Name: ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: חקור מנגנוני הדבקה של Shigella בתאי אפיתל באמצעות מבחני זיהום אינ-ויטרו. השיטה מאפשרת לחקור הידבקות, פלישה והתרבות תוך-תאית לפיתוח טיפולים יעילים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

התמיכה במחברים כוללת את המחלקה לרפואת ילדים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, פרס הוועד המנהל למימון תמיכה זמנית במחקר (ISF) לשנת 2022A009041, מענק המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות R21AI146405, והמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות מענק תזונה במרכז המחקר להשמנת יתר בהרווארד (NORCH) 2P30DK040561-26. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתב היד.

פרוטוקולים לניתוח זיהום שיגלה בתאי אפיתל המעי הגס

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

פרוטוקול זה מתאר סדרה של שלוש בדיקות סטנדרטיות לחקר היצמדות לשיגלה, פלישה ושכפול תוך-תאי של תאי אפיתל במעי. למרות ששיטות אלה הן בסך הכל גרסאות מותאמות של מבחני גנטמיצין קלאסיים המשמשים לחקר הפלישה והשכפול התוך-תאי של פתוגנים חיידקיים שונים בתוך תאי המאכסן49,50,51, יש ליישם שיקולים מיוחדים בעת חקר שיגלה.
Shigella הם anaerobes facultative, אשר לגדול בצורה אופטימלית ב 37 ° C בינוני עשיר עם אוורור43. בעת ביצוע בדיקות אלה כדי לחקור את ההשפעות של אותות סביבתיים שונים או מטבוליטים על זיהומי שיגלה, מומלץ לגדל שיגלה במדיה עשירה במשך הלילה, ולאחר מכן תת-תרבית למדיה מוגדרת או משלימה לשלב אמצע היומן לפני ההדבקה. ביטוי גן אלים מקסימלי מתרחש בשלב הלוגריתמי של הצמיחה52,53. לפיכך, תרביות משנה של תרביות שיגלה בן לילה ומתן אפשרות לצמיחת חיידקים לשלב מעריכי (OD600 ~ 0.7) הם צעדים הכרחיים כדי להעריך כראוי את אלימות השיגלה. יתר על כן, ביטוי גנים אלימים הוא תלוי טמפרטורה. כדי להבטיח ביטוי ספציפי רק במהלך זיהום המאכסן, גנים אלימים מושרים בטמפרטורות פיזיולוגיות של המארח (37 מעלות צלזיוס) ומדוכאים בקפדנות בטמפרטורות נמוכות יותר (למשל, 30 מעלות צלזיוס)54. כדי להבטיח ביטוי של גנים אלימים, subculturing חיידקים וזיהומים חייב להתבצע ב 37 ° C, עם טיפול נאות כדי להבטיח את הטמפרטורה לא יורד מתחת 37 ° C. פלסמיד אלים גדול, 220 קילו-בסיס, המקודד את המנגנון המולקולרי הדרוש לפלישה ולזיהום תאי אפיתל, הוא גורם מכריע אלים חיוני לכל Shigella spp5. מעברים חוזרים ונשנים וצמיחה ממושכת ב 37 ° C מקדמים חוסר יציבות פלסמיד אלים, וכתוצאה מכך אובדן פלסמיד והפיכת תאי Shigella לאלימים55. כדי להבטיח תחזוקת פלסמיד אלים וביטוי גנים אלימים חיוניים, מומלץ להחזיר חיידקים ישירות ממלאי המקפיא כל שבועיים ללוחות חיווי אדומים טריים TSB + קונגו. ניתן להשתמש באגר אדום של קונגו כדי להבדיל בין מושבות ארסיות מסוג בר (אדום, CR+) לבין מושבות ארסיות (לבנות, CR-) שאיבדו את פלסמיד האלים45. אם אי יציבות פלסמיד אלים נצפתה שוב ושוב, תרביות לילה של שיגלה ניתן לדגור ב 30 ° C כדי למנוע אובדן פלסמיד אלים, ואחריו subculturing ב 37 ° C כדי לקדם ביטוי גנים virulence43. לבסוף, אם מבוצעים ניתוחים עם מוטנטים ו/או זנים משלימים, בהם קיימים סמנים אנטיביוטיים בזני חיידקים אלה, מומלץ להשתמש בבחירת אנטיביוטיקה מתאימה במהלך שלבי הלילה והתת-תרבית של החיידקים.
לשימוש בחד-שכבות אפיתל HT-29 יתרונות רבים לחקר המנגנונים המולקולריים של פתוגנזה של שיגלה במבחנה. מכיוון ששיגלה הוא פתוגן מותאם לאדם, מודלים של בעלי חיים קטנים אינם משקפים במדויק את הפתוגנזה האופיינית של שיגלוזיס שנצפתה בבני אדם36. לפיכך, השימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים להדבקה של קווי תאים שמקורם בבני אדם מאפשר חקירה כמותית של שלבים בודדים של פתוגנזה חיידקית כדי לאפיין את יחסי הגומלין המולקולריים בין פתוגן זה לבין המארח הטבעי שלו. מבחינה היסטורית, תאי HeLa שימשו בעיקר לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה 25,56,57. עם זאת, תאי HeLa הם קו תאי סרטן צוואר הרחם אימורטלי, שהם תאים מארחים שאינם ילידים עבור פתוגנים חיידקיים אנטריים. לפיכך, מחקרי מבחנה של פתוגנזה אנטרית עברו לשימוש בקווי תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס (למשל, HT-29, Caco-2 ו- T84), אשר משחזרים בצורה נאמנה יותר את מורפולוגיה אפיתל המעי, וניתן לגדל אותם על טרנסוולים כמונושכבות אפיתל עם משטחים אפיקליים ובזולטרליים ממוינים 58,59,60. למרות שלכל קו תאים יש את נקודות החוזק והחולשה האינדיבידואליות שלו, תאי HT-29 משמשים בבדיקות המתוארות כאן בשל דמיון פנוטיפי לאנטרוציטים במעי וביטוי חזק של קולטני פני השטח של התא וציטוקינים מעודדי דלקת 58,59,61. עם זאת, כל אחד מהמודלים הנדונים הללו הם קווי תאים שמקורם בסרטן עם פנוטיפים מטבוליים וצמיחה חריגים שאינם מייצגים במדויק את המצב הפיזיולוגי הטבעי של אפיתל המעי הגס in vivo58. ההתקדמות האחרונה בטכניקות תרביות רקמה אנושיות אפשרה גידול של תאי גזע אנושיים במעי, המתקבלים מביופסיות רקמה, לאורגנואידים או חד-שכבות תאים דו-ממדיות בודדות המשחזרות את סוגי התאים השונים הקיימים במערכת העיכול האנושית (GI) 62,63,64. ניתן להתמיין בין אורגנואידי מעיים כך שיכללו אנטרוציטים, תאי גביע מייצרי ריר, תאי M וסוגי תאים ספציפיים אחרים לרקמות. מחקרים אחרונים אישרו את השימוש במודלים אורגנואידים אלה לחקר פתוגנים אנטריים, כולל פתוגנים שונים של Shigella spp., Salmonella enterica ו- Escherichia coli pathovars 62,63,64. אף על פי שאורגנואידים הם מודלים מדויקים יותר של אפיתל מערכת העיכול האנושי וניתן אפילו לגדל אותם בתרבית בתנאים תזונתיים מגוונים כדי לייצג את אוכלוסיית העולם65, מורכבותם היחסית דורשת הכשרה משמעותית ומומחיות טכנית, וכתוצאה מכך עלויות גבוהות יותר וזמני גידול ארוכים יותר בהשוואה לקווי תאים סרטניים מסורתיים58.
פרוטוקול זה מתאר שיטות תפוקה בינונית, לפיהן שני לוחות 6 בארות משמשים בסך הכל 12 מונו-שכבות הזמינות לבדיקה. עם זאת, ניתן בקלות להגדיל את הניסויים כדי להגדיל את מספר החד-שכבות שנזרעו כדי להכיל שכפולים טכניים נוספים, או לבחון מוטציות נוספות של שיגלה ואותות סביבתיים. ניתן להשתמש גם בצלחות תרבית רקמה עם יותר בארות (למשל, צלחות של 12 בארות או 24 בארות) עם התאמות מתאימות כדי להסביר בארות בקטרים קטנים יותר. בתנאי הגידול של HT-29 המתוארים בשלב 3.2, טיטרים HT-29 מספיקים לזריעת כשישה לוחות 6 בארות לאחר גידול מבקבוק T75 אחד, עם מספיק תאים שנותרו כדי לשמור על תרבית התאים HT-29. יתר על כן, זריעת חד-שכבות HT-29 והכנת שלבי חיסון חיידקים זהים בין היצמדות חיידקים, פלישה ומבחני שכפול תוך-תאיים. לפיכך, בדיקות הבודקות את אותם זני שיגלה או תנאי תת-גידול יכולות להתבצע בקלות במקביל כדי לבחון בו זמנית את תפקידו של כל תנאי ניסוי בשלבים שונים של זיהום שיגלה .
טיטרים להתאוששות עבור דבק (שלב 4), פלישה (שלב 5), וחיידקים תוך תאיים (שלב 6) נקבעים על ידי ציפוי דילול סדרתי של תאי HT-29 נגועים לאחר ליזה, המאפשר הערכה כמותית של היעילות של כל שלב של זיהום Shigella. שלבי הצנטריפוגה במבחני הפלישה והשכפול התוך-תאי, המבוססים על בדיקות קלאסיות 49,50,51, מקדמים מגע חיידקי עם התאים המארחים לפלישה מיידית ומשפרים את שיעורי הפלישה. כך, הצנטריפוגה "מדלגת" על שלב ההיצמדות, שהתגלה מאוחר יותר כהיבט חשוב של זיהום שיגלה 17,18,19,66. חשוב לציין כי שלב הצנטריפוגה אינו יכול להתבצע עם תאי אפיתל מקוטבים שנזרעו על טרנסוולים. עם זאת, עבור בדיקת ההיצמדות, ההיצמדות אינה מאולצת על ידי צנטריפוגה, ולא מוסיפים גנטמיצין לתאי HT-29 הנגועים לפני הליזה, ובכך מאפשרים ספירה של תאי חיידקים דבקים. נפח תרבית הרקמה מצטמצם ל-1 מ"ל (לעומת 2 מ"ל במבחני הפלישה והשכפול התוך-תאי) כדי לאפשר מגע יעיל יותר של החיידקים עם תאי HT-29. יתר על כן, בהתאם לקצב ההיענות, פלישה מסוימת ושכפול תוך תאי יכולים להתרחש במהלך הדגירה של 3 שעות, אך הכמות היא בדרך כלל זניחה (למשל, רק 0.05% מאוכלוסיית החיידקים שהתאוששו לאחר ליזה של התא המארח). עם זאת, כדי להסביר כראוי חיידקים דבקים לעומת תוך תאיים במהלך הדגירה של 3 שעות, מומלץ לבצע בדיקות מקבילות, שבהן, בנוסף לפרוטוקול המוצהר, צלחת שנייה מודגרת עם 50 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין ב 2 מ"ל DMEM לכל באר במשך 45 דקות בסך הכל (15 דקות דגירה, שטיפה, DMEM טרי + gentamycin במשך 30 דקות) כדי ליזה ביסודיות חיידקים תאיים. לאחר ליזה תאי HT-29 כפי שצוין בפרוטוקול, ניתן