Name: טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: חקור שימוש בטומוגרפיית שני-פוטון סדרתית לאיתור חיידקי Salmonella ברקמות מודבקות בעכברים. שיטה זו מאפשרת הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות בין פתוגנים לתאי חיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע 310030_156818, 310030_182315 ו-NCCR_ 180541 AntiResist (ל-DB).

מעקב אחר פתוגן של איברים שלמים באמצעות כימות כתב פלואורסצנטי

<ol><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+understanding+the+infectious+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The importance of understanding the infectious microenvironment.</a> Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).</li>
<li>Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogeography+of+infection+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biogeography of infection revisited.</a> Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).</li>
<li>Bumann, D., Cunrath, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Salmonella-host+interactions+in+infected+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues.</a> Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).</li>
<li>Hofmann, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+-+putting+immune+cells+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context.</a> J Cell Sci. 134 (15), jcs258494(2021).</li>
<li>Blain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tridimensional+atlas+of+the+developing+human+head%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tridimensional atlas of the developing human head.</a> Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).</li>
<li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+maps+reveal+stereotyped+cell-type-based+cortical+architecture+and+subcortical+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism.</a> Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).</li>
<li>Matho, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+glutamatergic+neuron+system+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex.</a> Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).</li>
<li>Muñoz-Castañeda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+anatomy+of+the+mouse+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex.</a> Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+compartmentalization+enables+Salmonella+persistence+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118(2021).</li>
<li>Dogga, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aspartyl+protease+5+in+the+establishment+of+the+intracellular+niche+during+acute+and+chronic+infection+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii.</a> Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).</li>
<li>Claudi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+of+Salmonella+in+host+tissues+delays+eradication+by+antimicrobial+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy.</a> Cell. 158 (4), 722-733 (2014).</li>
<li>Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hue-shifted+monomeric+variants+of+Clavularia+cyan+fluorescent+protein%3A+identification+of+the+molecular+determinants+of+color+and+applications+in+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging.</a> BMC Biol. 6, 13(2008).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Burton, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparate+impact+of+oxidative+host+defenses+determines+the+fate+of+Salmonella+during+systemic+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host%26Microbe%22%5BJournal%5D)">Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice.</a> Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+afferent+connections+of+the+main+and+the+accessory+olfactory+bulb+formations+in+the+rat%3A+an+experimental+HRP-study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study.</a> J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Wendland, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+GFP+levels+for+analyzing+Salmonella+gene+expression+during+an+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection.</a> FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).</li>
<li>Barat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+intracellular+Salmonella+depends+on+surface-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens.</a> PLoS Pathog. 8 (10), e1002966(2012).</li>
<li>Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+selection+based+on+expression+levels+during+infection+facilitates+vaccine+development+for+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).</li>
<li>Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27UTR+sequences+influence+protein+levels+in+Escherichia+coli+by+regulating+translation+initiation+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability.</a> Front Microbiol. 13, 1088941(2022).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
<li>Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Salmonella+gene+expression+in+an+infected+mammalian+host+using+the+green+fluorescent+protein+and+two-colour+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry.</a> Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).</li>
