Name: בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 44 s
Description: למדו לבודד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית לחקר מנגנוני ויסות מחזור התא באיקריוטים. שיטה זו מאפשרת הבנת אינטראקציות חלבונים קריטיות לשכפול DNA וליציבות תורשתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

י. טנאקה ביצע את השיפור הטכני של Y2H. עבודה זו נתמכת על ידי JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 והמכון לתסיסה, אוסקה.

1. בניית הספרייה המוטנטית
<ol><li>הגדר את תגובת שרשרת פולימראז (PCR) (דוגמה מוצגת להלן). בדרך כלל, להכין 50 μL של התגובה, אשר מחולק עשרה aliquots של 5 μL, ולהגביר את מקטע גן המטרה במכונת PCR4. הערה: על המשתמשים לבחור פולימראז מתאים כדי להציג מוטציות ביעילות. אם מקטע הדנ"א שיש להגביר הוא קצר, אז יש צורך בפולימראז עם שיעור שגיאות גבוה יותר, כגון Taq פולימראז, אשר חסר פעילות הגהה. אם מקטע הדנ"א שיש להגביר הוא ארוך, יש צורך בפולימראז בנאמנות גבוהה יותר כדי להפחית את מספר המוטציות. מוטציות מתרחשות כל כמה מאות זוגות בסיסים לאחר 30 מחזורי הגברה עם Taq פולימראז4 רגיל. בתוצאות המייצגות נעשה שימוש בפולימראז Taq שונה (ראו טבלת חומרים), בעל נאמנות גבוהה יותר מאשר Taq פולימראז רגיל, ושיעור המוטציות היה אחד ל-600 זוגות בסיסים. דוגמה לתערובות PCR, פרטי הפריימר ותנאי התגובה מובאים בקובץ משלים 1.</li>
	<li>כאשר ה- PCR הושלם, שלב את כל aliquots של התגובה, לאשר כי קטעי DNA של עניין הוגברו באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose, וכו ', ולטהר את ה- DNA5.</li>
	<li>הרכיבו את מקטע הדנ"א שנוצר בשלב 1.2 עם וקטור Y2H המתאים באמצעות אסטרטגיית שיבוט "חלקה" (איור 1). הערה: מערכת השיבוט החלקה, כגון הרכבה6 של גיבסון, ממזערת את זיהום הספרייה המוטנטית הבנויה על ידי וקטורים ריקים הנוצרים באמצעות קשירה עצמית. רשימה של וקטורי Y2H מופיעה בטבלה 1. הם יכולים להיות מוכנים על ידי עיכול BamHI לפני ההרכבה. כל הפלסמידים זמינים מפרויקט המשאבים הביולוגיים הלאומי - שמרים (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הכניסו את תערובת התגובה שנוצרה בשלב 1.3 לתאים מוכשרים של Escherichia coli שהוכנו על פי פרוטוקול טרנספורמציה יעיל ביותר של E. coli (למשל, Inoue et al.7). יש לפזר את כל התאים המתאימים על מספר צלחות LB (1% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 1% NaCl ו-2% אגר) המכילות אנטיביוטיקה מתאימה (ראו טבלת חומרים). בשלב זה, פזרו כמות קטנה (~1/100 מכלל התגובה) על אותה לוחית בחירה כדי לחשב את הטייטר של הספרייה. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך הלילה.</li>
	<li>לאחר שהופיעו מספר רב של מושבות E. coli , גרדו את כל התאים מפני השטח של הצלחת באמצעות לולאת פלסטיק חד פעמית. לשחזר DNA פלסמיד מתאים אלה באמצעות שיטות פופולריות, כגון ליזה אלקליין8. במקביל, לספור את מספר המושבות המופיעות לאחר פיזור aliquots קטן של תערובת טרנספורמציה על הצלחת. באמצעות מספר זה, הערך את המספר הכולל של שיבוטים עצמאיים בספריה. הערה: בשלב זה, אספו כמה מושבות עצמאיות (4-6) המופיעות על הצלחת שעליה התפשטו האליציטוטים הקטנים של תגובת הטרנספורמציה, תרבו אותם בנפרד, ובודדו מהם פלסמידים כדי לוודא שכמעט כל השיבוטים נושאים את מקטעי הדנ"א הרצויים5. ערכות מסחריות רבות זמינות לבידוד פלסמידים מ - E. coli. מספר המושבות המופיעות על הצלחת לאחר פיזור אליציטוטים קטנים ניתן לספור באופן ידני.</li>
	<li>למדוד את ריכוז מאגר הדנ"א של הספרייה. בדרך כלל, כמה מאות ננוגרם של דנ"א ספרייה מספיקים כדי להשיג כמה אלפי טרנספורמנטים בשלב הבא. הערה: מומלץ למדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות צבע פלואורסצנטי הנקשר לדנ"א מכיוון שמדידה של A260 לעתים קרובות אינה מדויקת.</li>
