרילי של שני מיליליטר במינוס 80 מעלות צלזיוס. הניחו את חלקי קליפת הגבעול בצינורות קשים סטריליים של חמישה מיליליטר והוסיפו שלושה חרוזי פלדה מעוקרים לכל צינור. הקפיאו את הצינורות הקשים המכילים את הדגימות בחנקן נוזלי למשך 10 דקות. מועכים את דגימות הקליפה במשך חמש דקות בעזרת מקצף חרוזים. לאחר מכן הקפיאו שוב את הצינור הקשה בחנקן נוזלי למשך דקה אחת וחזרו על שלב הכאת החרוזים למשך חמש דקות. הוסיפו את קליפת הגבעול הכתוש של Populus trichocarpa ואת קהילות החיידקים האפיתטיות המודבקות בכותנה, 0.25 גרם כל אחת, לכל אחד מצינורות החרוזים ולאחר מכן הוסיפו 60 מיקרוליטר של תמיסה C1 המסופקת על ידי ערכה מסחרית, וערבבו בעדינות על ידי היפוך. לאחר מכן, הומוגניזציה של הדגימות האנדופיטיות והאפיתטיות באמצעות מקצף חרוזים בארבע ריצות של דקה אחת. לאחר כל ריצה, הניחו את הדגימות על קרח למשך 30 שניות. צנטריפוגה של הצינורות בעוצמה של פי 10,000 מכוח הכבידה למשך דקה אחת, מחלצים את הדגימות האנדופיטיות והאפיתטיות באמצעות ערכה בהתאם להוראות היצרן, מוסיפים 30 מיקרוליטר של תמיסה C6 למרכז קרום המסנן הלבן ודוגרים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. צנטריפוגה בכוח משיכה פי 10,000 בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. למדוד את ריכוזי ה-DNA הגנומי המופק מדגימות אפיתטיות ואנדופיטיות באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח. יש לדלל כל דגימת DNA ב-ddH2O סטרילי לשני ננוגרם למיקרוליטר כדי לקבל את תבנית ה-DNA להגברת PCR. להגביר את אזור V5 עד V7 של הגן החיידקי 16S rRNA באמצעות פריימר קדימה 799F ופריימר הפוך 1193R. בינתיים, הגבירו את אזור ה-V4 של הגן החיידקי 16S rRNA באמצעות הפריימר הקדמי 5115F והפריימר ההפוך 806R. מערבבים היטב כל דגימה וצנטריפוגה כדי לחסל בועות. בצע הגברה של אזור V5 ל-V7 או V4 של הגנים החיידקיים 16S rRNA על מחזור תרמי. טען חמישה ליטר מיקרוליטר מכל דגימה Amplicon על ג'ל אגרוז 1% ובצע אלקטרופורזה ב-120 וולט למשך 30 דקות. צפו בג'ל תחת נורות UV כדי לאמת הגברת PCR מוצלחת. עבור כל דגימה, מערבבים שלושה שכפולים של מוצרי ההגברה של PCR בצינור PCR. קבעו את ריכוז המוצרים המוגברים באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. מדוד את הקרינה באמצעות קורא מיקרו-פלטות. שרטט עקומת DNA סטנדרטית והשתמש בה כדי לחשב את ריכוזי ה-DNA של המוצרים המוגברים. על פי הריכוז הנמדד שלהם, מערבבים את תוצרי ה-PCR שהתקבלו מהדגימות האנדופיטיות או האפיפיטיות מקליפת Populus trichocarpa בריכוז שווה כדי לבנות את ספריית Amplicon. לבצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז באמצעות מכשיר אלקטרופורזה. הכינו בקצרה ג'ל אגרוז 1.3%, 1.3 גרם אבקת אגרוז ב-100 מיליליטר של מאגר TAE חד פעמי. הסר את המסרקים לאחר התמצקות הג'ל והנח את הג'ל במיכל אלקטרופורזה עם מאגר TAE חד פעמי. לאחר מכן, הוסף יחידת נפח אחת של מאגר טעינה כתום פי שש לחמש יחידות נפח של כל מוצר PCR עם 100 מיקרוליטר של הסולם נטען בכל באר. הוסף 30 מיקרוליטר מסולם ה- DNA לבאר אחת. לאחר חיבור החוטים החיוביים והשליליים, בצע אלקטרופורזה 80 וולט למשך 50 דקות. הסירו שברי DNA מג'ל אגרוז באמצעות אזמל נקי וחד. שוקלים את פרוסת הג'ל ומעבירים אותה לצינור חסר צבע. הוסף חיץ כדי לטבול את פרוסת הג'ל. בצע מיצוי ג'ל באמצעות ערכת מיצוי הג'ל בהתאם להוראות היצרן. קבע את הריכוז של ספריית Amplicon המטוהרת בפלואוריומטר באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן לרצף פרופילים. קרא שפופרות בדיקה סטנדרטיות ודוגמיות באמצעות פלואורמטר ואשר את איכות הספרייה על ידי הדמיה של פס יחיד. לנתח ולהוסיף הערות לרצפי הגנים 16S rRNA באמצעות CHAM II. ערוך ביאורים טקסונומיים באמצעות מסד הנתונים של Silver בהתאם לרצפי הפניות. דמיין את התוצאות הללו באמצעות חבילת ggplot2 ב- R. הושג DNA גנומי באיכות גבוהה של המיקרוביום החיידקי האנדופיטי והאפיתטי של קליפת Populus trichocarpa. הגברת ה-PCR של כל 12 הדגימות הניבה רצועות חזקות בודדות בגודל הנכון. ספריית Amplicon נבנתה עוד עם פסגה אחת שמילאה את דרישות הריצוף מראש. עבור המיקרוביום האנדופיטי, קריאות באיכות גבוהה התקבלו באמצעות זוגות הפריימרים 799F/1193R ו-515F/806R בהתאמה. זוג הפריימר 799F/1193R הניב פחות קריאות צמחים מוגברות באופן משמעותי. מספר ה-ASV מהמיקרוביום האפיתטי של קליפת ה-Populus trichocarpa היה גבוה משמעותית בעת שימוש בפריימרים 799F/1193R בהשוואה ל-515F/806R. מדד שאנון הוערך כנמוך יותר בקהילת החיידקים האפיפיטית של הקליפה מאשר בקהילת החיידקים האנדופיטית באמצעות זוג הפריימר 799F/1193R. מאפיינים טקסונומיים של קהילות חיידקים בחלקי הקליפה האנדופיטיים והאפיפיטיים של Populus trichocarpa נחקרו עוד יותר באמצעות זוג הפריימר 799F/1193R. זרימת עבודה אמינה ויעילה מאיסוף דגימות ועד ניתוח נתונים נבנתה כדי לכמת את ההרכב והמגוון של המיקרוביום החיידקי האנדופיטי והאפיתטי של קליפת Populus trichocarpa. הפרוטוקול שלנו עשוי לשמש נתיב לחקר המיקרוביום של הקליפה של מיני צמחים עציים, ולאפשר הבנה טובה יותר של המאפיינים של קהילות חיידקים המאכלסות צמחים עציים אחרים.