<li>Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+Asd%2B+expression-cloning+vector%3A+stable+maintenance+and+high+level+expression+of+cloned+genes+in+a+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22vaccine+strain%22%5BJournal%5D)">Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella.</a> vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ההקשר הרקמתי המקומי של פתוגנים חיידקיים חיוני לקביעת התקפות מארח מקומיות, התאמות חיידקיות, התוצאה המקומית של אינטראקציות הפתוגן המארח וכימותרפיה מיקרוביאלית, והתרומה האישית לתוצאה הכוללת של המחלה. הדמיה של חיידקים בגודל מיקרומטר באיברים בגודל סנטימטרים הייתה מאתגרת. טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STP) מספקת רזולוציה מרחבית מספקת כדי לזהות תאי חיידקים בודדים באיברים שלמים, חתך והדמיה אוטומטיים, ותפוקה מספקת (~ איבר אחד ליום)11. בעוד אנטיגנים מארח יכול להיות מוכתם in vivo, תאים פתוגניים צריכים לבטא חלבונים פלואורסצנטיים מתאימים כדי להבטיח זיהוי מקיף של תאים פתוגניים תאיים. מערכי הנתונים המתקבלים (0.5-1.5 טרה-בייט לכל איבר) מציבים אתגרים משמעותיים בפני תשתיות IT לניתוח ואחסון נתונים.
ישנם מספר שלבים קריטיים בשיטה זו. ראשית, נדרש זן פתוגן עם ביטוי ניתן לזיהוי והומוגנית של חלבון פלואורסצנטי GFP או YFP. באופן אידיאלי, קלטת ביטוי כרומוזומלית25 משמשת כדי למזער הטרוגניות פלואורסצנטית עקב וריאציה של מספר העתק פלסמיד. נדרשת עוצמה פלואורסצנטית מספקת, אך יש להימנע מרמות מוגזמות של חלבון פלואורסצנטי כדי למנוע ליקויי כושר של הפתוגן23. ניתן לקבל רמות ביטוי מתאימות על ידי בחירת מקדם מתאים וכוונון עדין של אתר הקישור הריבוזומלי25 או כל האזור הלא מתורגם (UTR) 5' 26. שנית, קיבוע הזלוף צריך לכלול שטיפה ראשונית עם חיץ כדי להסיר כמה שיותר אריתרוציטים ממחזור הדם. זה קריטי במיוחד עבור הטחול והכבד (אם כי הסרה מלאה של אריתרוציטים מאיברים אלה קשה). אריתרוציטים נותרים בולעים אור בחלק הנראה של הספקטרום ופוגעים באיכות ההדמיה27. שלישית, אחסון הרקמות הקבועות בהגנה הקפויה הוא קריטי להפחתת הפלואורסצנטיות של הרקמות, שהיא גבוהה במיוחד ברקמות דלקתיות ויכולה להאפיל על הפלואורסצנטיות החלשה יחסית של תאי הפתוגן11. רביעית, הקישור הצולבות היעיל של הרקמה לגוש האגרוז שמסביב הוא קריטי לחיתוך ויברטומי חלק מבלי שהרקמה תקפוץ החוצה מגוש האגרוז. חמישית, אותות פלואורסצנטיים וזיהויים כתאי פתוגן חייבים להיות מאומתים באופן עצמאי באמצעות גישות אורתוגונליות כגון צביעה בנוגדנים לרכיבים פתוגניים (כגון ליפופוליסכריד לחיידקים גראם-שליליים) ומיקרוסקופ קונפוקלי של המקטעים שנשלפו מטומוגרף11. חלק מהרקמות הנגועות מכילות חלקיקים פלואורסצנטיים אוטומטיים בעלי צורה דומה וספקטרום פלואורסצנטי חופף שניתן לפרש בקלות בטעות כתאי פתוגן. שישית, יש להשוות את כמות התאים הפתוגניים בתוך מיקרו-מושבות לגישות אורתוגונליות כגון מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להעריך את הדיוק. יש לאמת את העומסים החיידקיים הכוללים המבוססים על חישובים אלה בהשוואה לגישות אורתוגונליות כגון ציטומטריית זרימה וציפוי.
שינויים חשובים בפרוטוקול STP הנמצא בשימוש נרחב כוללים הצבת מסנן פס צר 510/20 ננומטר לפני מכפיל אור 211, כדי להפחית את ההפרעה של אוטופלואורסנציה ירוקה-צהובה החזקה במיוחד בכבד, בטחול ובמדבקות פייר נגועות ומודלקות. האוטופלואורסצנטיות החזקה ופיזור האור המוגבר של איברים כאלה בהשוואה למוח (השולט ביישומים אחרים של STP) יוצרים גם צורך בתיקון יעיל יותר להארה לא אחידה. כשינוי נוסף, פרוטוקול זה משתמש בגישת CIDRE22 למטרה זו (איור 3) ופילוח מבוסס בינה מלאכותית של חיידקים. לבסוף, עיבוד מקדים של רקמות השתנה על ידי הכללת שלב הדגירה בהגנה קריופרוטקטורית ב -20 °C אשר מפחית את autofluorescence רקמות ובכך מקל על זיהוי של תאים פתוגניים קטנים עם פלואורסצנטיות חלשה יחסית11.
פתרון בעיות עשוי להיות נחוץ אם לא ניתן לזהות אותות פתוגנים, או שסגמנטציה מניבה רגישות לא מספקת (יותר מדי תאי פתוגן מתפספסים) או דיוק לא מספיק (יותר מדי חלקיקי רקע מפולחים כתאי פתוגן). אם ניתן לזהות אוטופלואורסצנטיות של רקמת הרקע אך יש מעט מדי אותות פתוגנים, הפתוגנים עשויים להכיל כמויות לא מספיקות של חלבונים פלואורסצנטיים. ניתן לבדוק זאת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של חלקי רקמה מאותה רקמה נגועה או ציטומטריית זרימה של הומוגנטים ברקמה19,28. סיבות בסיסיות יכולות להיות רמות ביטוי לא מספיקות או חוסר יציבות של קלטת הביטוי. אסטרטגיות הפחתה יכולות לכלול מקדמים חלופיים להנעת ביטוי, התאמת קודון של הגנים המקודדים את החלבון הפלואורסצנטי עבור מיני הפתוגנים, שימוש במבנים אפיזומליים עם מספר העתקים גבוה יותר, או ייצוב קלטות ביטוי על ידי אינטגרציה כרומוזומלית או השלמה מאוזנת-קטלנית29. הבחירה בחלבון פלואורסצנטי חשובה גם היא, אך זיהוי אפשרי באמצעות GFP.mut2, mWasabi, YPet ו-TIMERbac. אם הסגמנטציה אינה מדויקת, הדבר עלול להיגרם על ידי פלואורסצנטיות פתוגן חלשה מדי שניתן לטפל בה כמתואר לעיל, או רקע אוטופלואורסצנטי גבוה מדי ברקמות. זילוח נרחב של תמיסת שטיפה או דגירה ממושכת במאגר האחסון מיד לפני ההטבעה בבלוק האגרוז ובטומוגרפיה עשויים לפתור בעיות אלה. לבסוף, נדרש אימון מספיק של הרשת העצבית לסיווג מדויק, אך אימון מוגזם עלול להוביל להתאמת יתר הפוגעת בביצועים של דגימות חדשות.
כיום, אין שיטה אחרת שיכולה לצלם איברים שלמים ברזולוציה מרחבית מספקת בתלת-ממד לאיתור חיידקים בודדים. שיפורים עתידיים בניקוי רקמות ומיקרוסקופ יריעות אור עשויים להשיג רזולוציה דומה. זה עשוי לאפשר הדמיה במהירות גבוהה יותר ועם יותר תעלות פלואורסצנטיות.
מגבלה חשובה של STP היא רזולוציית הפיקסלים במישור של ~0.5 מיקרומטר ורזולוציה אנכית של 5 עד 10 מיקרומטר, שאינה מספיקה לפתרון חיידקים הממוקמים קרוב, למשל, בתוך מיקרו-מושבה צפופה. עם זאת, ניתן לאחזר קטעי רקמות לאחר טומוגרפיה עבור מיקרוסקופ קונפוקלי משני ברזולוציה גבוהה של חלקי רקמה נבחרים. מגבלה נוספת של STP היא זמינותם של שלושה תעלות פלואורסצנטיות בלבד, המגבילות את מספר הפלואורופורים שניתן לצלם בו זמנית. שוב, ניתוח משני של קטעי רקמה שאוחזרו בשיטות ריבוב יכול לחשוף את המיקום והעוצמה של סמנים רבים נוספים עבור חלקי רקמה נבחרים. מידע זה יכול להיות משולב במבנה התלת-ממדי הכולל של הרקמה הסובבת כפי שנקבע באמצעות STP.
לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר חקירות מפורטות של אינטראקציות מארח-פתוגן ברמה המקומית וברמת האיבר כולו. הפרוטוקול צריך להיות ניתן להתאמה בקלות לפתוגנים אחרים (בתנאי שניתן להשיג אותם כזנים פלואורסצנטיים), איברים אחרים ומינים מארחים שונים.