</ol>2. טרנספורמציה של שמרים עם הספרייה המוטנטית וציפוי העתק
<ol><li>הכניסו את הספרייה המוטנטית לזן השמרים המארח (TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ) עבור בדיקת Y2H באמצעות כ-100 ננוגרם של DNA. התמירו מראש את התאים המארחים עם פלסמיד 'פיתיון'.<ol><li>לאחר הליך הטרנספורמציה, מרחפים תאי שמרים במים סטריליים ומפזרים אליציטוטים בכמויות שונות על לוחות מתאימים (בדרך כלל SC בינוני חסר לאוצין וטריפטופן: SC-LW [0.67% בסיס חנקן שמרים, 2% גלוקוז, 1.546 גרם / ליטר SC תערובת נשירה כפולה -Leu -Trp, ו 2% אגר, ראה טבלת חומרים]). לדגור על צלחות אלה לילה ב 30 °C (75 °F). הערה: הפרוטוקול הסטנדרטי, כגון שיטת ליתיום אצטט-PEG11 עם ~ 5 × 106 תאים הגדלים לוגריתמית, מספיק להתמרה של שמרים. שיטה נוספת עם יעילות טרנספורמציה גבוהה, כגון electroporation, ניתן להשתמש גם.</li>
	</ol></li>
	<li>למחרת, כאשר מושבות זעירות מופיעות, לבחור את הלוחות עם מספר מתאים של תאים (500-2000) ולעשות עותקים משוכפלים מהם כדלקמן.</li>
	<li>הגדר שני גיליונות של נייר סינון על בלוק משוכפל כדי ליצור מספר עותקים משוכפלים (המדיום הוא SC-LW ו- SC-LW המכיל kanamycin) (ראה טבלת חומרים). לדגור ב 30 ° C במשך 1-2 ימים. הערה: ריכוז הקנמיצין (G418) הוא 600 מיקרוגרם/מ"ל. אין להשתמש בקטיפה לציפוי העתק מכיוון שהרזולוציה של מושבות תאבד.</li>
	<li>לאחר שהמושבות גדלו, השוו צלחות ובחרו מועמדים. בצע בדיקת צבע Y2H (ראה שלב 3) אם lacZ משמש ככתב. הערה: עבור כתב Y2H, lacZ בדרך כלל טוב יותר בזיהוי אינטראקציה חלשה מאשר HIS3.</li>
</ol>3. בדיקת צבע Y2H
<ol><li>הניחו גיליון נייר סינון חתוך מראש לגודל המתאים על לוח העתק שהוכן בשלב 2. היזהרו שלא לאפשר להיווצרות בועות אוויר בין נייר הסינון לצלחת. הערה: השתמש בנייר סינון מס' 4A או בנייר סינון דרגה 50 (ראה טבלת חומרים). כל SC-LW או SC-LW המכילים לוחות קנמיצין, המיוצרים על ידי ציפוי העתק, יכולים לשמש לבדיקת הצבע.</li>
	<li>כאשר נייר הסינון על הצלחת רטוב לחלוטין (כאשר צבע נייר הסינון משתנה לחלוטין), הניחו מספר גיליונות של מגבת נייר מעל וגרמו לו לבוא במגע עם נייר המסנן כדי להסיר לחות עודפת. הסירו את מגבת הנייר כשהיא סופגת את המים ומשנה את צבעה. חזור על תהליך זה פעמיים או שלוש.</li>
	<li>הרימו את שולי נייר הסינון בפינצטה, קלפו אותו מהצלחת במהירות, טבלו אותו בחנקן נוזלי והקפיאו אותו. אם חנקן נוזלי אינו זמין, הניחו את נייר הסינון על מגש פלסטיק כשדופן המושבה כלפי מעלה והכניסו אותו מיד למקפיא (-20°C עד -80°C) להקפאה מלאה.</li>
	<li>מוציאים את נייר הסינון הקפוא ומניחים אותו, כשדופן המושבה כלפי מעלה, על מגבת נייר יבשה להפשרה. מיד לאחר ההפשרה, הניחו את נייר הפילטר, כשדופן המושבה כלפי מעלה, על נייר סינון אחר שהונח על מגש פלסטיק או מיכל אטום והושרה בחיץ Z (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl ו-1 mM MgSO4, pH 7.0) המכיל X-gal (5-bromo-5-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) ו-2-מרקפטואתנול9 (ראה טבלת חומרים). היזהרו שלא לאפשר לבועות אוויר להיווצר בין ניירות הסינון העליונים והתחתונים.</li>
	<li>כסו את מגש הפלסטיק המכיל את נייר הסינון והכניסו אותו למיכל אטום או לשקית ניילון. סגור את המיכל האטום או שקית הניילון ודגור אותו ב 37 ° C עד צבע כחול מופיע.</li>
	<li>כאשר מופיע צבע כחול, הניחו את נייר הסינון עם דופן המושבה כלפי מעלה על כ-500 מיקרוליטר של תמיסת עצירה (1 M Na2CO3) על מגש פלסטיק נקי. עצור פתרון נספג במהירות; לכן, הסירו מיד את הפילטר, הניחו אותו על מגבת נייר טרייה כשדופן המושבה כלפי מעלה, והניחו לה להתייבש.</li>
