Name: AQRNA-seq לכימות רנא קטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: חקור שיטת AQRNA-seq לכימות מוחלט של רנ"א קטן כמו microRNAs ו-tRNAs בדגימות ביולוגיות. למד כיצד לזהות שינויים בבריכת ה-tRNA ב-Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמת הנגרמת מרעב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחברי העבודה הנוכחית אסירי תודה למחברי המאמר המקורי המתאר את טכנולוגיית AQRNA-seq7. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) וקרן המחקר הלאומית של סינגפור באמצעות הברית סינגפור-MIT למחקר וטכנולוגיה עמידות מיקרוביאלית IRG.

ניתוח דינמיקת tRNA באמצעות AQRNA-seq

<ol><li>Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+RNA+sequencing+into+clinical+diagnostics%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges.</a> Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).</li>
<li>Grillone, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+cancer%3A+platforms+and+strategies+for+investigating+the+genomic+%26%2334%3Bdark+matter.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic &#34;dark matter.&#34.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Goh, J. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+multiplexed+RNA+imaging+in+tissues+with+split-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.</a> Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Cummings, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+diagnosis+in+Mendelian+disease+with+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing.</a> Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).</li>
<li>Hu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+the+cellular+small+RNA+landscape+with+AQRNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq.</a> Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).</li>
<li>Alon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+bias+in+high-throughput+multiplex+sequencing+of+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA.</a> Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).</li>
<li>Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cell+stresses+induce+unique+patterns+of+tRNA+up-+and+down-regulation%3A+tRNA-seq+for+quantifying+changes+in+tRNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number.</a> Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+impact+of+RNA+secondary+structure+across+the+Arabidopsis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome.</a> Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).</li>
<li>García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+diversity+is+a+systematic+source+of+variation+in+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data.</a> PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).</li>
<li>FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+an+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+a+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: a language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).</li>
<li>Ougland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlkB+restores+the+biological+function+of+mRNA+and+tRNA+inactivated+by+chemical+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation.</a> Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).</li>
<li>Bernhardt, H. S., Tate, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+soup+or+vinaigrette%3A+did+the+RNA+world+evolve+at+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH.</a> Biol Direct. 7, 4(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.+J%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
</ol>

P.C.D. הוא ממציא של שני פטנטים (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) הנוגעים לעבודה שפורסמה.

תהליך העבודה להכנת ספריית AQRNA-seq נועד למקסם את לכידת הרנ"א בתוך דגימה ולמזער את נפילת הפולימראז במהלך שעתוק לאחור7. באמצעות קשירת מקשר דו-שלבית, אוליגוס DNA חדש (Linker 1 ו-Linker 2) נקשר בעודף כדי להשלים באופן מלא את ה-RNA שבתוך הדגימה. ניתן להסיר ביעילות קישורים עודפים באמצעות RecJf, אקסונוקלאז בגודל 5' עד 3' הספציפי לדנ"א חד-גדילי, ולהשאיר את המוצרים הקשורים ללא פגע. בנוסף, טיפול AlkB מפחית שינויים מתיל על RNA18, אשר עלול לגרום לנפילת פולימראז במהלך שעתוק לאחור, ובכך ...