למנות את החיידקים התוך תאיים כפי שצוין לעיל, והם מייצגים את מספר החיידקים שפלשו. לאחר מכן ניתן להפחית ערך זה מהחיידקים שנמנו מהצלחת ללא טיפול בגנטמיצין כדי לקבוע כראוי חיידקים דבקים ופולשים. ניתוחים מקבילים יכולים להתבצע גם כדי לתת תובנה נוספת לגבי השכפול התוך-תאי של Shigella בתוך תאי HT-29 לאחר פלישה, למשל, שימוש בנקודות זמן מרובות לביצוע עקומות גדילה תוך-תאיות. לבסוף, יחד עם ספירת חיידקים תוך-תאיים לאחר דגירה של 18 שעות של גנטמיצין, ניתן לאסוף ולנתח את הסופרנאטנטים של התרבית להפרשת ציטוקינים של תאי HT-29 נגועים. לדוגמה, IL-8 הוא כימוקין המופרש על ידי תאי אפיתל ומתפקד בעיקר כדי לגייס PMN לאתר הזיהום. ניתן לנתח את כמות IL-8 המופרשת לתרבית של תאי HT-29 נגועים באמצעות בדיקת IL-8 ELISA67.
מלחי מרה הוכיחו את עצמם כאות אלים חשוב עבור שיגלה במהלך המעבר דרך מערכת העיכול האנושית, וניתן להשתמש בהם כדי להשלים את מצע צמיחת החיידקים בפרוטוקולים אלה כדי לשכפל מצבים אופייניים במערכת העיכול. באופן טבעי, מלחי מרה מוצגים בתריסריון או בחלק העליון של המעי הדק כדי לסייע בעיכול; ובאילאום הסופי או בקצה המעי הדק, 95% ממלחי המרה מוסרים וממוחזרים חזרה למחזור הדם להפקדה הסופית בכיס המרה68. במלחי המרה יש בדרך כלל ריכוז בין 0.2%-2.0% (w/v) במעי הדק והם קוטלי חיידקים באופן טבעי. עם זאת, שיגלה, יחד עם רוב החיידקים האנטריים, מתנגדים למלחי מרה ומשתמשים באותות כדי להגביר את הזיהום47. מספר מחקרים תיעדו כיצד חשיפה למלחי מרה, לעיתים בשילוב עם אותות מעי דקים אחרים כמו גלוקוז, משפיעה על הישרדות שיגלה ועל ויסות האלימות לפני ההדבקה. הוכח כי שיגלה מתנגדת למלחי מרה, משנה ביטוי גנים, יוצרת ומפזרת ביופילם בתנאים המשחזרים מעבר במעי דק17,69. המחקרים הראו כי שינויים אלה גורמים לפנוטיפ היפר-אלים, שבו היצמדות ופלישה מושרות עם זיהום המעי הגס הבא על ידי Shigella 17,18,19,48,66. לפיכך, התנאים המתוארים לעיל מתעדים כיצד לתרבית שיגלה במלחי מרה כדי לחקות מעבר במעי הדק לפני ביצוע בדיקות ההיצמדות, הפלישה או השכפול התוך-תאי. נוסחת TSB שצוינה מכילה תוספת גלוקוז ביחס למרק לוריא טיפוסי (LB)17. לכן, אם LB משמש, חשוב גם להשלים את התקשורת עם גלוקוז (0.5%-2.0% [w / v]) כדי לשקול כראוי את אותות הגלוקוז במעי הדק17. יתר על כן, כפי שהוזכר לעיל, כל תת-תרבויות השיגלה נשטפות כדי להסיר מלחי מרה ולחקות את המעבר למעי הגס לצורך ניתוח זיהומים.
באופן מסורתי, וכפי שמודגש בתוצאות לעיל (איור 1 ואיור 2), בדיקות זיהום הן בעלות ערך כדי לקבוע את התפקיד של גן מסוים בזיהום Shigella. הפנוטיפ של מוטנטים שונים, עם זאת, לא יכול להיות מוערך באמת ללא תוספת נאותה של מדיה תרבית חיידקים. כפי שהוכיחו מחקרים קודמים, מלחי מרה משנים באופן משמעותי את ביטוי הגן S. flexneri, כולל גנים לחילוף חומרים מרכזי, גורמי שעתוק, מובילי סוכר, עמידות לתרופות וגנים אלימים המקודדים על הכרומוזום או פלסמיד אלים17. גנים אלה מספקים תובנה כיצד Shigella משתמשת במלחי מרה כאות לשינוי ביטוי גנים והכנה לזיהום בסופו של דבר של המעי הגס, ולכן ניתוח מוטציות לאחר מכן צריך להתבצע במצע הגידול החיידקי המשלים המתאים לפני בחינת ההשפעות על אלימות בבדיקות ההיצמדות, הפלישה והשכפול התוך-תאי. כפי שניתן לראות למעלה באיור 1 ובאיור 2, מוטציית ΔVF לא השפיעה על היצמדות, אלא כן השפיעה על פלישה ושכפול תוך-תאי. מכיוון שהמוטציה הגבירה את הפלישה ואת השכפול התוך-תאי, נערכים כעת ניסויים כדי לקבוע כיצד תוצר הגן מווסת את הזיהום. הניתוחים המוטנטיים משמשים דוגמה לאופן שבו ניתן לחקור הבנות חדשות בפתוגנזה של שיגלה, במיוחד בתנאים שמשכפלים טוב יותר את מערכת העיכול האנושית. מומלץ לבצע ניתוחי השלמה נכונים כדי לאמת את הפנוטיפים של מוטנטים שונים.
בשילוב, נהלים אלה מתארים ניסויים כמותיים שיספקו תובנה חשובה לגבי המנגנונים המולקולריים של היצמדות, פלישה ושכפול של תאי אפיתל המעי הגס HT-29 על ידי חיקוי הטוב ביותר של הסביבה הטבעית של מערכת העיכול האנושית במהלך זיהום. מחקרים עתידיים יכולים להרחיב על המוטנטים ותנאי הניסוי כדי להשיג הבנה טובה יותר של האופן שבו שיגלה מתכוננת ומדביקה ביעילות פונדקאים אנושיים. למרות עשרות שנים של מחקר, יש עוד כל כך הרבה מה לגלות על זיהום Shigella.