	<li>לאחר החלפת מגבת הנייר והמסנן יבש מספיק, השתמש בסורק או במכשיר אחר כדי ללכוד את הנתונים.</li>
</ol>4. שחזור ואישור שיבוטים של מועמדים
<ol><li>בחר שיבוטים לבנים ומועמדים של KanR מהלוח המקורי של העותק המשוכפל (או מהלוח המשוכפל שאינו משמש לבדיקת הצבע). דוגמאות לכך מוצגות באיור 1C. אשרו כי השיבוטים המועמדים הם לבנים ו- KanR על ידי פסים מחדש שלהם כטלאי קטן על מדיום SC-LW המכיל קנמיצין ודגירה עליהם ב 30 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים. הכינו לפחות שני סטים או הכינו עותקים משוכפלים למחרת. הערה: יש לבחור מושבות לבנות מכיוון שמושבות כחולות בהירות עשויות לשמור על האינטראקציה.</li>
	<li>לאחר שהשיבוטים המועמדים גדלו מחדש היטב, חזרו על בדיקת הצבע עם לפחות לוח אחד שנוצר בשלב 4.1 כמתואר בשלב 3 ואשרו שהם נשארים לבנים ואינם הופכים לכחולים (איור 2A). הערה: בעת פסים מחדש של המועמדים, אין לשאת כמויות גדולות של תאים. תאים רבים מדי אינם מאפשרים להבחין בין שיבוטים של KanR ו- KanS .</li>
	<li>קח שיבוטים שהם עדיין לבנים ו- KanR שנוצר בשלב 4.2 משאריות הצלחת וגדל אותם באופן עצמאי ב 1 מ"ל של מדיום בחירה (SC-L או SC-W, תלוי איזה וקטור משמש לבניית הספרייה) לילה ב 30 ° C.</li>
	<li>מעבירים את התרבית למיקרו-צינורית ואוספים תאים באמצעות צנטריפוגה (~15,000 × גרם, למשך 10-30 שניות בטמפרטורת החדר). בודד DNA שלם מכדורית התא באופן הבא.</li>
	<li>יש להשהות את כדורית התא ב-400 מיקרוליטר של חיץ ליזה (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl (8.0) ו-1 mM EDTA) המכילים 1 μL כל אחד של 2-מרקפטואתנול ו-20 מ"ג/מ"ל Zymolyase 100T (ראו טבלת חומרים), ולדגור ב-37°C למשך 30 דקות כדי לעכל את דפנות התא. בשלב זה, מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור כל 5-10 דקות.</li>
	<li>כאשר מתלה התא נעשה אטום או שקוף, הוסף נפח שווה של תערובת של אלכוהול פנול-כלורופורם-איזואמיל (25:24:1) וערבב היטב על ידי ערבול במהירות בינונית במשך 10-20 שניות.</li>
	<li>צנטריפוגות את המיקרו-צינוריות במיקרו-צנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות מלאה (~15,000 × גרם, בטמפרטורת החדר) ומשחזרים את הפאזה המימית המכילה DNA במיקרו-צינורית חדשה. מוסיפים נפח 0.8 של איזופרופנול ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינור.</li>
	<li>השאירו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה במיקרו-צנטריפוגה למשך 4-5 דקות במהירות מלאה (~15,000 × גרם, בטמפרטורת החדר) כדי לזרז את הדנ"א.</li>
	<li>הסר את supernatant ולשטוף את המשקע עם כ 500 μL של 70% אתנול. מוציאים אתנול לחלוטין ומייבשים את המשקע לזמן קצר.</li>
	<li>הוסף 20 μL של חיץ TE (10 mM Tris-Cl (8.0) ו- 1 mM EDTA) למשקע, ערבב לזמן קצר והשאר את הצינור למשך הלילה בטמפרטורת החדר כדי להמיס את המשקע. הערה: אם משתמשים ממהרים, שמור על צינורות ב 37-50 ° C. משקע הדנ"א יתמוסס תוך מספר שעות.</li>
	<li>לאחר שהגלולה מומסת לחלוטין, הפוך E. coli עם כמות קטנה של תמיסת DNA זו. הערה: כ 0.5 μL של תמיסת DNA מספיק אם E. coli עם יעילות טרנספורמציה גבוהה משמש.</li>
	<li>כאשר מושבות E. coli מופיעות, לבחור כמה מושבות עצמאיות, לתרבית אותם, ולשחזר פלסמידים בשיטות סטנדרטיות, כגון ליזה אלקליין.</li>
	<li>הכניסו את הדנ"א של פלסמיד שהתקבל בשלב 4.12 לתאי מארח Y2H המכילים את פלסמיד הפיתיון. כאשר טרנספורמנטים מופיעים, לבדוק אותם על ידי בדיקת צבע (הם צריכים להופיע לבן) ו כתם מערבי4 (הם צריכים לבטא חלבון בגודל הרצוי). הערה: השיטה הפוסט-אלקליין12 היא דרך קלה ומהירה להכין תמצית של תאים שלמים משמרים.</li>
	<li>אם שני הקריטריונים הנ"ל מתקיימים, לקבוע את אתר המוטציה של השיבוטים על ידי ריצוף נוקלאוטידים4.</li>
</ol>