ריצוף הדור הבא (באנגלית: Next generation sequencing או בקיצור NGS) היא טכנולוגיית ריצוף DNA הכוללת פיצול DNA, קשירת אוליגונוקלאוטידים מתאמים, הגברה מבוססת תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ריצוף הדנ"א והרכבה מחדש של רצפי המקטעים לגנום. ההתאמה של NGS לרצף RNA (RNA-seq) היא גישה רבת עוצמה לזיהוי וכימות תעתיקי RNA וגרסאותיהם1. התפתחויות חדשניות בתהליכי עבודה של הכנת ספריות RNA וצינורות ניתוח ביואינפורמטיקה, יחד עם התקדמות במכשור מעבדתי, הרחיבו את הרפרטואר של יישומי RNA-seq, והתקדמו מעבר לריצוף אקסומי לאומיקה פונקציונלית מתקדמת כמו פרופיל RNA לא מקודד2, אנליזה של תא בודד3, תעתיק מרחבי 4,5, ניתוח שחבור חלופי6בין היתר., שיטות RNA-seq מתקדמות אלה חושפות תפקודי RNA מורכבים באמצעות ניתוח כמותי של השעתוק בתאים ורקמות נורמליים וחולים.
למרות התקדמות זו ב- RNA-seq, מספר תכונות טכניות מרכזיות מגבילות את הכוח הכמותי של השיטה. בעוד שרוב שיטות ה-RNA-seq מאפשרות כימות מדויק ומדויק של שינויים ברמות ה-RNAs בין משתני ניסוי (כלומר, דגימות ביולוגיות ו/או מצבים פיזיולוגיים), הן אינן יכולות לספק השוואה כמותית של רמות מולקולות ה-RNA בתוך דגימה. לדוגמה, רוב שיטות ה-RNA-seq אינן יכולות לכמת במדויק את המספר היחסי של עותקים של מולקולות איזו-מקובלות tRNA בודדות במאגר תאי של tRNA מבוטא. כפי שמודגש בפרסום הנלווה7, מגבלה זו ל-RNA-seq נובעת ממספר תכונות של מבנה הרנ"א והביוכימיה של הכנת ספריות. לדוגמה, פעילותם של אנזימי הקשירה המשמשים לחיבור מקשרי הריצוף מקצה 3' ו-5' למולקולות RNA מושפעת מאוד מזהות הנוקלאוטידים הסופיים של הרנ"א ומקשרי הריצוף. זה מוביל לשינויים גדולים ביעילות של קשירת המקשרים ולעלייה מלאכותית עמוקה ברצף קריאות 8,9,10.
קבוצה שנייה של מגבלות נובעת מהתכונות המבניות הטבועות במולקולות RNA. באופן ספציפי, היווצרות מבנה משני של RNA ושינויים דינמיים בעשרות שינויי RNA שלאחר שעתוק של האפיטרנסקריפטום יכולים לגרום לנפילה או מוטציה של פולימראז במהלך שעתוק הפוך. שגיאות אלה גורמות לסינתזה חלקית או קטועה של cDNA או לשינוי ברצף הרנ"א. בעוד שניתן לנצל את שתי התופעות הללו כדי למפות מבנים משניים או שינויים מסוימים, הן פוגעות בדיוק הכמותי של RNA-seq אם שלבי הכנת הספרייה הבאים נכשלים בלכידת cDNA קטוע או אם עיבוד נתונים זורק רצפים מוטנטים שאינם תואמים למערך נתוני ייחוס11,12. יתר על כן, המגוון הכימי, האורך והמבני העצום של תעתיקי רנ"א, כמו גם היעדר כלים לשבר אחיד של רנ"א ארוך, מקטין את התחולה של רוב שיטות הרנ"א-seq על כל מיני הרנ"א13.
שיטת AQRNA-seq (ריצוף RNA לכימות מוחלט) פותחה כדי להסיר כמה מהאילוצים הטכניים והביולוגיים הללו המגבילים את הדיוק הכמותי7. על ידי מזעור הטיות תלויות רצף בלכידה, קשירה והגברה במהלך הכנת ספריית ריצוף RNA, AQRNA-seq משיג ליניאריות מעולה בהשוואה לשיטות אחרות, ומכמת במדויק 75% מספריית הייחוס של 963 miRNA בדיוק של פי 2. מתאם ליניארי זה של ריצוף, ספירת קריאה ושפע RNA נצפה גם בניתוח של מאגר אורך משתנה של תקני RNA אוליגונוקלאוטידים ובהתייחסות לשיטות אורתוגונליות כמו כתם צפוני. קביעת ליניאריות בין ריצוף ספירת הקריאה לבין שפע הרנ"א מאפשרת ל-AQRNA-seq להשיג כימות מדויק ומוחלט של כל מיני הרנ"א בדגימה.
להלן תיאור של הפרוטוקול עבור זרימת עבודה להכנת ספריית AQRNA-seq וצינור ניתוח הנתונים הנלווה במורד הזרם. השיטה יושמה כדי להבהיר את הדינמיקה של שפע tRNA במהלך תרדמה הנגרמת על ידי רעב ולאחר מכן החייאה במודל Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) של שחפת. הוצגו תוצאות להדמיה גישושית של נתוני הריצוף, יחד עם אשכולות וניתוחי ביטוי דיפרנציאליים שחשפו דפוסים ניתנים להבחנה בשפע tRNA הקשורים לפנוטיפים שונים.