מחלות שלשול הנגרמות על ידי פתוגנים חיידקיים אנטריים מהוות נטל בריאותי עולמי משמעותי. בשנת 2016, מחלות שלשול היו אחראיות ל -1.3 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם והיו סיבת המוות הרביעית בשכיחותה בקרב ילדים מתחת לגיל חמש שנים של 1,2. הפתוגן החיידקי הגראם-שלילי, האנטרי, שיגלה, הוא הגורם הסיבתי לשיגלוזיס, גורם עיקרי למוות משלשולים ברחבי העולם3. שיגלוזיס גורם לתחלואה ותמותה משמעותית מדי שנה בילדים ממדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית 4,5, בעוד זיהומים במדינות בעלות הכנסה גבוהה קשורים להתפרצויות מעונות יום, מזון ומים 6,7,8,9. פיתוח חיסונים לא יעיל10 ועלייה בשיעורי עמידות מיקרוביאלית (AMR)11,12 סיבכו את הניהול של התפרצויות שיגלה בקנה מידה גדול. נתונים עדכניים של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן מראים כי כמעט 46% מזיהומי שיגלה בארצות הברית הפגינו עמידות לתרופות בשנת 202013,14, בעוד ארגון הבריאות העולמי הכריז על שיגלה כפתוגן בעדיפות AMR שעבורו יש צורך דחוף בטיפולים חדשים15.
זיהומי שיגלה מועברים בקלות דרך מסלול הצואה-דרך הפה עם בליעת מזון או מים מזוהמים, או באמצעות מגע ישיר עם בני אדם. שיגלה התפתחה להיות פתוגן יעיל המותאם לבני אדם, עם מינון מדבק של 10-100 חיידקים המספיקים כדי לגרום למחלה16. במהלך מעבר במעי הדק, שיגלה חשופה לאותות סביבתיים, כגון טמפרטורה גבוהה ומרה17. זיהוי אותות אלה גורם לשינויי שעתוק לבטא גורמי אלימות המשפרים את יכולתם של החיידקים להדביק את המעי הגס האנושי 17,18,19. שיגלה אינה פולשת לאפיתל המעי הגס מפני השטח האפיקאליים, אלא עוברת דרך שכבת האפיתל בעקבות ספיגה לתאי מיקרופולד מיוחדים מציגי אנטיגן (תאי M) בתוך אפיתל 20,21,22 הקשור לזקיק. לאחר טרנסציטוזה, תאי שיגלה עוברים פאגוציטוזה על ידי מקרופאגים תושבים. שיגלה בורח במהירות מהפאגוזום וגורם למוות של תאי מקרופאגים, וכתוצאה מכך משחררים ציטוקינים מעודדי דלקת 5,23,24. שיגלה פולש אז לתאי אפיתל המעי הגס מהצד הבזולטרלי, ממקם את הוואקול המקרופינוציטי, ומבסס נישה משוכפלת בציטופלסמה 5,25. ציטוקינים מעודדי דלקת, במיוחד אינטרלוקין-8 (IL-8), מגייסים לויקוציטים נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים (PMNs) לאתר הזיהום, מה שמחליש צמתים הדוקים אפיתל, ומאפשר חדירה חיידקית של רירית האפיתל כדי להחמיר זיהום בזולטרלי5. PMNs להרוס את רירית אפיתל נגוע כדי להכיל את הזיהום, וכתוצאה מכך הסימפטומים האופייניים של דיזנטריה חיידקית (דמית)5. למרות שמנגנוני הפלישה והשכפול התוך-תאי אופיינו ביסודיות, מחקר חדש מדגים מושגים חדשים חשובים בזיהום שיגלה, כולל ויסות אלימות במהלך מעבר במערכת העיכול (GI)17, היצמדות19, שיפור הגישה הבזולטרלית דרך חדירות מחסום26, והובלה א-סימפטומטית בילדים הסובלים מתת-תזונה27.
היכולת של Shigella spp. לגרום למחלות שלשול מוגבלת לבני אדם ולפרימטים לא אנושיים (NHP)28. מודלים של זיהום מעיים Shigella פותחו עבור דגי זברה29, עכברים30, שרקנים31, ארנבים 21,32,33 וחזירים 34,35. עם זאת, אף אחת ממערכות מודל אלה אינה יכולה לשכפל במדויק את מאפייני המחלה שנצפו במהלך זיהום אנושי36. למרות שמודלים NHP של שיגלוזיס הוקמו כדי לחקור את הפתוגנזה של שיגלה, מערכות מודל אלה יקרות ליישום ודורשות מינונים זיהומיים גבוהים באופן מלאכותי, עד תשעה סדרי גודל גבוהים יותר מהמינון המדבק של בני אדם 37,38,39,40,41,42. לפיכך, ההתאמה יוצאת הדופן של שיגלה להדבקה של פונדקאים אנושיים מחייבת שימוש בתרביות תאים שמקורן בבני אדם כדי ליצור מחדש מודלים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית לחקירה מדויקת של פתוגנזה של שיגלה.
כאן, מתוארים נהלים מפורטים כדי למדוד את שיעורי ההיצמדות של Shigella , פלישה ושכפול בתוך תאי אפיתל המעי הגס HT-29. באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים אלה, ניתן לחקור את המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם גנים של אלימות חיידקית ואותות סביבתיים משפיעים על כל שלב של זיהום שיגלה כדי להבין טוב יותר את יחסי הגומלין הדינמיים בין המארח לפתוגן.