מחקרי אינטראקציה ביומולקולרית באמצעות טכניקת שמרים דו-היברידית 

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Leanna, C. A., Hannink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reverse+two-hybrid+system%3A+A+genetic+scheme+for+selection+against+specific+protein%2Fprotein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).</li>
<li>Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+two-hybrid+and+one-hybrid+systems+to+detect+dissociation+of+protein-protein+and+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).</li>
<li>Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+for+the+isolation+of+interaction-null%2Fimpaired+mutants+using+the+yeast+two-hybrid+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient method for the isolation of interaction-null/impaired mutants using the yeast two-hybrid technique.</a> Genes Cells. 24 (12), 781-788 (2019).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual.+4th+edn%22">Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edn</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Birnboim, H. C., Doly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+alkaline+extraction+procedure+for+screening+recombinant+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).</li>
<li>Bartel, P. L., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein-protein+interactions+using+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system.</a> Meth Enzymol. 254, 241-263 (1995).</li>
<li>Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate%2Fsingle-stranded+carrier+DNA%2Fpolyethylene+glycol+method%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li>
<li>Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+protein+extraction+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable protein extraction from yeast.</a> Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).</li>
<li>Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+associates+with+the+loaded+DNA+helicase+at+replication+origins+and+defines+a+novel+step+in+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation.</a> EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).</li>
<li>Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm10+plays+a+role+in+functioning+of+the+eukaryotic+replicative+DNA+helicase%2C+cdc45-mcm-gins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins.</a> Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).</li>
<li>Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-initiation+complex+assembly+functions+as+a+molecular+switch+that+splits+the+mcm2-7+double+hexamer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer.</a> EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