<table><tbody><tr><td>2-קטוגלוטראט&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75890</td><td>הכן תמיסת עבודה (1 מ ') ואחסן אותה ב -20&ordm; </td></tr><tr><td>C 2100 מכשיר ביואנלייזר</td><td>Agilent</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (רכיב #: N0437AVIAL)</td><td>NEB M0437M מכיל T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), מאגר תגובה T4 RNA Ligase (10X), PEG 8000 (1X) ו-ATP (100 מ"מ); הכינו פיתרון עבודה (10 מ"מ) ואחסנו אותו ב -20&ORDM; C</td></tr><tr><td>AGAROSE GPG/LE</td><td>AmericanBio</td><td>AB00972-00500</td><td>אחסן בטמפרטורת הסביבה</td></tr><tr><td>אמוניום ברזל (II) סולפט הקסהידראט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2262</td><td>הכן תמיסת עבודה (0.25 מ') ואחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>ביואנלייזר ניתוח RNA קטן</td><td>Agilent</td><td>5067-1548&nbsp;</td><td>ניתוח ה-RNA הקטן משמש לבדיקת איכות ה-RNA הקלט והיעילות של תגובות אנזימטיות (למשל, קשירת Linker 1)</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA; 10 מ"ג/מ"ל)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000</td><td>מוצר זה הופסק ב-15/12/2022 והוחלף באלבומין רקומביננטי, בדרגת ביולוגיה מולקולרית (NEB B9200).</td></tr><tr><td>כלורופורם&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4441-10</td><td></td></tr><tr><td>דמתילאז&nbsp;</td><td>ArrayStar</td><td>AS-FS-004</td><td>Demethylase מגיע עם טיפול מקדים rtStar tRNA & ערכת סינתזה cDNA של גדיל ראשון (AS-FS-004)</td></tr> <tr><td>תערובת תמיסות דאוקסינוקלאוטיד (dNTP)</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>N0447L (רכיב #: N0447LVIAL)</td> <td>תערובת תמיסות dNTP זו מכילה ריכוזים שווי ערך של dATP, dCTP, dGTP ו-dTTP (10 מ"מ כל אחד)</td></tr> <tr><td>בלוק חום כפול דיגיטלי</td><td>VWR Scientific Products</td><td>13259-052</td><td>בלוק חימום משמש עם QIAquick&nbsp; ערכת מיצוי ג'ל&nbsp;</td></tr><tr><td>דייקס&nbsp; 2.0 ערכת ספין&nbsp;</td><td>קיאג'ן</td><td>63204&nbsp;</td><td>יעיל בהסרת שאריות קצרות (למשל, אוליגוס באורך של פחות מ-10 bp)</td></tr><tr><td>ספק כוח אלקטרופורזה</td> צינורות <td>Bio-Rad Labrotories</td><td>PowerPac 300</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR (0.5 מ"ל)</td>צינורות נעילה בטוחה <td>של Eppendorf</td><td>0030124537</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf (0.5 מ"ל)</td>צינורות נעילה בטוחה <td>של Eppendorf</td><td>022363611</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf (1.5 מ"ל)</td>צינורות נעילת כספת של <td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf (2 מ"ל)</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי (אתנול),</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E7023 טהור&nbsp;</td><td>האתנול הטהור משמש עם ערכת Oligo Clean and Concentrator מבית Zymo Research</td></tr><tr><td>מערכת הדמיית ג'ל</td><td>Alpha Innotech</td><td>FluorChem 8900</td><td></td></tr><tr><td>צבע טעינת ג'ל, סגול (6X), ללא SDS</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (רכיב #: B7025SVIAL)</td><td>NEB N0556S מכיל סגול מהיר 50 bp DNA סולם וצבע טעינת ג'ל, סגול (6X), ללא SDS</td></tr><tr><td>GENESYS 180 UV-Vis ספקטרופוטומטר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840-309000</td><td>הספקטרופוטומטר משמש למדידת ריכוזי האוליגו באמצעות חוק הבירה</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>הכן תמיסת עבודה (1 M; pH = 8 עם NaOH) ואחסן אותה ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)&nbsp;</td><td>VWR Scientific Products</td><td>BDH3028&nbsp;</td><td>הכן תמיסת עבודה (5 מ ') ואחסן אותה בטמפרטורת הסביבה</td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול (איזופרופנול),</td><td>כימיקלים עדינים טהורים של מקרון</td><td>3032-16</td><td>איזופרופנול משמש עם QIAquick&nbsp; ערכת מיצוי ג'ל&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה L-אסקורבית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>הכן תמיסת עבודה (0.5 מ ') ואחסן אותה ב -20&ordm; C</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 (10X)</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0264L (רכיב #: B7002SVIAL)</td><td>NEB M0264L מכיל RecJf (30 U/&mu; L) ו-NEBuffer 2 (פי 10); יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>מים נטולי נוקלאז (לא מטופלים על ידי DEPC)</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>AM9938&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אוליגו קלין & ערכת ריכוז&nbsp;</td><td>זימו מחקר</td><td>D4061&nbsp;</td><td>יש לאחסן בטמפרטורת הסביבה</td></tr><tr><td>PEG 8000 (תמיסה של 50%)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (רכיב #: B1004SVIAL)</td><td>NEB M0437M מכיל T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), מאגר תגובה T4 RNA Ligase (10X), PEG 8000 (1X) ו-ATP (100 מ"מ); הכינו פיתרון עבודה (10 מ"מ) ואחסנו אותו ב -20&ORDM; C</td></tr><tr><td>Peltier תרמי Cycler</td><td>MJ מחקר</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>פנול: כולורופורם: איזואמיל&nbsp; אלכוהול 25:24:1 pH = 5.2&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>J62336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מאגר PrimeScript (5X)</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript Reverse Transcriptase</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick&nbsp; ערכת מיצוי ג'ל&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>ערכה זו דורשת בלוק חימום ואיזופרופנול כדי לעבוד עם</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0551S (רכיב #: N0551SVIAL)</td><td></td></tr> <tr><td>Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (רכיב #: N0556SVIAL)</td><td>NEB N0556S מכיל סגול מהיר 50 bp סולם DNA וצבע טעינת ג'ל, סגול (6X), ללא SDS</td></tr><tr><td>RecJf&nbsp; (30 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (רכיב #: M0264LVIAL)</td><td>NEB M0264L מכיל RecJf (30 U/&mu; L) ו-NEBuffer 2 (פי 10); יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; </td></tr><tr><td>מעכב C RNase (מורין; 40 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0314L&nbsp;( רכיב #: M0314LVIAL)</td> <td>יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>רצףAMP&nbsp; DNA פולימראז&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 מכיל SeqAMP&nbsp; DNA פולימראז&nbsp; ו-SeqAMP&nbsp; מאגר PCR (2X)</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; מאגר PCR (פי 2)&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 מכיל SeqAMP&nbsp; DNA פולימראז&nbsp; ו-SeqAMP&nbsp; מאגר PCR (2X)</td></tr><tr><td>שרימפס אלקליין פוספטאז (1 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0371L&nbsp;( רכיב #: M0371LVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; S5881</td><td>הכן תמיסת עבודה (5 מ') ואחסן אותה בטמפרטורת הסביבה</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (400 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0202L&nbsp;( רכיב #: M0202LVIAL)</td><td>NEB M0202L מכיל T4 DNA Ligase (400 U/&mu; L) ו-T4 DNA Ligase Response Buffer (10X)</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Response Buffer (10X)&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0202L&nbsp;( רכיב #: B0202SVIAL)</td><td>NEB M0202L מכיל T4 DNA Ligase (400 U/&mu; L) ו-T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (רכיב #: M0437MVIAL)</td><td>NEB M0437M מכיל T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), מאגר תגובה T4 RNA Ligase (10X), PEG 8000 (1X) ו-ATP (100 מ"מ)</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase Response Buffer (10X)&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0437M (רכיב #: B0216SVIAL)</td><td>NEB M0437M מכיל T4 RNA Ligase 1 (30 U/&mu; L), מאגר תגובה T4 RNA Ligase (10X), PEG 8000 (1X) ו-ATP (100 מ"מ)</td></tr></tbody></table>