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu; מסנן m PES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCGP00525</td><td>מסנן פוליאתרסולפון סטרילי לעיקור עד 50 מ"ל מדיה</td></tr><tr><td>14 מ"ל צינורות תרבית</td><td>קורנינג</td><td></td><td>352059 17 מ"מ x 100 מ"מ מבחנות פוליפרופילן עם מכסה</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>קורנינג</td><td>430829</td><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה תחתונה חרוטית שקופה מפוליפרופילן עם מכסה חסין דליפות</td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3516</td><td>הצלחות מטופלות לחיבור תאים אופטימלי</td></tr><tr><td>מלחי מרה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8756</td><td>יחס 1:1 של כולאט לדאוקסיכולט</td></tr><tr><td>צבע אדום קונגו</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C6277</td><td>צבע דיאזו אניוני מבוסס בנזידין, טוהר של >85%</td></tr><tr><td>שקופית תא ספירת תאים רוזנת</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>לשימוש עם מונה התאים האוטומטי של הרוזנת</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>A מגיב אורגני קוטבי מאוד</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>DMEM מתווסף עם גלוקוז גבוה, נתרן פירובט, GlutaMAX ופנול</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי אדום (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr>ריכוז מלאי<td>ג'נטמיצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632</td> מנוטרל בחום <td>הוא 50 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>HT-29 קו תאים</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>אדנוקרצינומה; המעי הגס ב מקור</td></tr><tr><td>סרט פרפין</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td>סרט איטום מעבדה</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>100 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרי למדיה מוצקה</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>ריכוז 1x; pH 7.4</td></tr><tr><td>בחר אגר</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td>תערובת של פוליסכרידים המופקים מדפנות תאי אצות אדומות לייצור אמצעי ציפוי חיידקים</td></tr><tr><td>צלוחיות T75</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>צלוחיות תרבית רקמות</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td> חומר <td>פעילי שטח ומתחלב לא יוני נפוץ&nbsp;</td></tr><tr><td>כתם כחול Trypan</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>צבע לזיהוי תאי תרבית רקמות מתות; רק תאים חיים יכולים להוציא את הצבע</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>מגיב לדיסוציאציה של תאים לתחזוקת קו התאים ומעבר</td></tr><tr><td>מרק סויה טריפטי (TSB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907</td><td>מצע גידול חיידקים</td></tr></tbody></table>

ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

הפתוגן החיידקי האנטרי המותאם לבני אדם שיגלה גורם למיליוני זיהומים מדי שנה, יוצר השפעות גדילה ארוכות טווח בקרב ילדים ומהווה גורם מוביל למוות משלשולים ברחבי העולם. זיהום גורם לשלשול מימי או דמי כתוצאה מכך שהפתוגן עובר במערכת העיכול ומדביק את תאי האפיתל המצפים את המעי הגס. עם עלייה מדהימה בעמידות לאנטיביוטיקה והמחסור הנוכחי בחיסונים מאושרים, פרוטוקולי מחקר סטנדרטיים הם קריטיים לחקר הפתוגן האימתני הזה. כאן מוצגות מתודולוגיות לבחינת הפתוגנזה המולקולרית של שיגלה באמצעות אנליזות חוץ גופיות של היצמדות חיידקים, פלישה ושכפול תוך-תאי בתאי אפיתל המעי הגס. לפני ניתוח הזיהום, פנוטיפ האלימות של מושבות שיגלה אומת על ידי ספיגת הצבע האדום של קונגו על לוחות אגר. ניתן לשקול גם שימוש בחומרי מעבדה מוספים במהלך תרבית חיידקים כדי לחקות בתנאי in vivo . תאי חיידקים משמשים לאחר מכן בפרוטוקול סטנדרטי כדי להדביק תאי אפיתל המעי הגס בלוחיות תרבית רקמה בריבוי מבוסס של זיהום עם התאמות לנתח כל שלב של זיהום. לצורך בדיקות היצמדות, תאי שיגלה מודגרים עם רמות מדיה מופחתות כדי לקדם מגע חיידקי עם תאי אפיתל. הן עבור פלישה והן עבור מבחני שכפול תוך תאי, גנטמיצין מיושם בפרקי זמן שונים כדי לחסל חיידקים חוץ-תאיים ולאפשר הערכה של פלישה ו / או כימות של שיעורי שכפול תוך תאי. כל פרוטוקולי ההדבקה מונים חיידקים דבקים, פלשו ו / או תוך תאיים על ידי דילול סדרתי של תאי אפיתל נגועים וציפוי יחידות יוצרות מושבת חיידקים ביחס לטיטרים מדביקים על לוחות אגר אדומים בקונגו. יחד, פרוטוקולים אלה מאפשרים אפיון עצמאי והשוואות עבור כל שלב של זיהום Shigella של תאי אפיתל כדי לחקור פתוגן זה בהצלחה.