מאמר זה מתאר כיצד לבודד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות מבחן Y2H. מוטנטים כאלה הם כלים רבי עוצמה לנתח את הפונקציה של חלבון מעניין. כדי לבודד מוטנטים כאלה, בדיקות rY2H פותחו בעבר על ידי שינוי זן המאכסן Y2H 2,3. עם זאת, הם לא הפחיתו מאוד את כמות העבודה. לעומת זאת, ניתן לבודד מוטנטים בשיטה זו ללא כמות משמעותית של עבודה. בשיטה זו, שינוי של וקטורי Y2H מבטיח שכל המועמדים הם מוטנטים מסוג פראי או מוטציה מוטעית, בתיאוריה. בנוסף, שיטה זו יכולה לחסל ביעילות וקטורים ריקים מהמוע...

אינטראקציות בין ביומולקולות הן החלק הבסיסי ביותר של תופעות ביולוגיות. אינטראקציות חלבון-חלבון מהוות חלק משמעותי מאינטראקציות כאלה. לכן, זיהוי של שותפי האינטראקציה של חלבון מעניין הוא קריטי כדי להבהיר עוד יותר את הפונקציה של החלבון/גן המעניין. שיטת השמרים הדו-היברידיים (Y2H) היא טכניקה פופולרית לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון in vivo1. במערכת זו, שני חלבונים (X ו-Y) שהאינטראקציה ביניהם אמורה להיבדק מאוחים לתחום קשירת הדנ"א (DB) ולתחום הפעלת השעתוק (AD), בהתאמה. חלבון ההיתוך DB-X נקשר לרצף זיהוי של תחום DB; לכן, כאשר חלבונים X ו-Y מתקשרים, חלבון ההיתוך AD-Y מגיע לקרבת רצף הזיהוי. כתוצאה מכך, מופעל שעתוק של גן המדווח במורד הזרם של רצף הזיהוי. לכן, נוכחות או היעדר פעילות גן מדווח יכול לשמש כדי לקבוע את נוכחותה או היעדרה של אינטראקציה חלבון-חלבון1.
לאחר זיהוי שותף אינטראקציה ספציפי של החלבון המעניין, יש לבצע ניתוחים נוספים כדי להבהיר את הפונקציה הביולוגית של האינטראקציה. לשם כך, אם ניתן יהיה לבודד מוטנטים של החלבונים הפוגעים או מסירים את האינטראקציה הספציפית חלבון-חלבון, הם ישמשו ככלים רבי עוצמה. ניתן להשתמש במערכת Y2H ישירות כדי לבודד מוטנטים כאלה על ידי סינון שיבוטים 'שליליים לאינטראקציה', החל משיבוט 'אינטראקציה-חיובית' מסוג פראי. כדי להאיץ תהליך זה, פותחו מערכות Y2H 'הפוכות' (rY2H) 2,3. במערכות rY2H, זני השמרים המארחים מכילים גנים של סמנים הניתנים לבחירה נגדית כגנים מדווחים, כלומר תאי שמרים גדלים רק כאשר חלבוני AD-Y ו-DB-X אינם מתקשרים זה עם זה.
למרות שגם מערכת Y2H וגם מערכת rY2H מאפשרות בידוד של מוטנטים שליליים לאינטראקציה, תהליך בידוד המוטנטים הוא מייגע מכיוון שלא כל המועמדים המתקבלים על ידי סינון נושאים את סוג המוטציות הרצוי (בדרך כלל מוטציות שגויות). הבעיה החמורה ביותר היא שלחלק ניכר מהמועמדים יש מוטציות של שינוי מסגרת או שטויות, ויש צורך לבצע כתם מערבי כדי לא לכלול שיבוטים לא רצויים. כדי להתגבר על בעיה זו, פותחו וקטורי פלסמיד חדשים4. בווקטורים אלה, KanMX, סמן עמידות לתרופות, ממוקם מחוץ לפריים במורד הזרם של תחום DB או AD. גן הסמן הופך למסגרת עם תחום DB או AD רק כאשר הגן המעניין מוכנס. כאשר מוטציה אקראית מוחדרת לגן המעניין, מוטציות בלתי רצויות, כגון אלה עם מוטציות frameshift או שטויות, ניתן לחסל בקלות על ידי ביצוע סלקציה עמידות לתרופות, ומועמדים הנושאים מוטציות רצויות missense ניתן לזהות בקלות עם מסך Y2H4. מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד מוטציות אינטראקציה-null/לקוי של חלבון מעניין באמצעות אסטרטגיה זו.