זיהומים מתרחשים ברקמות עם אנטומיה מורכבת ופיזיולוגיה ממודרת. המיקרו-סביבות המגוונות המתקיימות יחד ברקמה הנגועה יכולות לקבוע את גורלן של תת-קבוצות פתוגנים מקומיות ואת תרומתן לתוצאה הכוללת של המחלה 1,2,3. עם זאת, מיפוי תלת-ממדי מקיף של פתוגנים מיקרוביאליים ברקמות בגודל ס"מ נותר מאתגר4. הדמיה של המוח ואיברים אחרים היא תחום מחקר פעיל מאוד עם שיפור מתמיד של אסטרטגיות ניסוי5, אך שיטות רבות עדיין חסרות את הרזולוציה תת-מיקרומטר שתידרש כדי לזהות פתוגנים חיידקיים בגודל מיקרומטר בביטחון. לעומת זאת, טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STP)6 מאפשרת הדמיה אוטומטית מרובת צבעים ונטולת עיוותים של רקמות שלמות ברזולוציה תת-מיקרומטרית במישור, ומניבה מערכי נתונים נפחיים מלאים. שיטה זו משלבת חתך פיזי חוזר ונשנה של הרקמה באמצעות ויברטום, עם הדמיה לסירוגין של שני פוטונים של פני הבלוק המתהווים עם אור אינפרא אדום. טומוגרפיית STP נמצאת בשימוש נרחב למיפוי אקסונים דקים במוח כדי ליצור מפות קישוריות 7,8,9,10.
טומוגרפיית STP מאפשרת גם מיפוי תלת ממדי של תאי פתוגן מיקרוביאליים בודדים (סלמונלה, טוקסופלסמה) בכל הרקמות הנגועות11,12 באמצעות טומוגרף. הדור השני-הרמוני חושף את מעטה הקולגן סביב העורקים וברצועות סיביות כגון טרבקולה של הטחול, ובכך מספק הקשר אנטומי. ניתן להשתמש בנוגדנים פלואורסצנטיים מוזרקים In vivo כדי להכתים תאים מארחים ולחשוף אינטראקציות בין תאי פתוגן בודדים לבין תאים חיסוניים חודרים כגון נויטרופילים. כאן מתואר הצינור הכולל עיבוד הרקמה, הדמיה, תפירה של אריחי הדמיה עם תיקון תאורה, ערימה של תמונות בתלת מימד וסגמנטציה באמצעות כלי למידת מכונה. צינור זה מניב מיקומים תלת-ממדיים של פתוגנים, תאים ומיקרו-מושבות בודדים בהקשר המארח שלהם. ספירת מספר התאים הבודדים בתוך מיקרו-מושבות נותרה קשה בגלל מגבלות רזולוציה, אך ניתן להעריך מספרים כאלה בהתבסס על הבהירות המשולבת של המיקרו-מושבה. ניתן להתאים את הצינור בקלות למודלים אחרים של זיהום אם פתוגנים מבטאי GFP או YFP רקומביננטיים זמינים.