בדיקות היצמדות, פלישה ושכפול תוך-תאי בוצעו בהשוואה בין S. flexneri 2457T wild type (WT) ל-S. flexneri ΔVF (ΔVF), מוטנט ששיערו כי הוא מווסת באופן שלילי את אלימות Shigella. מכיוון ששיגלה משתמשת במלחי מרה כאות לוויסות אלימות 17,18,47, ניסויים בוצעו לאחר תת-תרבית חיידקית במדיה TSB וכן TSB בתוספת 0.4% (w/v) מלחי מרה 18. חשיפה למלחי מרה במהלך שלב תת-התרבית פועלת כטיפול מקדים לשכפול מעבר המעי הדק לפני זיהום המעי הגס 17,18,47. איור 1 מנתח את ההשפעה של מוטציית ΔVF על היכולת של S. flexneri להיצמד לתאי אפיתל המעי הגס HT-29. אחוזי ההיצמדות משורטטים על ציר ה-y ומייצגים את היחס בין חיידקים שהתאוששו לאחר ליזה HT-29 המתוקננת למספר חיידקי הקלט. כצפוי, שני הזנים S. flexneri WT ו-ΔVF היו בעלי עלייה משמעותית בהיענות כאשר קיבלו תוסף מלחי מרה בתת-תרבית בהשוואה ל-TSB ללא תוספת מלחי מרה18. עם זאת, לא היה הבדל בהיצמדות לתאי HT-29 בין הזנים המוטנטיים WT ו-ΔVF בכל תת-תרבית. נתונים אלה מצביעים על כך שלמוטציה ב-ΔVF אין השפעה על יכולתו של S. flexneri להיצמד לתאי אפיתל HT-29 עם או בלי מלחי המרה לפני הטיפול.
באיור 2 נותחה ההשפעה של מוטציית ΔVF על היכולת של S. flexneri לפלוש (איור 2A) ולשכפל (איור 2B) בתוך תאי אפיתל המעי הגס HT-29 עם או בלי מלחי מרה לפני הטיפול. אחוזי ההתאוששות משורטטים על ציר ה-y ומייצגים את היחס בין תאי חיידקים שהתאוששו לאחר ליזה של תאי HT-29 המתוקננים למספר חיידקי הקלט. באיור 2A, הייתה צפויה עלייה משמעותית ביכולת של WT S. flexneri 2457T לפלוש לתאי HT-29 לאחר חשיפה מוקדמת למלחי מרה48, בעוד שהמוטציה S. flexneri ΔVF הראתה עלייה קטנה יותר בפלישה בעקבות חשיפה מוקדמת למלחי מרה בהשוואה לזן WT. למוטנט ΔVF היו שיעורי פלישה מוגברים של תאי HT-29 בהשוואה לתת-תרבית WT ב-TSB, אולם שיעורי הפלישה שלהם היו דומים לאלה של WT כאשר הם תורבתו ב-TSB בתוספת מלחי מרה (איור 2A). תוצאות אלה מצביעות על כך שהמוטציה ב-ΔVF משפרת את היכולת של S. flexneri לפלוש לתאי HT-29, מה שמפחית את ההשפעה של מלחי המרה לפני החשיפה, למרות שיכולת הפלישה של מוטציית ΔVF אכן גדלה עוד יותר בעקבות תת-תרבית מלחי מרה.
בסך הכול, פי 10 יותר חיידקים נמצאו לאחר דגירה לילית (איור 2B) בהשוואה לדגרה של 90 דקות (איור 2A), מה שמדגים את ההבדלים בניטור גדילה תוך-תאית לעומת פלישה, בהתאמה. כאשר תאי HT-29 נגועים הודגרו במשך 18 שעות כדי לאפשר שכפול תוך-תאי של החיידקים (איור 2B), ההשפעה של מלחי המרה לפני הטיפול פחתה הן עבור הזנים WT והן עבור זני ΔVF . עם זאת, ההשפעה המופחתת של מלחי מרה לפני הטיפול במהלך שכפול תוך תאי הייתה דרמטית יותר עבור מוטציית ΔVF . מאחר שהעלייה בשכפול התוך-תאי של שני הזנים כאשר נחשפו מראש למלחי מרה הייתה קטנה יותר מהעלייה בשיעורי הפלישה באותם תנאים, אנו משערים כי למלחי מרה יש השפעה גדולה יותר על השלבים המוקדמים בפתוגנזה של S. flexneri . מוטציית ΔVF הראתה עלייה באחוזי ההתאוששות משכפול לילה בתוך תאי HT-29 בהשוואה ל-WT (איור 2B) לאחר שני תנאי תת-התרבית. עם זאת, אחוזי ההתאוששות של מוטציית ΔVF היו דומים ללא קשר למלחי המרה לפני החשיפה. מגמות הנתונים האלה מצביעות על כך שהמוטציה של ΔVF משתכפלת ביעילות רבה יותר בתוך תאי HT-29 בהשוואה ל-WT, ושמלחי מרה לפני החשיפה אינם משפיעים על היכולת של מוטנט ΔVF להשתכפל תוך תאי, כפי שנצפה עבור WT (איור 2B). מאחר שההבדל בין הזנים המוטנטיים וזני ה-WT בתנאי טרום החשיפה של מלחי המרה לא נצפה במהלך בדיקת הפלישה שנמשכה 90 דקות, אנו משערים כי המוצר המקודד על ידי הגן VF שנמחק עשוי גם לווסת את שכפול S. flexneri בתוך תאי HT-29. יחד, שני הניתוחים מראים כי מוטנט ΔVF הוא אלים יותר ביחס ל- WT, מה שמרמז על כך שתוצר הגן VF הוא וסת שלילי של אלימות S. flexneri .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig01.jpg"> איור 1: מלחי מרה לפני חשיפה גרמו להיצמדות של S. flexneri לתאי HT-29. S. flexneri 2457T WT ו-ΔVF מוטנטים עברו תרבית בתת-תרבית ב-TSB או ב-TSB בתוספת 0.4% (w/v) מלחי מרה (TSB+BS). לאחר מכן החיידקים הוחלו על תאי HT-29 בריבוי זיהומים (MOI) של 100 והודגרו במשך 3 שעות כדי לבחון את ההיענות. לאחר הדגירה, תאי HT-29 נגועים נשטפו ועברו ליזה, ודילול סדרתי של חיידקים שהחלימו צופה כדי למנות יחידות יוצרות מושבה לכל מ"ל (CFU/mL). מספר החיידקים הדבקים משורטט ביחס לטיטר חיידקי הקלט כדי לקבוע את אחוז ההיענות. הנתונים מייצגים שכפול ביולוגי אחד עם שלושה שכפולים טכניים (נקודות בודדות). קווי שגיאה מציינים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). מובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי מבחן t של סטודנט (*p &lt; 0.05; ***p &lt; 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig02.jpg"> איור 2: מלחי מרה לפני החשיפה הגבירו את הפלישה ל-WT S. flexneri ואת השכפול התוך-תאי. תאים מוטנטיים מסוג S. flexneri 2457T WT ו-ΔVF עברו תת-תרבית ב-TSB או ב-TSB בתוספת מלחי מרה (TSB+BS). לאחר מכן החיידקים הוחלו על תאי HT-29 ב-MOI של 100, עברו צנטריפוגה על התאים והודגרו בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 במשך 45 דקות. תאים נשטפו עם PBS, וחיידקים חוץ-תאיים עברו ליזה על ידי תוספת של גנטמיצין ל-DMEM כדי לשחזר באופן בלעדי חיידקים תוך-תאיים. לאחר דגירות של 90 דקות (A, פלישת חיידקים) או 18 שעות (B, שכפול תוך-תאי), תאי HT-29 נגועים נשטפו ועברו ליזה, ודילול סדרתי של חיידקים שנמצאו צופה כדי למנות יחידות יוצרות מושבה לכל מ"ל (CFU/mL). מספר החיידקים התוך-תאיים משורטט ביחס לטיטרים החיידקיים הקלטים כדי לקבוע את אחוזי ההתאוששות. הנתונים מייצגים שכפול ביולוגי אחד, שלכל אחד מהם שלושה שכפולים טכניים (נקודות בודדות). קווי שגיאה מציינים SEM. מובהקות סטטיסטית נקבעה על ידי מבחן t של סטודנט (*p &lt; 0.05). שימו לב להבדלים בסקאלות ציר y בין לוחות (A) ו-(B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקות זיהום כדי לחקור היצמדות לשיגלה , פלישה ושכפול תוך תאי באמצעות קווי תאי אפיתל במבחנה .