<table><tbody><tr><td>0.5 מ' EDTA (8.0)</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>14347-21</td><td></td></tr><tr><td>10% תמיסת SDS</td><td>פוג'יפילם Wako Pure Chemical Corp.</td><td>313-90275</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>פוג'יפילם Wako Pure Chemical Corp.</td><td>135-07522</td><td></td></tr><tr><td>2-פרופנול</td><td>קישידה כימיקלים בע"מ</td><td>110-64785</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td> <td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>021-07852</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGR60</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin נתרן</td><td>פוג'יפילם Wako Pure Chemical Corp.</td><td>68-52-3</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-HA-tag mAb-HRP-DirecT&nbsp; &nbsp;</td><td>רפואי & מעבדות ביולוגיות בע"מ</td><td>M180-7</td><td></td></tr><tr><td>DNA מאשכי סלמון</td><td>Merck KGaA.</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Merck KGaA.</td><td>9-0770-4-4L-J</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון להרמת מושבה (כיתה 50)</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>1450-090</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון להרמת מושבה (No.4A)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון 01411090 לציפוי שכפול (מס' 1)</td><td>Advantec Toyo Kaisha, Ltd.</td><td></td><td></td>00011150</tr><tr><td>G-418 סולפט</td><td>פוג'יפילם Wako Pure Chemical Corp.</td><td>075-05962</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>קישידה כימיקלים בע"מ</td><td>230-37585</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום אצטט דיהידראט</td><td>נקלאי טסק בע"מ</td><td>20604-22</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>131-00405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&bull; 12H2O</td><td>נקלאי טסק בע"מ</td><td>10039-32-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>31319-45</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull; 2H2O</td><td>נקלאי טסק בע"מ</td><td>31717-25</td><td></td></tr><tr><td>מגבת נייר</td><td>AS ONE Corp.</td><td>7-6200-02</td><td></td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: איזואמיל אלכוהול 25: 24: 1</td><td>נקלאי טסק בע"מ</td><td>25970-56</td><td></td></tr><tr><td>DNA פלסמיד</td><td>פרויקט המשאבים הביולוגיים הלאומי - ערכת בידוד שמרים (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>פלסמיד</td><td>Nippon Genetics Co. Ltd.</td><td>FG-90502</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול #4,000</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>11574-15</td><td></td></tr><tr><td>SC תערובת נשירה כפולה -Leu -Trp</td><td>Formedium</td><td>DSCK172</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שיבוט חלקה (הרכבה בהיתוך)</td> <td>Takara Bio Inc.</td><td>#639648</td><td></td></tr><tr><td>אבקת חלב רזה</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td><td>190-12865</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין סולפט</td><td>פוג'יפילם Wako Pure Chemical Corp.</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>Taq פולימראז (GoTaq Green Master Mixes)</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (הידרוקסימתיל) אמינומתאן</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>12967-45</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>ThermoFisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>211705</tr><tr><td>Tween 20</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>ThermoFisher Scientific Inc.</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>בסיס חנקן שמרים (YNB)</td><td>Formedium</td><td>CYN0210</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Nacalai Tesque Inc.</td><td>07665-55</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