<table><tbody><tr><td><חזק>כימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגרוז נמס נמוך</td><td></td><td>רוט Art. 6351.5 25 גרם</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>6768-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>דבק מיידי לוקטיט 435</td><td>הנקל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>פולי (אתילן גליקול)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5413-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>פוליוויניל פירולידון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן בורוהידריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>71321-25 גרם</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Merck</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פריודאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>311448-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>71640-250 גרם</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בייסי דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן טטרבוראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>221732-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered מלח (TBS)</td><td>Merck</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>ואקום סינון 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>להב</td><td>קמפדן מכשירים בע"מ&nbsp;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAI</td><td>ספקטרום לייזר-פיזיקה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לקלף תבנית פלסטיק</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>TissueCyte 1000 טומוגרפיה</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן/צבעים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><<tr><td>חזק>ראשוני נוגדנים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי-LPS סלמונלה, ארנב</td><td>סיפין</td><td>REF TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD169-PE, שיבוט 3D6.112</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>142403 anti-Ly-6G-PE, שיבוט 1A8</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>127608</td><td></td></tr><tr><td><חזק>נוגדנים משניים</חזק></td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עוף נגד ארנב Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>החברה</td><td>גרסת</td><td></td></tr><tr><td>החברה Fiji</td><td>Image</td><td>J 1.54g ואילך</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2017b/2018b ואילך</td><td></td></tr><tr><td>Orchestrator (טומוגרפיה)</td>תוכנת <td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visualization Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0 ואילך</td><td></td></tr></tbody></table>

טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

רוב הזיהומים מתרחשים בתוך רקמות מארח תלת מימדיות עם אנטומיה מורכבת ופיזיולוגיה מקומית משתנה של המארח. מיקומם של תאי פתוגן בסביבה מגוונת זו משפיע באופן משמעותי על רמות הלחץ שלהם, תגובותיהם, גורלם ותרומתם להתקדמות הכוללת של המחלה ולכישלון הטיפול. עם זאת, בשל הקשיים הטכניים באיתור תאי פתוגן בגודל מיקרומטר בתוך איברים מארחים בגודל ס"מ, תחום מחקר זה כמעט ולא נחקר. כאן אנו מציגים שיטה להתמודדות עם אתגר זה. אנו משתמשים בטומוגרפיה סדרתית של שני פוטונים ובניתוח תמונה משופר באמצעות בינה מלאכותית כדי לאתר תאי סלמונלה בודדים בכל הטחול, אונות הכבד ובלוטות הלימפה השלמות של עכברים נגועים. באמצעות כתבים פלואורסצנטיים ומתן נוגדנים in vivo , ניתן לקבוע את קצב השכפול של תאי סלמונלה בודדים, את האינטראקציה המקומית שלהם עם תאי חיסון ספציפיים ואת תגובות החיידקים לאנטיביוטיקה. מתודולוגיות אלו פותחות אפיקים לבחינה מקיפה של זיהומים, מניעתם והטיפול בהם בהקשר התלת-ממדי של הרקמה.