aqrna-seq לכימות רנ"א קטן

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq מספק קשר ליניארי ישיר בין ריצוף ספירות קריאה לבין מספרי העתקי RNA קטנים בדגימה ביולוגית, ובכך מאפשר כימות מדויק של מאגר הרנ"א הקטן. הליך הכנת ספריית AQRNA-seq המתואר כאן כולל שימוש במקשרי ריצוף שתוכננו בהתאמה אישית וצעד להפחתת שינויי RNA מתילציה החוסמים את תהליך השעתוק ההפוך, מה שמביא לתפוקה מוגברת של cDNA באורך מלא. בנוסף, מוצג יישום מפורט של צנרת הביואינפורמטיקה הנלווית. הדגמה זו של AQRNA-seq נערכה באמצעות ניתוח כמותי של 45 tRNAs ב- Mycobacterium bovis BCG שנקטפו ב -5 ימים נבחרים במהלך זמן של 20 יום של מחסור בחומרים מזינים ו -6 ימי החייאה. מאמצים מתמשכים לשיפור היעילות והקפדנות של AQRNA-seq יידונו גם כאן. זה כולל בחינת שיטות למייתר טיהור ג'ל להקלה על בעיות דימר פריימר לאחר הגברת PCR ולהגדיל את שיעור הקריאות באורך מלא כדי לאפשר מיפוי קריאה מדויק יותר. שיפורים עתידיים ב-AQRNA-seq יתמקדו בהקלה על אוטומציה ויישום בתפוקה גבוהה של טכנולוגיה זו לכימות כל מיני הרנ"א הקטנים בדגימות תאים ורקמות מאורגניזמים מגוונים.

מיקובקטריום בוביס זן BCG (bacilli de Calmette et Guérin) 1173P2 שעבר גדילה אקספוננציאלית היה נתון לסדרת זמן (0, 4, 10 ו-20 יום) של רעב תזונתי, ואחריו החייאה של 6 ימים בתווך עשיר בחומרים מזינים כפי שהוצג קודם לכן בהו ואחרים.7. רנ"א קטן בודד מתרבית חיידקים, עם שלושה העתקים ביולוגיים, בכל אחת מחמש נקודות הזמן שנקבעו. ספריות Illumina נבנו באמצעות תהליך העבודה של הכנת ספריית AQRNA-seq שתואר לעיל (איור 1), ולאחר מכן ריצוף על רצף במרכז BioMicro של המכון הטכנולוגי של...

ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

ריצוף AQRNA ממפה כמותית רנ"א קטן כגון מיקרו-רנ"א, tRNA ומקטעי tRNA כמעט בכל דגימת תא או רקמה. ניתן להשתמש בו כדי למפות חלק מ-170 השינויים הידועים ב-tRNA, אך ישנן שיטות אחרות שהן ספציפיות יותר למיפוי. אתה יכול להשתמש ב- AQRNA-seq כדי לגלות סמנים ביולוגיים של מחלות ב- RNome ולחקור מנגנוני תרגום חלבונים ברמת המערכות.רוב שיטות ה-RNA-seq אינן מסוגלות לכמת במדויק את השפע של מולקולות RNA בודדות בדגימה. זה נגרם הן על ידי תכונות מבניות של RNA, כגון מבנים משניים, שינויים לאחר שעתוק, כמו גם ביוכימיה של הכנת הספרייה כגון הטיות קשירה של פי אלף המושרה על ידי נוקלאוטידים מסוף על RNAs. AQRNA-seq פותח כדי להתגבר על מספר אתגרים טכניים וביולוגיים, המגבילים את הכימות המדויק של שפע הרנ"א בדגימה.בהשוואה לעניינים אחרים, הוא משיג ליניאריות בין ספירות חוזרות ומספרי העתקה של מולקולות RNA, באופן מדויק, הוא מכמת 75% מספריית הייחוס, ודוחס 963 מיקרו-רנ"א בדיוק כפול. AQRNA-seq ייחודי בכך שהוא מספק כימות מוחלט של רנ"א קטן. זה מקשר את ספירת הריצוף ישירות למספר העותקים של מולקולת RNA בדגימה.רמת דיוק זו חיונית להשוואה בין עשרות למאות tRNA בדגימה, והיא שונה מרנ"א קטן רגיל, המאפשר רק כימות יחסי בין תנאים ודגימות. עיצבנו את AQRNA-seq לצורך שלא נענה בהבנת תרגום חלבונים. מצאנו שתאים תכנתו מחדש עשרות שינויים ב-tRNA במספר