אינטראקציות חלבון-חלבון הן אחד התהליכים הבסיסיים ביותר העומדים בבסיס תופעות ביולוגיות. אחת הדרכים הפשוטות והטובות ביותר להבין את התפקיד(ים) והתפקוד(ים) של אינטראקציה חלבון-חלבון ספציפית היא להשוות את הפנוטיפ של סוג הבר (עם האינטראקציה הרלוונטית בין חלבון לחלבון) לבין אלה של מוטנטים חסרי האינטראקציה הרלוונטית. לכן, אם מוטנטים כאלה יכולים להיות מבודדים, הם יסייעו להבהיר את התהליכים הביולוגיים הקשורים. הליך השמרים הדו-היברידי (Y2H) הוא גישה רבת עוצמה לא רק לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון, אלא גם לבידוד מוטציות ריקות/לקויות אינטראקציה. במאמר זה, מוצג פרוטוקול לבידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות טכנולוגיית Y2H. ראשית, ספריית מוטציות נבנית על ידי שילוב של תגובת שרשרת פולימראז וטכנולוגיית שיבוט חלקה יעילה, אשר מוציאה ביעילות את הווקטור הריק מהספרייה. שנית, מוטנטים אינטראקציה-אפס/לקויים נבדקים על ידי מבחן Y2H. בגלל טריק בווקטור Y2H, מוטציות לא רצויות, כמו אלה עם מוטציות frameshift ושטויות, מסולקות ביעילות מתהליך הסינון. אסטרטגיה זו היא פשוטה ולכן ניתן ליישם אותה על כל שילוב של חלבונים שהאינטראקציה ביניהם יכולה להיות מזוהה על ידי המערכת הדו-היברידית.

לאחרונה, נמצא כי מחצית C-terminal של חלבון Pol2 (Pol2-C) אינטראקציה עם Mcm10. שני החלבונים חיוניים להתחלת שכפול DNA, ומכאן לצמיחת תאים בשמרים הניצנים Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. כדי לעזור להבין את המשמעות הביולוגית של אינטראקציה זו, מוטנטים Pol2-C שיש להם אינטראקציה ללא / מופחתת עם Mcm10 בודדו באמצעות השיטה המתוארת כאן.
ספריית מוטציות נבנתה על פי השיטה המתוארת בשלב 1. מקטעי DNA Pol2-C ...

האינטראקציות של ביומולקולות, כגון אינטראקציות חלבון-חלבון, הן הבסיס המולקולרי של פונקציות ביולוגיות. אם ניתן לבודד מוטנטים ריקים/לקויים שחסרים באופן ספציפי את האינטראקציה הרלוונטית, הם יעזרו מאוד להבין את הפונקציות של אינטראקציה זו. מאמר זה מציג דרך יעילה לבודד מוטציות ריקות/לקויות אינטראקציה.

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

אנו מתעניינים בהבנת מנגנוני הבקרה של מחזור התא באיקריוטים, במיוחד הקשר בין שכפול דנ"א, תחזוקת חיידקים יציבים והתפשטות תאים. התקדמות מחזור התא מווסתת על ידי קינאזות תלויות ציקלין, או CDKs, באיקריוטים. זה המקרה להתחלת שכפול DNA.זיהינו דרך, על מצעים של CDKs, ליזום שכפול DNA. כדי להבין את הפונקציה של החלבון שמעניין אותך, השוואה בין סוג הבר למוטנט היא דרך ישירה ויעילה. שמרים שני היברידיים, להיות זיהוי פשוט ישפר את תהליך בידוד מוטנטים ריקים אינטראקציה.הדבר יתרום לקידום המחקר בתחום.

isolating-interaction-nullimpaired-mutants-using-yeast-two-hybrid

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מיתוס מאפשר זיהוי רגיש של אינטראקציות חולף ויציב בין חלבונים לידי ביטוי cerevisiae אורגניזם מודל Saccharomyces. זה כבר מיושם בהצלחה מחקר אקסוגניים ושמרים חלבונים בממברנה נפרד על מנת לזהות שותפים באינטראקציה שלהם באופן תפוקה גבוהה.