ההליך המתואר מאפשר זיהוי של תאי סלמונלה בודדים באיברי עכבר שלמים כגון טחול, כבד, בלוטות לימפה מזנטריות ומדבקות פייר11 (איור 5 ואיור 6). הוא גם מזהה טפילי Toxoplasma gondii במוח העכבר12. חלק מהרקמות הנגועות, כולל כבד, מדבקות פייר וטחול, פולטות אוטופלואורסצנטיות משמעותית בטווח הירוק-צהוב. Autofluorescence משופר עוד יותר על ידי קיבוע עם paraformaldehyde, אשר יש צורך לשמר את מבנה הרקמה. זיהוי פלואורסצנטיות ירוקה מ-GFP, mWasabi והרכיב הירוק שלTIMER bac על רקע אוטופלואורסצנטי זה משופר על ידי הצבת מסנן פס פס צר 510/20 ננומטר (המשדר את רוב פליטות ה-GFP אך חוסם חלק גדול מהספקטרום האוטופלואורסצנטי) לפני מכפיל אור 2 (האוסף פליטות ירוקות) ועל ידי הפחתת אוטופלואורסצנטיות רקמות על ידי אחסון רקמות קבועות למשך 3 ימים או יותר בהגנה קריואורסנטית11. עם זאת, חיידקים עדיין צריכים לבטא לפחות כמה אלפי עותקים לכל תא של GFP או חלבונים פלואורסצנטיים אחרים. מצד שני, יש להימנע מרמות חלבון פלואורסצנטיות מוגזמות כדי למזער את עלויות הכושר שעלולות להוביל לאלימות מוחלשת23.
פילוח נכון של חיידקים פלואורסצנטיים ברקמות יכול להיות מאושר על ידי אימונוהיסטוכימיה של קטעי רקמה שאוחזרו לאחר הדמיה. באופן ספציפי, עצמים שמוכתמים בנוגדן לרכיבי פני השטח של חיידקים כמו ליפופוליסכריד יכולים להיות מיושרים עם התמונה הפלואורסצנטית שמתקבלת בטומוגרפיית STP (איור 5). חשוב לציין כי חלק מתאי הסלמונלה המוכתמים חסרים חלבונים פלואורסצנטיים ולכן ניתן לזהות פלואורסצנטיות הן במיקרוסקופ קונפוקלי והן בטומוגרפיה STP. תאים אלה הם סלמונלה שהומתו על ידי מערכת החיסון המארחת, כפי שמודגם על ידי תרביות מיון ציטומטרי של זרימה ותרביות גדילה מתאים ממוינים בודדים, כמו גם המתאם ההדוק בין מספר היחידות יוצרות המושבה על לוחות אגר לבין מספר תאי הסלמונלה הפלואורסצנטיים כפי שנקבע על ידי ציטומטריית זרימה24. בנוסף, אובדן פלסמיד יכול לגרום לתאים קיימא שאינם פלואורסצנטיים וזה צריך להיבדק על ידי ציפוי על מדיה עם וללא אנטיביוטיקה מתאימה המתאימה סמן הבחירה על פלסמיד. עבור פלסמידים שמקורם ב-pSC101, אובדן פלסמיד in vivo הוא נדיר19. עבור רוב קלטות הביטוי המשולבות כרומוזומלית כגון sifB::gfp המשמשות ב-11, אובדן הביטוי אינו ניתן לגילוי in vivo. אם הפילוח אינו עולה בקנה אחד עם נתוני האימונוהיסטוכימיה, יש לשנות את צינור הסגמנטציה.
הרזולוציה של טומוגרפיית STP אינה מספיקה כדי לפתור תאי חיידקים בודדים בתוך מיקרו-מושבות צפופות. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנטיות הכוללת של המיקרו-מושבה מאפשרת להעריך את מספר תאי הסלמונלה . זה דורש זן פלואורסצנטי עם רמות פלואורסצנטיות הומוגניות מאוד כגון סלמונלה sifB::gfp11. שילוב המספר המשוער של תאי סלמונלה עבור כל המיקרו-מושבות והתאים הבודדים מניב עומסי רקמה חיידקיים הכוללים עומסים התואמים שיטות חלופיות כגון ציפוי או ציטומטריית זרימה של הומוגנטים ברקמה11. ציטומטריית ציפוי וזרימה לא יכולה להיעשות ישירות מאותן רקמות מכיוון שהן צריכות להיות קבועות זילוח לטומוגרפיה STP. במקום זאת, הם צריכים להיעשות עם בעלי חיים נוספים שאינם קבועים. אם עומסי החיידקים החציוניים כפי שנקבעו על ידי הגישות השונות שונים ביותר מפי 3, הכדאיות של חיידקים פלואורסצנטיים עלולה להיפגע (במקרה של יחידות יוצרות מושבה נמוכות יותר) או שחיידקים מסוימים איבדו את מבנה המדווח הפלואורסצנטי (במקרה של יחידות יוצרות מושבה גבוהות יותר). ניסוי בקרה יידרש כדי לזהות את המקור לפערים כאלה.
טומוגרפיית STP מספקת לוקליזציה של תאי חיידקים בתוך המבנה התלת-ממדי של הרקמות הנגועות. האותות ההרמוניים השניים של קולגן מספקים ציוני דרך אנטומיים כגון עורקים וטרבקולה. נוסף על כך, תאים מארחים יכולים להיות מוכתמים in vivo על-ידי הזרקת נוגדן לסמנים לפני השטח לפני הזילוח (איור 5 ואיור 6). צביעה זו מספקת ציוני דרך נוספים לתאי רקמות ולמיקרו-סביבות ספציפיות, כולל מוקדי דלקת (סמנים תוך-תאיים ותאים מסוימים עם מחסומי דיפוזיה כגון מוך לבן טבורי או המוח אינם נגישים בקלות, מתאימים לצביעת in vivo זו). גישה זו חשפה את מוך הלבן הטבורי כתא רקמה המאפשר הישרדות ארוכת טווח של סלמונלה במהלך כימותרפיה מיקרוביאלית11.
לבסוף, סלמונלה המשוכפלת בקצב מתון או איטי ניתן לזהות ולמקם בתוך המבנה התלת-ממדי של רקמות באמצעות זנים המבטאים טיימרbac, מדווח תא בודד לקצב שכפול11,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg"> איור 1: הליך הדמיה של איברים שלמים באמצעות טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STP). (A-B) האיבר נקצר לאחר זילוח טרנסקרדיאלי ומאוחסן למשך הלילה ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-4°C. (C-E) האיבר מוטבע באגרוז מחומצן ומקושר צולב, ואז הרקמה נסרקת ונחתכת באמצעות טומוגרפיית STP. הפרוסות נאספות עבור אימונוהיסטוכימיה עוקבת. (פ-י) צינורות ניתוח חישוביים לכימות מספרי חיידקים, אישור חיידקים פלואורסצנטיים ושחזור תלת ממדי של מיקומי חיידקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg"> איור 2: מערך טומוגרפיה טורי של שני פוטונים (STP). (A) טומוגרף המשלב (B) הדמיה של 2 פוטונים עם (C) חתך אוטומטי של רקמות טוריות. (D) פרוסות רקמה שנאספו לצורך חקירות מעקב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg"> איור 3: תפירת אריחים ותיקוני תאורה. אריחים נתפרים ותאורה לא אחידה מתוקנת לשימוש בפיזור עוצמה מתוקן באמצעות מזעור אנרגיה מוסדר (CIDRE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg"> איור 4: סגמנטציה של סלמונלה המבטאת את החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) באמצעות מכונת וקטור תמיכה (SVM) ורשת עצבית קונבולוציונית (CNN). (A) תמונות מייצגות של אובייקטי GFP המפולחים לפי SVM (משמאל) ותמונות תואמות (מימין) עם אזורים המפולחים לפי SVM (סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר). (B) התפלגות ערכים מקובצים באשכולות אדום-ירוק-כחול (RGB) עבור האזורים המפולחים. (C) תמונות מייצגות של עצמים שאינם GFP שזוהו באופן שגוי על-ידי שרת אחסון וירטואלי כחיידקים (משמאל). CNN מבטל אותם בצדק כרקע (מימין, סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg"> איור 5: זיהוי סלמונלה המבטאת את החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) באמצעות טומוגרפיה ואישור על-ידי אימונוהיסטוכימיה. תמונות של אותו קטע שנרכשו על ידי טומוגרפיה (משמאל) או מיקרוסקופ קונפוקלי לאחר צביעה עם נוגדן סלמונלה lipopolysaccharide (מימין). נויטרופילים (באדום) הוכתמו על ידי הזרקת in vivo של נוגדן אנטי-Ly-6G שכותרתו PE לפני הזלוף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg"> איור 6: שחזור תלת-ממדי ולוקליזציה של סלמונלה בטחול עכבר נגוע. (A) שחזור תלת ממדי (3D) של פרוסת טחול בעובי 5 מ"מ ומוכתמת in vivo לפני זילוח עם נוגדן נגד CD169 (אדום). האות הכחול מייצג קולגן שזוהה על ידי הרמוניות שניות. (B) מישור אופטי אחד של ערימת התלת-ממד המוצג ב-(A). המיקומים של תאי סלמונלה או microcolonies מסומנים על ידי כוכבים. (C) שחזור תלת-ממדי של מיקומי סלמונלה (כוכבים) בכבד נגוע. העורקים נראים על סמך מעטה הקולגן שלהם (כחול). סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