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

שיגלה הוא פתוגן עולמי משמעותי הגורם לשיעורי זיהום הרסניים מדי שנה. שיגלה מדביקה את מערכת העיכול וגורמת לשלשולים או דיזנטריה. המחקר שלנו נועד לשפר את ההבנה שלנו לגבי זיהומים כדי לעזור לפתח טיפולים יעילים יותר כמו חיסונים ומוצרים אנטי-מיקרוביאליים אחרים.ראשית, מודלים של בעלי חיים וטכניקות מתפתחות של תרביות רקמה מאפשרים לנו להבין טוב יותר את הפיזיולוגיה של זיהום שיגלה ולשחזר נאמנה את המורכבות של מערכת העיכול האנושית. שנית, אפיון של מבודדי שיגלה קליניים סייע ללכוד את המגוון של סוג זה, לזהות גנים אלימים חשובים ולשפר את הבנתנו את הזיהום. השתמשנו באותות במערכת העיכול כמו מלחי מרה וגלוקוז כדי להבין כיצד שיגלה שורדת מעבר במעי הדק ומווסתת ביטוי גנים אלימים לזיהום במעי הגס.הדגמנו כיצד Shigella מתנגדת למלחי מרה והראינו כי Shigella מייצרת חלבוני דבקות כדי לעזור ליזום מגע עם תאי אפיתל כדי להתחיל זיהום. פרוטוקולים אלה נועדו לבחון היבטים מרכזיים של זיהום אפיתל כמו היענות, פלישה והישרדות תוך תאית של שיגלה. אנו מבצעים פרוטוקולים אלה באמצעות קו תאי אפיתל סטנדרטי, אך גם התאמנו את השיטות למודלים מתוחכמים של מערכת העיכול האנושית הזמינים כיום.פרוטוקולים אלה לוקחים בחשבון כל שלב של זיהום בנפרד, וזה קריטי כדי להבין את השלבים העיקריים בזיהום Shigella. הם גם מדגישים כי ניתוחים משולבים יכולים להקל על הבנה טובה יותר של זיהום Shigella ברמה הוליסטית.

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: וונאש, פ. ואח', ניתוח אימונופלואורסצנציה של יצירת גרנולות לחץ לאחר אתגר חיידקי של תאי יונקים. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את זיהום תאי האפיתל בחיידק הפתוגני Shigella flexneri ואת תגובת התאים המארחת שנוצרת. חלבוני אפקטור חיידקיים משבשים את תרגום המארח, וגורמים להיווצרות אברונים חסרי ממברנה הנקראים גרגירי מאמצים, המשקפים את תגובת התא האדפטיבית לזיהום.

יצירת גרגירי לחץ במהלך זיהום שיגלה בתאי אפיתל סרטניים

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

סרטון זה מדגים טכניקה לזיהוי תגובה מקומית ועולמית של יוני סידן בעת זיהום שיגלה בתאי אפיתל אנושיים. שיגלה פולשת לתאים המארחים ומשחררת גורמי פלישה, המשפיעים על רמות הסידן התוך-תאי. המשרעת והתדירות של הסידן הציטוסולי המקומי והעולמי נחקרים באמצעות אינדיקטור פלואורסצנטי.

טכניקת הדמיה לחקר תגובת הסידן בתאים נגועים בחיידקים

אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך...

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

כדי לנטרל את הפצת הפתוגן, תאי מארח לארגן מחדש את שלד התא שלהם למדר חיידקים ולגרום autophagy. זיהום Shigella שימוש של תאי רקמת תרבות, מארח וגורמי הפתוגן שבבסיס תהליך זה זוהה ואופיין. תוך שימוש במודלי דג הזברה של זיהום Shigella, התפקיד של מולקולות ומנגנונים גילו נחקרים in vivo.

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להמחיש תגובות סידן (Ca2 +) שהפיק הלה תאים נגועים על ידי שיגלה. על ידי אופטימיזציה של הפרמטרים של זיהום חיידקי, הדמיה עם Ca2 + רגשים פלורסנט, מאופיינים טיפוסיות גלובאליים ומקומיים Ca2 + אותות הנגרמת על ידי חיידקים על פני מגוון רחב של קינטיקה זיהום.

הדמיה Ca2 + תגובות במהלך זיהום שיגלה תאי אפיתל

בתאי האפיתל M זקיק הקשורים התמחה כיסוי טלאים של Peyer לשחק תפקיד חשוב עבור immunosurveillance הרירית ברקמת המעי הקשורים הלימפה. כאן אנו תיאר את שיטת הערכה transcytosis חיידקי ידי תאים...

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

עוברי דג הזברה שקוף הוכיחו המארחים מודל שימושי כדי לחזות אינטראקציות למידה תפקודית בין תאים חיסוניים מולדים פתוגנים חיידקיים תאיים,...

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

אנו מתארים את הבידוד המהיר של תאים ראשוניים Murine סוג II (אפיתל מכתשיים AECII) על ידי סלקציה שלילית זרימת cytometric. AECII אלה להראות כדאיות וטוהר גבוה ומתאימים למגוון רחב של מחקרים מולקולריים פונקציונליים ובנוגע לתפקידם בתנאי נשימה כגון מחלות אוטואימוניות או זיהומיות.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

הדבקת בני אדם על ידי Entamoeba histolytica מובילה לamoebiasis, גורם עיקרי לשלשולים בארצות טרופיות. זיהום הוא ביוזמת אינטראקציות הפתוגן עם תאי אפיתל במעי, מעורר הפתיחה של אנשי קשר תאי תאים וכתוצאה מכך שלשולים, לפעמים אחריו דלקת בכבד. מאמר זה מספק מודל כדי להעריך את האינטראקציות בין המאכסן לפתוגן מוקדם כדי לשפר את ההבנה של הפתוגנזה amoebiasis שלנו.

ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em&gt; Histolytica Entamoeba</em&gt; זיהום

חקור מנגנוני הדבקה של Shigella בתאי אפיתל באמצעות מבחני זיהום אינ-ויטרו. השיטה מאפשרת לחקור הידבקות, פלישה והתרבות תוך-תאית לפיתוח טיפולים יעילים.

ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה

גלה סרטונים נוספים