Split-יוביקוויטין ממברנה שמרים בהתבסס שני היברידי (מיתוס) מערכת: כלי רב עוצמה עבור זיהוי חלבונים אינטראקציות

אנחנו צריכים לשנות את השמרים קונבנציונאלי שני היברידית ההקרנה, כלי גנטי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון. שינוי זה ניכר מקצרת את התהליך, מפחית את עומס העבודה, והכי חשוב, מפחיתה את מספר תוצאות חיוביות שגויות. בנוסף, גישה זו היא לשחזור ואמין.

השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin

סרטון זה מדגים את הבדיקה הדו-היברידית של שמרים כדי לזהות אינטראקציות עצמיות ספציפיות של חלבונים. בבדיקה זו, החלבון המעניין מתויג לשני תחומים של גורם שעתוק המקודד את האנזים β-גלקטוזידאז. כאשר שני החלבונים מתקשרים זה עם זה, הדבר גורם לשעתוק ולתרגום ליצירת האנזים, אשר מזוהה לאחר מכן באמצעות בדיקה ביוכימית.

בדיקת שמרים דו-היברידית לקביעת הקשר העצמי של חלבונים בתאי שמרים

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת השמרים ההיברידית האחת, אשר מזהה חלבונים מרובים המקיימים אינטראקציה עם דנ"א המטרה. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה מכילים את רצף דנ"א המטרה במעלה הזרם של הגן המדווח. בנוסף, הם מבטאים חלבונים של פקטור שעתוק. כאשר החלבונים יוצרים קומפלקסים ונקשרים לדנ"א המטרה, הגן המדווח מתבטא וניתן לזהותו באופן אנזימטי.

בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Ketoconazole נקשר ולעוינות pregnane X קולטן הפעלה (PXR). מסכי תפוקת שמרים גבוהים של מוטציות PXR להגדיר אזור ייחודי לketoconazole מחייב. שיטה גנטית המבוסס על שמרים זה מגלה אינטראקציות רצפטור הגרעיני רומן עם ligands שמקשר עם אתרי פני השטח מחייבים.

הפוך מערכת דו היברידית שמרים לזהות יונקים הגרעיני קולטן שאריות כי אינטראקציה עם ligands ו / או יריבים

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

חלבונים מפעיל בקטריאלי חשובים לקביעת זיהומים מוצלחים. פרוטוקול זה מתאר את זיהוי ניסיוני של שותפים מחייבים חלבוניים של חלבון מפעיל חיידקים המארחים הצמח הטבעי שלה. זיהוי אינטראקציות מפעיל אלה באמצעות השנייה היברידי מסכי שמרים הפך לכלי חשוב נפרם אסטרטגיות פתוגניות מולקולריות.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז'ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

אנו מציגים את פרוטוקול מסך משתיק קול פשוט בהתכה שמרים. שיטה זו היא יעילה ללא מוטגן, סלקטיבי מוטציות מתרחשות לעיתים קרובות באתר גנומית יחיד.  הפרוטוקול מתאים לבידוד מדכאי על פגמים צמיחה בתרבות נוזלי שנגרמות על ידי מוטציה או תרופה.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

כאן, נציג של שמרים משופר אחד-היברידית הקרנת פרוטוקול כדי לזהות את גורמי שעתוק (TFs) ניתן לאגד לאזור ה-DNA האנושי של עניין. שיטה זו משתמשת צינור ההקרנה תפוקה גבוהה אשר ניתן לחקור את הכריכה של &gt; 1,000 TFs בניסוי יחיד.

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

למדו לבודד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית לחקר מנגנוני ויסות מחזור התא באיקריוטים. שיטה זו מאפשרת הבנת אינטראקציות חלבונים קריטיות לשכפול DNA וליציבות תורשתית.

בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית

גלה סרטונים נוספים