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

MicroRNAs (miRNAs) הם סוג של מולקולות רגולטוריות שנשמרו באופן נרחב. כאן אנו מתארים שיטת שיבוט miRNA המסתמכת על שני שלבי קשירה חזקים ואחריהם ריצוף תפוקה גבוהה. השיטה שלנו מאפשרת כימות מדויק בכל הגנום של miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

מסופק פרוטוקול לכימות גנים ותעתיקים של חיידקים 16S rRNA ממשקעי חוף באמצעות PCR בזמן אמת. המתודולוגיה כוללת מיצוי משותף של DNA ו-RNA; הכנת RNA נטול DNA; וכימות גן rRNA 16S וכימות תעתיק באמצעות RT-q-PCR, כולל בניית עקומה סטנדרטית.

הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

אנו מתארים שיטה מבוססת ריצוף RNA ממוקדת הכוללת הכנת ספריות cDNA באינדקס, הכלאה ולכידה עם בדיקות מותאמות אישית וניתוח נתונים כדי לחקור תעתיקים נבחרים לביטוי גנים, מוטציות ואיחוי גנים. RNAseq ממוקד מאפשר הערכה חסכונית ומהירה של תמלילים נבחרים ברצף שולחני.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

פרוטוקול זה מתאר שיטת ה-pre-mRNA מיפוי 3' עיבוד אתרי קצה.

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה צעד אחר צעד עבור בידוד RNAs קטנים, העשרת עבור microRNAs, והכנת דגימות עבור רצף תפוקה גבוהה. לאחר מכן נתאר כיצד לעבד רצף וליישר אותם ל-microRNAs, באמצעות כלי קוד פתוח.

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

RNAs מעגלית (circRNAs) הם RNAs שאינם מצפינה לקידוד שעשויים להיות בעלי תפקידים ברגולציה ובניהול אינטראקציות מדיה בין חלבונים. בעקבות הערכה של פרמטרים שונים לבניית ספריות רצף circRNA, פרוטוקול הושלם באמצעות הכנה נטוש הכולל הספריה RNA עם RNase R טרום טיפול והוא מוצג כאן.

זיהוי של RNAs מעגלית באמצעות רצפי RNA

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

מוצג כאן פרוטוקול עבור microdissection לכידת לייזר (LCM) של רקמות צמח. LCM היא טכניקה מיקרוסקופית לבידוד אזורים של רקמות באופן ללא זיהום. ההליך כולל קיבעון רקמות, הטמת פרפין, מקטע, LCM וחילוץ RNA. RNA משמש במורד הזרם ספציפי רקמה, ניתוח נפתר זמנית של transcriptomes.

לכידת לייזר מיקרודיסציה RNA-רצף לניתוח ביטוי גנים ספציפי רקמה מרחבית וזמנית בצמחים

עבודה זו מציגה שיטה במהירות ובמדויק לכמת את הפיגמנטציה הבטן של תסיסנית melanogaster באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלית. שיטה זו מייעלת את ההליכים בין רכישת פנוטיפ וניתוח נתונים וכולל הדגימה הרכבה, רכישת תמונה, מיצוי ערך פיקסל, ומדידה תכונה.

כימות פיגמנטציה בטן ב<em&gt; תסיסנית מלנוגאסטר</em

חקור שיטת AQRNA-seq לכימות מוחלט של רנ"א קטן כמו microRNAs ו-tRNAs בדגימות ביולוגיות. למד כיצד לזהות שינויים בבריכת ה-tRNA ב-Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמת הנגרמת מרעב.

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

גלה סרטונים נוספים