במאמר זה אנו מתארים הליך המאפשר זיהוי כלל איברי של חיידקים פתוגניים במהלך ההדבקה וכימות של פעילות המדווח הפלואורסצנטי.

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

זיהומים חיידקיים הם איום גדול על בריאות האדם. עמידות מיקרוביאלית גוברת, וחיסונים עדיין חסרים למספר פתוגנים עיקריים. כדי לזהות דרכים חדשות לאסטרטגיות בקרה, אנו צריכים לדעת יותר על האופן שבו פתוגנים מגיבים למערכת החיסון של המאכסן, ולאנטיביוטיקה in vivo ברקמות הנגועות.חיידקים ששרדו יכולים לגרום להישנות אם אנטי-מיקרוביאלים לא מצליחים לחסל זיהום. באמצעות טומוגרפיה סדרתית, אנו מראים כי קדחת הטיפוס הגורמת לסלמונלה יכולה להימשך במהלך הטיפול בחלק מסוים של הטחול. הדלקת חלשה באזור זה, מה שמשבש את הסינרגיה הקריטית בין אנטיביוטיקה לדלקת לצורך פינוי יעיל.חיידקים הם עצמים בגודל מיקרומטרי. קשה למקם אובייקטים קטנים כאלה בהקשר הרקמתי שלהם. טומוגרפיה טורית של שני פוטונים יכולה לזהות חיידק אחד בודד באיברים בגודל סנטימטר, ולקבוע את קצב השכפול שלו.אנו יכולים גם לזהות תאים חיסוניים, כגון נויטרופילים, ולקבוע את הקשר המרחבי שלהם עם החיידקים. אנו חוקרים את הפעילות של אנטיביוטיקה בקטריוסטטית. אנטיביוטיקה זו יכולה לרפא זיהומים, אם כי הם יכולים רק לעכב צמיחת חיידקים מבלי להרוג את הפתוגן בפועל.אנו גם קובעים את התפשטות מוטנטים חיידקיים חסרי גורמי אלימות מסוימים, ואת ההשפעה של פגמים חיסוניים על זיהום וטיפול.

high-resolution-three-dimensional-whole-organ-tomography-microbial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Non-הרסני להדמיה נפח יכולה להיות מושגת רק על ידי טכניקות טומוגרפית, מתוכם היעילה ביותר היא טומוגרפיה רנטגן מיקרו ממוחשבת (CT).

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של Ex-Vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-CT

Lensfree טומוגרפיה אופטית היא טכניקה תלת מימדי מיקרוסקופיה המציע רזולוציה מרחבית של &lt;1 מיקרומטר × &lt;1 מיקרומטר × &lt;3 מיקרומטר ב X, Y ו-Z ממדים, בהתאמה, מעל נפח הדמיה גדול של 15-100...

Lensfree על שבב טומוגרפית מיקרוסקופית העסקת רב זווית תאורה פיקסל סופר רזולוציה

בשילוב הדמיה אופטית וμCT במודל של עכברים של זיהום שתל אורתופדים, ניצול זן מהונדס bioluminescent של Staphylococcus aureus, סיפק את היכולת noninvasively ואורכים כדי לפקח על הדינמיקה של זיהום החיידקים, כמו גם את התגובה הדלקתית המקבילה ושינויים אנטומיים ב עצם.

בשילוב<em&gt; בvivo</em&gt; אופטי וμCT הדמיה למעקב אחר זיהום, דלקת, ועצם אנטומיה בזיהום אורטופדיים שתל בעכברים

אנחנו פיתח פרוטוקולים ועוצב מנגנון מותאם אישית כדי לאפשר הטבעה של מילימטר-סולם דגימות. אנו מציגים מדגם הכנת נהלים תוך שימת דגש על הטמעת שרף אקרילי, פוליאימיד אבובים להשיג הנייח נוקשה, אחסון לטווח ארוך של דגימות לחקירה הרקמה תא ואדריכלות מורפולוגיה של...

נוקשה ההטמעה של קבוע, צבעונית, ככלל, דגימות מילימטר-סולם עבור היסטולוגיה ללא סעיף תלת-ממד על-ידי מיקרו-שחושב טומוגרפיה

פרוטוקול זה מסביר כיצד להכין ולטעון דגימות חיידקיים עבור הדמיה תלת ממדית חיה וכיצד לשחזר את הצורה תלת ממדית של E. coli מתמונות אלה.

הדמיה תלת ממדית של תאים חיידקיים לייצוגים סלולריים מדויקים ולוקליזציה של חלבון מדויק

את כל המבנה תלת-ממדי ואת התוכן התאי של אורגנואידים, כמו גם את הדמיון הפנוטיפיק שלהם לרקמות המקוריות ניתן ללכד באמצעות פרוטוקול הדמיה תלת-ממדי ברזולוציה של תא יחיד המתואר כאן. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של אורגנואידים המשתנים במקור, גודל וצורה.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

כאן, מוצג פרוטוקול המתאר את שלבי הכנת הדגימה ואיסוף הנתונים הנדרשים בטומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של cryo (SXT) כדי לדמות את מבנה האולטרה-מבנה של תאים שלמים שהשתמרו בקריו ברזולוציה של 25 ננומטר חצי גובה.

תיאור קרטוגרפי תלת-ממדי של התא על ידי טומוגרפיה של קרני רנטגן רכות של Cryo

טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.

הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב להדמיה ברזולוציה גבוהה, ללא תוויות ותלת מימד של אורגנואידים באמצעות הולוטומוגרפיה קוהרנטית נמוכה. פרוטוקול זה מפרט הכנת תרבית אורגנואידים, רכישת הדמיה וניתוח תמונה חישובי, המאפשר הדמיה בזמן אמת של דינמיקה מבנית ותגובות תרופות באורגנואידים חיים.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה וניתוח למידת מכונה ללא תוויות של אורגנואידים במעי באמצעות הולוטומוגרפיה בקוהרנטיות נמוכה

פרוטוקול וידאו זה ממחיש כיצד לבצע טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור סריקה של דגימות וירולוגיה. לקבלת תוצאות מיטביות, הדגימות מוכנות על ידי הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה לאחר מכן.

סריקת טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בווירולוגיה: הדמיה תלת מימדית של דגימות קפואות בלחץ גבוה, שהוחלפו בהקפאה

חקור שימוש בטומוגרפיית שני-פוטון סדרתית לאיתור חיידקי Salmonella ברקמות מודבקות בעכברים. שיטה זו מאפשרת הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות בין פתוגנים לתאי חיסון.

טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים

גלה סרטונים נוספים